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1.
甘蓝SRK的S域及SCR酵母表达载体的构建及其相互作用区段的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为了深入研究S位点受体激酶（SRK）和S位点富含半胱氨酸蛋白（SCR）甘蓝自交不亲和（self-incompatibility,SI）信号传导的雌雄决定因子的相互作用机制,以自交不亲和性高的结球甘蓝为材料,采用酵母双杂交体系,构建pGADT7-eSRKs和pGBKT7-SCRs重组载体,并分别转化到Y187和Y2HGold酵母中,通过SD/-Ade-His-Trp-Leu平板上菌落的形成,PCR以及x-α-gal显色反应鉴定转化到酵母中的两个重组质粒相互作用。结果表明,SRK S域的SRK1及SRK4分别与SCR2相互作用,且初步显示其相互作用区域为SRK第1个外显子的第16 ~ 421 bp的片段和SCR第1 876 ~ 2 068 bp的片段。这既为SRK-SCR相互作用提供了具体证据,也为甘蓝自交不亲和性分子机理的深入研究提供了新内容。 相似文献
2.
根据甘蓝自交不亲和性雌蕊决定因子SRK基因保守序列设计简并引物,克隆23份甘蓝自交不亲和系SRK基因并测序。利用NCBI数据库进行克隆序列的Blast比较以及序列之间的相似性分析,初步确定23份甘蓝自交不亲和系分属于SRK3、SRK7、SRK8、SRK16、SRK28、SRK36、SRK45、SRK46、SRK58、SRK68等10种S单倍型。其中有5份甘蓝自交不亲和系属于SRK36单倍型,占参试自交不亲和系的22%;SRK7、SRK16和SRK58单倍型均只有1份甘蓝自交不亲和系。进一步对不同自交不亲和系之间花期杂交后花粉萌发及花粉管伸长情况进行荧光显微观察,并对20个杂交组合的花期杂交亲和指数进行调查分析,结果表明根据SRK基因序列所确定的相同S单倍型自交不亲和系之间花期授粉表现为不亲和,花粉在柱头上萌发受阻,花期亲和指数低;而不同S单倍型自交不亲和系之间花期授粉表现高度亲和,花粉管伸入雌蕊正常,花期亲和指数高。表明基于SRK基因序列分析确定甘蓝自交不亲和系所属单倍型是一种简单而可靠的快速鉴定方法,有利于育种时有针对性地设计甘蓝自交不亲和系杂交组合配制,从而提高育种效率。 相似文献
3.
《园艺学报》2015,(11)
扩增了从甘蓝柱头蛋白质谱鉴定中获得的泛素蛋白BoSU03基因的编码序列。序列分析表明BoSU03与甘蓝泛素蛋白Bo1003815的核苷酸序列相似性最高,达98%,含有臂重复结构域,属于植物泛素蛋白家族。为探究BoSU03是否为自交不亲和S位点受体激酶(SRK)下游的互作蛋白,以SRK与ARC1相互作用为对照,利用GAL酵母双杂交系统对SRK与BoSU03进行了相互作用验证,结果表明,BoSRK/BoSU03的转化酵母在四缺平板SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/x-α-gal/25 mmol 3-AT上长势较好,显色较深,进一步检测发现BoSRK/BoSU03转化酵母的β-半乳糖苷酶活性值大于BoSRK/BoARCl转化酵母的活性值,这为进一步分析鉴定BoSU03是否参与SRK下游信号传导过程提供了依据。 相似文献
4.
M–位点受体激酶（MLPK）是甘蓝自交不亲和反应的正向调控关键元件,其参与自交不亲和反应的分子机制尚不明确。为了分离与MLPK相互作用的蛋白,在分析了MLPK功能域的基础上采用PCR技术扩增了MLPK激酶结构域编码序列（记为MLPKK）,通过体外定点突变技术构建了两种MLPK失活突变体（记为mlpk1和mlpk2）,然后以pET43.1a为载体构建了原核表达质粒pET43.1a-MLPKK、pET43.1a-mlpk1和pET43.1a-mlpk2,并进行了原核表达和纯化。纯化的融合蛋白pET43.1a-MLPKK、pET43.1a-mlpk1和pET43.1a-mlpk2分别与高度自交不亲和甘蓝‘A4’柱头总蛋白提取液进行孵育,孵育后利用融合蛋白序列中的6× His标签与Ni+结合的特性,钓取MLPK的互作蛋白,建立了分离MLPK互作蛋白的新方法。孵育产物经SDS-PAGE电泳显示,与两个突变体蛋白泳道对比,在pET43.1a-MLPKK与柱头总蛋白提取液孵育产物的泳道中成功获得了候选的与MLPK互作的蛋白条带,这为后续互作蛋白质谱鉴定以及功能解析提供了技术支持。 相似文献
5.
扩增了从甘蓝柱头蛋白质谱鉴定中获得的泛素蛋白BoSU03 基因的编码序列。序列分析表明
BoSU03 与甘蓝泛素蛋白Bol003815 的核苷酸序列相似性最高,达98%,含有臂重复结构域,属于植物泛
素蛋白家族。为探究BoSU03 是否为自交不亲和S 位点受体激酶（SRK）下游的互作蛋白,以SRK 与ARC1
相互作用为对照,利用GAL 酵母双杂交系统对SRK 与BoSU03 进行了相互作用验证,结果表明,
BoSRK/BoSU03 的转化酵母在四缺平板SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/x-α-gal/25 mmol 3-AT 上长势较好,显色较
深,进一步检测发现BoSRK/BoSU03 转化酵母的β–半乳糖苷酶活性值大于BoSRK/BoARC1 转化酵母的
活性值,这为进一步分析鉴定BoSU03 是否参与SRK 下游信号传导过程提供了依据。 相似文献
6.
eSRK（S位点受体激酶胞外域）、SCR/SP11（S位点富含半胱氨酸蛋白-S位点蛋白11）和THL1（类硫氧还蛋白）是甘蓝自交不亲和性信号传导过程重要的3个元件。利用PCR技术获得两种甘蓝SCR2（class-Ⅱ）、eSRK2（class-Ⅱ）、THL1、SRKJ（class-Ⅰ，SRK6激酶域）和eSRK28（class-Ⅰ）的编码序列，并分别构建以pGBKT7为载体的SCR2、THL1的重组诱饵质粒和以pGADT7为载体的eSRK2、eSRK28、SRKJ的重组猎物质粒。利用酵母双杂交系统验证eSRK2-SCR2、eSRK28-SCR2、SRKJ-THL1的相互作用。重组质粒在宿主细胞中未产生毒性及自激活作用，表明重组表达载体构建成功；组合Y2HGold〔pGBKT7-SCR2〕×Y187〔pGADT7-eSRK2〕在三缺平板（SD/-Trp-Leu-His/x-α-gal/AbA，TDO/x/A）上生长出蓝色克隆，激活了报告基因AUR1-C、MEL1、HIS3；组合Y2HGold〔pGBKT7-SCR2〕×Y187〔pGADT7-eSRK28〕能够在二缺平板（SD/-Trp-Leu）上生长，但在三缺平板上不生长，表明不同单倍型SRK-SCR可能不发生相互作用；组合Y187〔pGADT7-SRKJ〕×Y2HGold〔pGBKT7-THL1〕能够在四缺平板上生长，激活了4种报告基因（AUR1-C、MEL1、HIS3、ADE2）。相同的单倍型SRK与SCR之间能够相互作用，不同的单倍型之间不会发生相互作用；酵母中报告基因表达的数目和类型的差异反映了class-Ⅱ型内部的SCR-SRK和class-Ⅰ的SCR-SRK互作强度，Ⅰ型高于Ⅱ型；THL与SRK之间存在较高的互作强度。这为Ⅰ型和Ⅱ型不同的自交不亲和性表型所依赖的3个起始信号传导元件之间的识别程度差异提供了直接证据和新内容。 相似文献
7.
为了深入研究芥菜开花整合子SOC1基因的表达调控机制,利用染色体步移法从芥菜‘QJ’中克隆了SOC1编码区上游782 bp的启动子,并构建SOC1基因启动子的酵母表达载体pAbAi-SOC1,与蛋白表达载体pGADT7-FLC、pGADT7-SVP共转化酵母Y1HGold菌株。酵母单杂交表明：芥菜FLC和SVP蛋白均能与SOC1的启动子相互作用。进一步分析发现：SOC1启动子含3个CArG-box表达调控基序。分别亚克隆这3个基因片段（SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3）,并再次构建酵母重组质粒pAbAi-SOC1-1、pAbAi-SOC1-2和pAbAi-SOC1-3,与pGADT7-FLC、pGADT7-SVP分别融合到Y1HGold菌株。融合菌株均能在相应SD/-Leu/AbA培养基上生长,说明SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3都能被芥菜FLC、SVP蛋白识别并结合。再次构建SOC1-1、SOC1-2、SOC1-3的CArG-box删除突变体及A-T互换突变体,则均不能与FLC、SVP蛋白互作。由此说明：SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3的3个CArG-box基序确实能特异性识别FLC、SVP,发生DNA-蛋白相互作用。这为利用启动子调控SOC1基因的转录表达等深入研究奠定了理论基础。 相似文献
8.
结球甘蓝花粉钙调素基因的克隆与表达分析 总被引：1，自引：1，他引：0
根据芸薹属植物钙调素基因保守区域设计引物,采用同源克隆的方法从结球甘蓝自交不亲和系和自交系花粉中克隆得到一个钙调素开放阅读框cDNA 序列,该序列长450 bp,编码149 个氨基酸;编码蛋白不含跨膜区,无信号肽,具有4 个完整的EF-hand 结构域。构建了结球甘蓝花粉钙调素原核表达系统,钙调素基因及其3 个突变体在E. coli 中得到表达,均获得分子量约为16 kD 的可溶性融合蛋白,在EGTA 存在的条件下,各融合蛋白具有各自独特的凝胶迁移现象,活性检测表明甘蓝花粉钙调素活性依赖于钙离子。该基因在甘蓝自交不亲和系花粉萌发过程中表达量先上升后下降,在自交系中随花粉萌发增大而降低;在含有钙调素拮抗剂TFP 的培养基中,自交不亲和系和自交系花粉中钙调素基因表达量均受到抑制;在含有W-7 琼脂糖的培养基中无明显差异。 相似文献
9.
以不耐盐、不耐旱的大白菜自交系SY-14-06为试材,提取根部总RNA,反转录为c DNA。根据大白菜SRK2F基因设计引物,PCR扩增SRK2F基因CDS序列1044bp。SRK2F编码347个氨基酸,预测分子量为39.3k D,理论等电点为4.88。利用p EASY-E1原核表达载体构建原核表达质粒p EASY-E1-SRK2F,转化表达菌株Transetta(DE3),通过SDS-PAGE检测该蛋白的表达。经Smart-embl预测其具有丝/苏氨酸激酶特有结构域,位于第4~260位氨基酸处。经Clustal X2比对,其与拟南芥同源性最高。最后利用镍离子金属螯合亲和层析介质对该蛋白进行纯化,得到了纯化的融合蛋白。 相似文献
10.
MLPK(M–位点受体激酶)是芸薹属自交不亲和正向调控关键元件,其参与自交不亲和信号传导的分子机制尚不明确,同时自交不亲和下游信号元件也有待于进一步分离。为了探索分离MLPK互作蛋白的思路和方法,构建了不含核定位信号的MLPK短截蛋白(MLPK-T),并利用酵母双杂交检测到MLPK与臂重复蛋白1(ARC1)作用,通过全基因组鉴定分别获得了96个甘蓝、101个白菜、70个琴叶拟南芥和62个拟南芥PUB蛋白,其中含有臂重复序列的PUB蛋白共为127个。通过系统进化分析,筛选到8个含臂重复序列的甘蓝BoPUB蛋白,其8个基因全部在柱头内表达,且成功利用酵母双杂交检测到MLPK与3个含臂重复序列的BoPUB蛋白Bol008579、Bol016165和Bol023511相互作用。 相似文献
11.
《园艺学报》2021,(6)
在通过酵母双杂交文库获得了与钙响应蛋白BoSPx相互作用蛋白BoPID的基础上,对BoPID的编码基因进行了克隆、时空特异性表达分析及筛选与其互作的蛋白,以期为BoSPx通过BoPID参与自交不亲和性分子过程提供依据。结果表明,BoPID包含2个外显子和1个内含子,编码439个氨基酸。激酶磷酸化预测分析显示具有激酶活性;系统进化和共线性分析显示BoPID具有较强的植物种属特异性,与芜菁、拟南芥和甘蓝型油菜等十字花科植物聚类在一起,BoPID与AtPID在染色体水平上高度同源。组织特异性表达分析显示BoPID在柱头中的表达量高于花器官中的其他部位。荧光定量PCR分析表明BoPID在甘蓝柱头自花授粉15 min显著上调表达,而后下调表达。启动子元件分析发现BoPID含有ABA、IAA、脱落酸、茉莉酸、水杨酸和胁迫响应等多个应答元件。BoPID蛋白定位于细胞膜和细胞质中,可能是一种泊位于膜上并突触于胞质中的双栖蛋白。酵母双杂交和GST-Pulldown结果表明BoPID与BoCML12、BoCaM2、BoPIN1能够发生相互作用。BoPID可能是BoSPx与Bo CML12、BoCaM2之间相互作用的桥梁蛋白,共同通过生长素调节钙响应的方式参与了自交不亲和分子过程。 相似文献
12.
为阐明羽衣甘蓝自交不亲和信号传递因子ARC1与下游底物Exo70A1相互作用的结构域,利用酵母双杂交系统进行检测与分析。将羽衣甘蓝BoARC1、BoARC1-N端（1 ~ 279 aa,含有UND结构域）及BoARC1-C端（280 ~ 663 aa,含有U-box结构域和Arm repeat结构域）的序列分别构建到pGBKT7载体中,获得BD-ARC1、BD-ARC1-N和BD-ARC1-C重组质粒。将羽衣甘蓝BoExo70A1、BoExo70A1-Δ1（1 ~ 85 aa）、Exo70A1-Δ2（1 ~ 270 aa）及Exo70A1-Δ3（271 ~ 638 aa,含有Exo70结构域）的序列分别构建到pGADT7载体中,获得AD-Exo70A1、AD-Exo70A1-Δ1、AD-Exo70A1-Δ2和AD-Exo70A1-Δ3重组质粒。将获得的重组质粒分别共转化到酵母Y187菌株中,在双缺陷（-Leu-Trp）酵母培养基中培养与生长。β-gal显色检测结果表明,共转BD-ARC1-N/BoExo70A1-Δ1或BD-ARC1-N/BoExo70A1-Δ2的酵母在滤纸上显示蓝色,这说明BoARC1的N端与BoExo70A1的N端介导了两者的相互作用。 相似文献
13.
槲皮素对甘蓝自交不亲和性及SRK活性的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
对甘蓝自交不亲和系‘022E1’, ‘022A1’, ‘02259’开花前两周的花蕾进行不同浓度的槲皮素处理, 开花后自交。与花期对照相比, 3个自交不亲和系的亲和指数差异达到显著性水平, 其中以1 500 μmol·L - 1槲皮素溶液处理效果最佳, 在022E1系中其亲和指数由原来的0.03增至4.35, 完全转化为了自交亲和系。采集开花前1 d的花蕾切取柱头进行SRK活性测定, 结果表明, 槲皮素处理后可显著抑制甘蓝自交不亲和系柱头中SRK活性, 从而阻止了自交不亲和性的信号传导, 达到了克服甘蓝自交不亲和性的目的。 相似文献
14.
《园艺学报》2019,(11)
在克隆甘蓝BoMLPK编码序列过程中,获得BoMLPKf1/2编码序列和1个新的转录文本(命名为BoMLPKn1)。BoMLPKf1/2和BoMLPKn1的c DNA大小分别为1 215、1 233和1 257 bp,分别编码含404、410和418个氨基酸残基的多肽链。与BoMLPKf1/2相比,BoMLPKn1有两个插入序列,一个是在1 102～1 114 bp之间有12个碱基的插入,另一个是在1 152～1 182 bp之间有30个碱基的插入。BoMLPKf1/2定位在甘蓝3号染色体上,BoMLPKn1定位在4号染色体上。氨基酸序列比对发现,BoMLPKf1和BoMLPKn1的N端均含典型的豆蔻酰化基序,BoMLPKf2的N端含疏水结构域。3个转录文本均具有1个高度保守的Ser/Thr蛋白激酶结构域。RT-PCR检测发现自交不亲和甘蓝自花授粉15min后BoMLPKf2相对表达量急剧升高,BoMLPKf1和BoMLPKn1在自花授粉15 min后相对表达量无明显变化。亚细胞定位检测到BoMLPKn1定位在细胞膜上。利用CRISPR-Cas9植物编辑系统对BoMLPKn1拟南芥直系同源基因AtAPK1b基因组进行定点敲除,获得突变体植株。与野生型相比,突变体植株均能够正常开花结籽。结果表明MLPKn1基因在整个十字花科进化中是高度保守的,不参与自交不亲和反应,这与MLPKf1/2不同。 相似文献
15.
为阐明芥菜开花路径核心调节子SVP与FLC相互作用的结构域,从酵母重组质粒pGADT7SVP、pGBKT7FLC分别亚克隆了5个SVP截短体（SVP1 ~ 5）和5个FLC截短体（FLC1 ~ 5）。SVP1 ~ 5与FLC1 ~5编码蛋白的结构域均分别为MI、MIK、K、IKC和KC。利用酵母双杂交体系,分别构建酵母猎物质粒pGADT7SVP1 ~ 5与诱饵质粒pGBKT7FLC1 ~ 5,并转化对应的酵母Y187、Y2HGold菌。酵母转化子Y187［pGADT7SVP2 ~ 5］能与Y2HGold［pGBKT7FLC］融合,并可在选择性固体培养基QDO/X/A上长出蓝色菌落,表明FLC能与截短体蛋白SVP2 ~ 5异源结合,SVP的K域（SVP3）可独立作用于FLC蛋白。此外,Y187［pGADT7SVP］× Y2HGold［pGBKT7FLC2 ~ 5］也能同时激活报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1,表明FLC的K域（FLC3）也可独立作用于SVP。进一步研究发现：Y187［pGADT7SVP3］× Y2HGold［pGBKT7FLC3］正向杂交以及Y187［pGADT7FLC3］× Y2HGold［pGBKT7SVP3］载体互换后杂交均可相互作用,表明SVP的K域（SVP第96 ~ 173位氨基酸区域）与FLC的K域（FLC第114 ~ 167位氨基酸区域）能够异源结合,是介导SVP与FLC蛋白互作的关键结构域。 相似文献
16.
以‘国光’苹果（S1S2）花粉为材料,成功构建了酵母pGADT7-cDNA文库,转化效率约为1.2×106.μg-1,插入片段大小在300~2000bp之间。通过酵母双杂交方法,用苹果S2-RNase的C2HVC3区筛选文库获得一个长505bp的cDNA片段,经分析发现该cDNA序列上有一个261bp的开放阅读框（ORF）,该ORF编码一个具N端信号肽的多肽,该成熟多肽由64个氨基酸组成,富含带正电荷的赖氨酸和精氨酸,其C端有8个半胱氨酸和一个γ-硫堇功能域,结构预测显示其具有一个α螺旋,3个β折叠,4个二硫键,由此,推断其为苹果γ-硫堇,命名为MdD1。RT-PCR分析发现：MdD1基因在‘国光’苹果叶片、萼片、花瓣、子房、花药和花柱等组织中都有表达,但花药中表达量最高。酵母双杂交结果表明MdD1除了与苹果S2-RNase的C2HVC3区互作外,还与S1-RNase的C2HVC3区,S1、S2-RNase的成熟多肽区存在互作。初步认为：苹果γ-硫堇可能通过与S-RNase非特异性互作,作为花粉非S因子参与自交不亲和反应。 相似文献
17.
PAP3(Gen Bank登录号:HM104635)和PPI(Gen Bank登录号:GU812176)基因是控制辣椒花器官发育的B类基因,共同控制花瓣和雄蕊的发育,均属于MADS-box家族基因。为验证PAP3蛋白和PPI蛋白的相互作用,利用酵母双杂交系统,构建pGBKT7-PPI和pGADT7-PAP3酵母表达载体,转化相应酵母AH109感受态细胞后未出现自激活和毒性现象,融合的二倍体酵母(pGBKT7-PPI×pGADT7-PAP3)能在营养缺陷型培养基上生长;同时利用体外GST-Pull down技术,将诱导的GST-PAP3蛋白和His-PPI蛋白孵育,结果均表明,PAP3蛋白和PPI蛋白之间存在特异性相互作用。 相似文献
18.
以‘国光’苹果（S1S2）花粉为材料,成功构建了酵母pGADT7-cDNA文库,转化效率约为1.2 × 106 · μg-1,插入片段大小在300 ~ 2 000 bp之间。通过酵母双杂交方法,用苹果S2-RNase的C2HVC3区筛选文库获得一个长505 bp的cDNA片段,经分析发现该cDNA序列上有一个261 bp的开放阅读框（ORF）,该ORF编码一个具N端信号肽的多肽,该成熟多肽由64个氨基酸组成,富含带正电荷的赖氨酸和精氨酸,其C端有8个半胱氨酸和一个γ–硫堇功能域,结构预测显示其具有一个α螺旋,3个β折叠,4个二硫键,由此,推断其为苹果γ–硫堇,命名为MdD1。RT-PCR分析发现：MdD1基因在‘国光’苹果叶片、萼片、花瓣、子房、花药和花柱等组织中都有表达,但花药中表达量最高。酵母双杂交结果表明MdD1除了与苹果S2-RNase的C2HVC3区互作外,还与S1-RNase的C2HVC3区,S1、S2-RNase的成熟多肽区存在互作。初步认为：苹果γ–硫堇可能通过与S-RNase非特异性互作,作为花粉非S因子参与自交不亲和反应。 相似文献
19.
以羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）自交不亲和系（S13-b S13-b）为试验材料,利用RT-PCR的方法分离其ARC1基因cDNA序列（命名为BoARC1,GenBank登录号为EU344909）。BoARC1 cDNA序列中含有1个1 992 bp的开放读码框（ORF）,编码1个含有663个氨基酸的蛋白质。羽衣甘蓝BoARC1与油菜BnARC1的氨基酸序列具有94%的一致性;Southern杂交结果显示BoARC1在基因组中只存在单一拷贝;Northern杂交结果显示BoARC1特异性地在柱头组织中表达;在酵母双杂交试验分析中,BoARC1能够与SRK3、SRK 13-b和SRK910的胞内激酶域发生相互作用。 相似文献
20.
对高度自交不亲和甘蓝柱头进行自花授粉和异花授粉处理后,取柱头进行蛋白质表达谱的比较研究,获得一种受自花授粉诱导下调表达,异花授粉诱导上调表达的蛋白,命名为BoPLL。进一步分析转录组数据发现,BoPLL在自花授粉0 ~ 30 min上调表达,30 ~ 60 min下调表达,而在异花授粉0 ~ 60 min一直上调表达。克隆获得cDNA为1 212 bp,编码含403个氨基酸残基的蛋白质BoPLL。序列分析发现BoPLL含有高度保守的PASTA结构域和CMM-10结构域、中度保守的PbH1结构域、低度保守的HYDRO结构域,说明该蛋白是典型的PLL家族蛋白。染色体定位结果表明,该基因与自交不亲和性相关基因不连锁。进化分析表明,甘蓝BoPLL与拟南芥AtPLL亲缘关系最近,与苜蓿MtPLL亲缘关系较远。RT-PCR发现,BoPLL在甘蓝花粉和柱头中表达,且柱头中的表达量明显低于花粉,在叶片、花蕾、萼片和花瓣中均没有检测到表达信号。荧光定量PCR结果显示,BoPLL在自花授粉和异花授粉15 ~ 60 min的表达变化趋势与转录组分析结果基本一致。根据上述结果推测BoPLL可能是一种参与甘蓝自交不亲和反应过程的基因。 相似文献