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[目的]构建日本蟾蜍(Bufo japonicus formosus)髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,mcl-1)的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达。[方法]通过PCR方法扩增日本蟾蜍皮肤mcl-1开放阅读框,将其插入到原核表达载体pET-28b中。经菌落PCR、DNA限制性内切酶消化筛选阳性克隆,并通过DNA测序确定原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功。将pET-28b-mcl-1转入大肠杆菌(E.coli)感受态细胞BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE对重组蛋白的表达进行检测。[结果]原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功;重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。[结论]原核表达载体的构建及重组蛋白的表达,为后续MCL-1的纯化、抗血清的制备及生理功能检测奠定了基础。 相似文献
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根据MagaininⅡ氨基酸序列,选用大肠杆菌偏爱密码子,化学合成了2个DNA片段,利用重叠区互补PCR法得到MagaininⅡ的基因序列.构建了融合表达载体pET21 b-MagaininⅡ,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,在5.1 kD处可见目的蛋白条带,... 相似文献
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【目的】进一步研究小鼠维甲酸诱导基因Ⅰ(Rig-Ⅰ)蛋白的细胞信号传导、结构与功能。【方法】利用已经构建好的逆转录病毒载体MigRI-Rig-Ⅰ,用PCR方法扩增出小鼠Rig-Ⅰ基因氨基端100 bp长度的片断(Rig-Ⅰ-N),将此片段定向克隆到原核表达载体pGEX-4T2中,构建pGEX-4T2-Rig-Ⅰ-N,再将Rig-Ⅰ基因剩余部分克隆到已构建有Rig-Ⅰ-N部分片段的pGEX-4T2-Rig-Ⅰ-N中,构建融合表达载体pGEX-4T2-Rig-Ⅰ,将其转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,对表达产物GST-Rig-Ⅰ融合蛋白进行纯化,制备抗体,并对抗体效价进行ELISA检测及抗体特异性的Western blot分析。【结果】重组蛋白GST-Rig-Ⅰ能在大肠杆菌中表达,表达的融合蛋白GST-Rig-Ⅰ纯化和洗脱后分子质量为130 ku,纯度>90%,制备的抗体效价达到1∶625 000,并且能够识别在原核表达系统以及真核细胞内表达的小鼠Rig-Ⅰ蛋白。【结论】建立的表达系统能够表达重组蛋白GST-Rig-Ⅰ,制备的抗体具有良好的免疫特异性。 相似文献
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【目的】构建新疆多浪羊IL-1β基因编码区的原核表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达,为进一步研究IL-1β蛋白的结构功能奠定基础。【方法】从含质粒pMD-18T-IL-1β的大肠杆菌DH5α中获取IL-1β基因,与pET-28b质粒DNA连接,构建原核表达载体pET-28b-IL-1β。先将其转化到克隆载体E.coli DH5α感受态细胞中大量拷贝,经菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定后,提取pET-28b-IL-1β质粒转化到表达载体E.coli BL21(DE3)中,再次进行菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。将阳性单克隆接种于LB液体培养基,以终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导,用SDS-PAGE电泳检测IL-1β蛋白的表达及存在形式,通过Western blotting验证表达产物是否为目的蛋白。【结果】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,该载体经诱导后表达出融合蛋白,分子质量为32.4ku,主要以包涵体的形式表达;经Western blotting检测,带有6×His标签的融合蛋白有很好的反应原性。【结论】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,其在大肠杆菌BL21(DE3)中经诱导后表达出分子质量约为32.4ku的IL-1β融合蛋白。 相似文献
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乙脑病毒E蛋白中和表位与结核杆菌hsp70 在大肠杆菌中的融合表达 总被引：2，自引：0，他引：2
根据大肠杆菌偏嗜性密码子原则,人工合成了乙脑病毒E蛋白C末端的中和表位,位于E蛋白上373~399 aa,通过EcoRⅠ和HindⅢ连接构建原核表达载体pET-32a-epitope。将hsp70通过HindⅢ和XhoⅠ连接到载体pET-32a-epitope上中和表位的3′端,构建融合表达载体pet-32a-epitope-hsp70。诱导表达后,将上清和沉淀分别进行SDS-PAGE,结果表明该融合蛋白以包含体形式存在。将包含体在8 mol/L的尿素中过夜溶解,然后将上清过柱,获得良好的纯化结果。融合蛋白的分子量为94 kD。Western blot显示该蛋白兼具对JEV和结核杆菌热休克蛋白70(M.Thsp70)的特异抗原性。 相似文献
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【目的】构建猴痘病毒B20R蛋白原核表达系统,并评价原核表达获得的融合蛋白免疫原性,为后续的猴痘病毒检测及新型治疗方法开发提供技术支撑。【方法】参照GenBank已公布的猴痘病毒基因组序列,按照大肠杆菌密码子偏好性对B20R基因DNA序列进行优化,人工合成B20R基因并将其分别克隆至表达载体pET-28a和pET-32a以构建原核表达载体;以构建的2种原核表达载体分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达后使用SDSPAGE和Western blotting检测融合蛋白B20R的表达情况。通过控制变量法优化融合蛋白B20R的诱导表达条件,使用Ni柱亲和层析进行纯化;以纯化的融合蛋白B20R经腹腔注射免疫昆明小鼠,定期采集昆明小鼠血样,采用ELISA检测血清抗体效价。【结果】将B20R基因克隆至表达载体pET-32a能成功构建原核表达载体pET-32a-B20R,经IPTG诱导后,可在大肠杆菌BL21感受态细胞中表达出融合蛋白B20R,且主要以不可溶的包涵体形式进行表达。融合蛋白B20R最佳诱导表达条件为37℃下以0.6 mmol/L IPTG诱导12 h,Ni柱亲和层析纯化... 相似文献
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[目的]为构建盐穗木盐响应基因HcALDH7A1的原核表达载体并进行外源基因的诱导表达和优化.[方法]以实验室已构建好的p mD18-T Simple-HcALDH7A1/DH5α(Pst Ⅰ,SacⅠ)重组载体中盐穗木醛脱氢酶基因(HcALDH7A1)为模板,设计带有酶切位点(EcoRⅠ,XhoⅠ)的引物通过PCR扩增亚克隆到p mD18-TSimple vector中,测序鉴定正确后,通过EcoRⅠ和Xho Ⅰ双酶切,构建重组的原核表达载体pET28a-HcALDH7 A1.将鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌Transetta(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白表达,并对其表达体系进行优化.[结果]成功构建盐穗木醛脱氢酶基因HcALDH7A1的原核表达载体,诱导HcALDH7A1外源基因表达蛋白优化的最佳条件为IPTG终浓度为0.6 mmol/L,30℃诱导时间为4h.融合蛋白分子量大小为61 kD.[结论]成功在大肠杆菌体内诱导表达盐穗木醛脱氢酶HcALDH7A1基因,并明确目的蛋白的最佳表达条件.为后续在原核表达系统大肠杆菌细胞中探索盐穗木HcALDH7A1的生物和非生物胁迫的功能奠定了基础. 相似文献
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华山新麦草α-醇溶蛋白基因的克隆及原核表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【研究目的】克隆华山新麦草（Psathyrostachys huashanica）的α-醇溶蛋白基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。【方法】采用同源克隆法从华山新麦草基因组DNA中分离克隆出α-醇溶蛋白基因并进行序列分析,将克隆的华山新麦草α-醇溶蛋白基因Gli-Ns-5克隆到表达载体pET-28a (+)上,获得重组质粒pET28a-Gli-Ns转化大肠杆菌BL21 (DE3)并诱导表达。【结果】从华山新麦草基因组DNA中克隆了4个α-醇溶蛋白基因：Gli-Ns-2 (FJ713595)、Gli-Ns-3 (GQ139525)、Gli-Ns-4 (GQ139526)和Gli-Ns-5 (GQ139527)。序列分析表明,4条序列具有α-醇溶蛋白基因的典型结构特征,含有8个或9个半胱氨酸残基,序列FJ713595为假基因。利用所构建的大肠杆菌表达载体,经IPTG诱导,华山新麦草α-醇溶蛋白基因Gli-Ns-5(GQ139527)可在原核系统中特异性表达。Western-blot证实融合蛋白可成功表达。【结论】克隆了4个华山新麦草的α-醇溶蛋白基因序列,基因Gli-Ns-5(GQ139527)可在原核表达系统中成功表达,为小麦品质改良提供了新的候选基因。 相似文献
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金鱼Tgf2转座子基因属于Hobo/Activator/Tam3(hAT)超家族,其编码的活性转座酶能在多种鱼类转座中介导基因插入及诱变,因此在鱼类重要性状主控基因的筛选、功能解释及育种等方面具有重要的应用前景.鉴于Tgf2转座酶基因(JN886591)存在众多稀有密码子,本研究依据大肠杆菌对密码子的偏好性,对金鱼Tgf2转座酶基因进行密码子优化,所得Tgf2转座酶基因连接原核表达载体pET-28a(+),将重组载体转化到大肠杆菌BL21 (DE3)细胞.该大肠杆菌细胞在培养温度37℃、OD600≈0.5时用IPTG诱导获得高效表达,即菌体中含有8.8％的重组蛋白,上清液中含有4.0％重组蛋白.采用亲和层析纯化从菌体上清液中分离得到分子量约70 ku的可溶性重组蛋白,经MALDI-(TOF)/TOF串联质谱鉴定其为重组Tgf2转座酶.进而采用分子排阻色谱法研究转座酶的DNA结合活性,结果表明:所得重组Tgf2转座酶能识别并结合含Tgf2转座子特异性亚末端重复序列的DNA探针,即启动转座.采用原核表达体系高效获得重组Tgf2转座酶,为其作为工具酶应用于鱼类生物学研究奠定必要的基础. 相似文献
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金黄色葡萄球菌FnBP配体结合区基因的克隆及其原核表达(英文) 总被引：1，自引：0，他引：1
[Objective] The study aimed to clone the FnBP ligand binding gene of Staphylococcus aureus and run prokaryotic expression by constructing a prokaryotic expression vector. [Method] The gene encoding FnBP ligand binding gene was amplified from S.aureus chromosomal DNA by PCR technique. After T-A cloning, plasmid pMD18- FnBP was constructed. pMD18- FnBP and pET28a(+)were digested by BamH Ⅰ and EcoR Ⅰ double enzymes, then the purified FnBP ligand binding gene was subcloned into the expression vector pET28a(+), and the prokaryotic expression vector pET28a-FnBP was thus constructed. The constructed plasmid pET28a-FnBP was transformed into Escherichia coli BL21(DE3) competent cells. The bacterium was induced by IPTG and the expressed products were analyzed by SDS-PAGE and Western blot. [Result] The gene fragment with the length of 370 bp was amplified by PCR approach. One approximately 30 kD exogenous protein was observed in SDS-PAGE analysis. Western blot analysis indicates the protein has antigenicity of S.aureus. [Conclusion] The FnBP ligand binding gene of S.aureus was successfully cloned and expressed in prokaryotic cells. 相似文献
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根据GenBank中登录的T7RNA聚合酶基因参考序列,设计合成了1对特异性引物扩增对T7RNA聚合酶基因进行扩增,将测序正确的T7RNA聚合酶基因和真核表达载体pIRES2-EGFP双酶切后进行连接构建pIRES2-EGFP-T7RNA RNA质粒。再将构建正确的pIRES2-EGFP-T7RNA质粒经用脂质体法转染猪睾丸细胞,通过G418筛选和单细胞克隆化,同时构建pET-32a-RED原核表达质粒载体,用其检测T7启动子控制下的红色荧光蛋白的表达。结果表明,建立的ST/T7RNA细胞系经20次传代仍然能稳定表达T7RNA聚合酶。结果显示,成功建立能稳定表达T7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系,为猪瘟病毒反向遗传操作平台奠定了基础。 相似文献
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胡萝卜抗冻蛋白基因克隆及植物表达载体构建 总被引：20，自引：0，他引：20
以胡萝卜品种 Autumn King的幼苗为材料 ,用 CTAB法提取其基因组 DNA,以 PCR ( Polym eraseChain Reaction)的方法在体外扩增出胡萝卜抗冻蛋白基因 ( afp) ,以 p UCm - T Vector为载体构建成胡萝卜 afp的克隆载体 p TAF,用 Eco R 消化重组质粒 p TAF使其线性化 ,再用 DNA聚合酶 Klenow大片段补平末端 ,然后用Xba 消化 ,获得一末端粘 ,一末端平的目的片段 ( afp)。植物表达载体 p BI12 1用 X ba 和 Sma 双酶切 ,获得一末端粘 ,一末端平的线性质粒。将目的片段与线性质粒在 T4DNA连接酶的作用下进行定向连接 ,构建成胡萝卜 afp的植物表达载体 p BAF 相似文献
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[目的]构建河南华溪蟹（Sinopotamon henanense）金属硫蛋白（MT）的原核表达载体。[方法]以大肠杆菌DH-5α中的pGEM-MT质粒为模板,PCR扩增目的片段并连接至pGEM-T载体。然后,亚克隆至pQE31表达载体,转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞。[结果]PCR扩增目的片段产物大小约为220 bp,与预期大小一致。重组质粒pQE31-MT双酶切鉴定结果也与预期相符。[结论]成功构建了MT原核表达载体,为今后表达并纯化MT提供了材料。 相似文献
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条斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)基因(PyTPS)具有TPS及TPP双结构域,以该基因的原核表达载体pET22b-PyTPS为材料,利用双酶切片段替换法对该基因TPP结构域磷酸酶基序的编码框Box1与Box2进行了缺失突变.第一,用715bp缺失Box1的KpnI-EcoRI人工合成片段替换pET22b-PyTPS中相应的片段,获得了缺失Box1的突变基因PyTPS-Box1.第二,用661bp缺失Box2的EcoRI-HindII片段进行替换,获得了缺失Box2的突变基因PyTPS-Box2.第三,在缺失Box1后,再通过替换缺失Box2,获得了同时缺失Box1与Box2的突变基因PyTPS-Box1-Box2.本研究既获得了三种突变基因,又获得了其原核表达载体,为研究PyTPS基因的编码活性提供了材料,奠定了基础. 相似文献
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犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白基因的克隆和原核表达质粒的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
通过设计特异性引物,以犬传染性肝炎患犬的全血基因组DNA为模板,经PCR扩增,获得了犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白基因,将其插入到pMD18-T载体进行测序、鉴定,构建原核表达质粒载体pGEX-6p-1-Hex-on。结果显示,犬传染性肝炎病毒Hexon基因已被成功地克隆,基因全长2 718 bp,包含从起始密码子ATG到终止密码子TAA的完整序列。与犬传染性肝炎病毒国际标准株Hexon蛋白基因的同源性为99.7%,通过实验鉴定表明pMD18-Hexon克隆载体和原核表达质粒载体pGEX-6p-1-Hexon已成功构建。 相似文献