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以感染水稻条纹病毒(RSV)水稻叶片的总RNA为模板,利用RT-PCR扩增出了RSV的CP基因。分别将正反向的CP基因连接到载体pMCG161,再将此载体和pCAMBIA1301载体同时双酶切,产物回收后连接,成功构建了适合农杆菌介导的水稻转化RNAi载体。在农杆菌水稻转化过程中,比较了分化阶段是否加潮霉素对愈伤组织分化的影响,结果表明,分化阶段去除潮霉素的筛选可以提高愈伤组织的分化程度但同时降低获得水稻植株的阳性率。 相似文献
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葡萄病毒B Grapevine virus B(GVB)是葡萄皱木复合病中栓皮病的病原,为开展抗GVB转基因研究,本研究利用RT-PCR技术克隆GVB外壳蛋白(coat protein,CP)基因,与植物表达载体pRI 101-AN连接构建植物表达载体pRI-GVB CP。采用电击转化法将植物表达载体pRI-GVB CP导入农杆菌LBA4404,并利用农杆菌介导的叶盘转化法将外源基因导入西方烟‘37B’。共获得16个烟草再生株系,PCR检测其中3个株系为阳性,阳性株系播种获得的64株T_1代植株中有30株扩增到目的条带,阳性率为46.9%,表明目的基因GVB cp成功导入烟草并可成功遗传到子代。28株T_1代转基因植株接种病毒进行抗病性鉴定,其中有6株对接种病毒GVB具有抗性。 相似文献
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将水稻白叶枯病原菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae编码harpinXoo蛋白的hpa1Xoo基因构建植物重组表达质粒pCAMBIA3300-hpa1Xoo-bar,由根癌农杆菌Agrobacterium tumefa-ciensLBA4404介导,叶盘法转化寒菊QX-077,获得了草丁膦转基因寒菊株系。经PCR、Southernblot和RT-PCR检测证明hpa1Xoo已整合到寒菊基因组中。在转基因株系的叶片和植株上抗虫性鉴定表明,转基因寒菊显著抑制桃蚜Myzus persicae的繁殖（t〈0.01）。RT-PCR表明转基因植株中hpa1Xoo能够在转录水平正常表达。hpa1Xoo转化寒菊可以正常表达并提高寒菊对蚜虫的抗性。 相似文献
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一个水稻褐飞虱为害诱导型启动子的克隆 总被引：1，自引：0，他引：1
目前组成型启动子在基因工程中的应用最为广泛,然而驱动外源基因在各组织中持续恒定地表达可能引起植物发育迟缓等问题。诱导型启动子能够在特定条件下实现目的基因定时优势表达,最大限度减少由于非必需蛋白在转基因植物内的积累对其造成的伤害。依据基因芯片数据并通过定量RT-PCR验证,找到了一个受水稻褐飞虱(Nilaparavata lugens)为害诱导表达基因(LOC_Os01g73940)。用PCR技术从籼稻品种‘TN1’的基因组中获得Os01g73940上游1 953bp的启动子片段,命名为BPHIP。将BPHIP连接到带有β-glucuronidase(GUS)报告基因的植物表达载体上,通过农杆菌介导转化水稻品种‘中花11’。通过GUS组织化学染色法及定量RT-PCR检测证明,BPHIP是一个受褐飞虱为害和茉莉酸处理诱导上调的启动子。利用此类启动子在基因工程中可以减少对水稻生理方面产生的副作用,对抗虫转基因水稻具有良好的应用价值。 相似文献
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抗菌蛋白AP1编码基因对马铃薯的转化及其介导的青枯病抗性研究 总被引：7，自引：1，他引：7
根据已知马铃薯抗青枯菌蛋白AP1编码基因序列,合成了特异性引物,经PCR扩增、酶切以及连接、转化等分子操作,成功地获得了AP1编码基因植物表达载体pHap1,该载体具有-2E-P35S-12-ap1-结构。以电激法将pHap1导入根癌农杆菌LBA4404,用叶盘法转化马铃薯青枯病感病品种Mira、中-5-1及金冠试管苗,分别获得了卡那霉素(kan)抗性再生苗。经PCR、Southern、Northern检测,表明ap1基因已成功整合到转基因植株染色体上并正确表达。对Mira品种的转基因植株进行了青枯病抗病性鉴定,结果表明,转基因植株的抗病性比非转基因植株对照明显提高,发病或出现萎蔫症状的时间延迟、病情指数降低。 相似文献
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将编码大豆凝集素的lec-s基因插入植物表达载体pBI121中,构建植物重组表达质粒pBI121:: lec-s。由根癌土壤杆菌EHA105介导的叶盘法转化烟草,获得了转基因烟草株系。PCR和RT-PCR检测证明lec-s基因已转入烟草植株中。接种烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）进行抗病性试验结果表明,转基因烟草叶片上的病斑数显著减少,说明转基因烟草表现出对TMV的抗性。定量RT-PCR检测发现,接种TMV后,抗病防卫基因（PR-1a、GST1、Pal和hsr515）在转基因烟草叶片中显著上调表达。这些结果表明,大豆凝集素基因lec-s转化烟草可对TMV产生抗性,其作用机制可能在于lec-s基因参与了植物的防卫信号通路,诱导了抗病防卫基因在转基因植株体内的表达,增强了植株对TMV的系统抗性。 相似文献
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将水稻白叶枯病原菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae编码harpinXoo蛋白的hpalXoo基因构建植物重组表达质粒pCAMBIA3300-hpalXoo-bar,由根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciens LBA4404介导,叶盘法转化寒菊QW-077,获得了草丁膦转基因寒菊株系.经PCR、Southern blot和RT-PCR 检测证明 hpalXoo已整合到寒菊基因组中.在转基因株系的叶片和植株上抗虫性鉴定表明,转基因寒菊显著抑制桃蚜 Myzus persicae的繁殖(t＜0.01).RT-PCR表明转基因植株中hpalXoo能够在转录水平正常表达.hpalXoo转化寒菊可以正常表达并提高寒菊对蚜虫的抗性. 相似文献
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本研究旨在通过根癌农杆菌介导法将ACO基因转入亚洲百合植株中,为植物抗衰老提供理论依据和技术基础。以亚洲百合‘精粹’无菌苗离体小鳞片为外植体,利用农杆菌介导法将携带有抗衰老基因ACO的RNAi载体转化到百合中,观测分析影响百合遗传转化的因素。结果表明:在遗传转化过程中,预培养3 d后,在菌液和共培养基中均添加25 mg/L乙酰丁香酮,将OD600=0.8的根癌农杆菌侵染小鳞片8 min,再共培养3 d,有利于获得最高遗传转化效率,抗性植株经PCR检测部分呈现阳性,初步证明ACO基因已经导入到百合基因组中。 相似文献
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抗除草剂转基因水稻对稻纵卷叶螟田间自然种群的影响 总被引：2，自引：0，他引：2
［目的］明确抗除草剂转基因水稻对非目标生物的影响。［方法］以稻纵卷叶螟为指示物种,调查其在抗除草剂转基因籼稻‘Bar68 1’稻田与非转基因亲本对照‘D68’稻田的种群密度、发育进度以及水稻的受害程度。［结果］在转基因和非转基因稻田中,除2007年水稻乳熟期外,稻纵卷叶螟幼虫的发生密度无显著差异;稻纵卷叶螟不同龄期幼虫比例（%）在转基因稻田与非转基因稻田之间表现出较高的一致性;除2007年分蘖末期外,处理与对照间的单株受害叶片数和卷叶率（%）差异均不显著;转基因水稻与对照植株的卷叶指数（%）表现基本一致。［结论］转基因抗除草剂水稻‘Bar68 1’对非目标物种稻纵卷叶螟不造成影响。 相似文献
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［目的］ 构建蛋白激发子基因 peaT1的植物表达载体并转化棉花品种‘CCRI24’。［方法］ 设计含有 PstⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,以质粒pET28a-peaT1为模板扩增得到 peaT1序列,将其通过中间载体pG4AS-cup克隆到植物表达载体pCAMBIA2300上,通过农杆菌介导法转化棉花品种‘CCRI24’,诱导并筛选抗性愈伤和胚性愈伤,通过PCR、southern杂交和RT-PCR检测筛选的棉株。［结果］ 构建了含有增强子和多联终止子的植物表达载体pCAMBIA2300-peaT1,获得了大量的胚状体和4棵再生苗并嫁接成活,验证了蛋白激发子基因 peaT1已经整合到再生苗2和4基因组当中。［结论］ 本研究为进一步开展蛋白激发子基因 peaT1转化棉花的研究提供了基础材料。 相似文献
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马铃薯Y病毒HC-Pro、CI、NIb和CP基因介导的病毒抗性比较研究 总被引：2，自引：0，他引：2
根据已克隆的马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)的基因组序列设计引物,利用PCR扩增HC-Pro、CI、NIb和CP4个基因的3'端400bp cDNA区段,分别反向插入含有査尔酮合成酶基因(Chalcone synthase,CHS)内含子的双元载体pRCHS中,构建了含内含子的发夹结构RNA (intron splicing hpRNA,ihpRNA)表达载体pRCHS-HC-Pro、pRCHS-CI、pRCHS-NIb和pRCHS-CP。利用农杆菌介导法转化烟草品种NC89,获得了多种转基因植株。病毒抗性检测的结果显示:转pRCHS-HC-Pro、pRCHS-CI、pRCHS-NIb和pRCHS-CP的烟草中,抗性植株的比例分别为55.34%、73.69%、61.54%和84.21%。大分子RNA和siRNA的Northern blot分析表明,目的片段转录产物的积累量与转基因植株的抗病性呈负相关,转基因植株中可检测到siRNA,说明所获得的抗病性是RNA沉默介导的。 相似文献
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利用RNAi 介导的抗病性获得抗2 种花生病毒的转基因烟草 总被引：1，自引：0，他引：1
分别以花生条纹病毒红安株系(PStV-Hongan)外壳蛋白基因(CP),花生矮化病毒轻型株系(PSV-Mi)和花生黄瓜花叶病毒(CMV-CA)复制酶基因2a为模板,通过PCR 方法分别得到PStV-CP 5′ 端,PSV-Mi 和CMV-CA 2a3′ 端150 bp 的片段,3 种片段混合物为模板经PCR 拼接得到450 bp 的片段,此拼接片段通过Gateway 系统重组至植物表达载体pK7GW1WG2,得到含反向重复拼接片段的植物表达载体pK450。冻融法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101 后,叶盘法转化本生烟(Nicotiana benthamiana),经PCR 检测,获得转基因植株。对T1 代转基因植株分别人工接种3 种病毒,66. 7% 的植株表现对PStV 免疫,9% 的植株表现对CMV-CA 的恢复抗性,全部植株对PSV 感病。siRNA 的Northern blot 结果表明,所有转基因烟草植株都含有病毒特异siRNA,siRNA 含量随接种后时间延长而衰减。 相似文献
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核基质结合区对马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因介导抗病性的影响 总被引：3，自引：0，他引：3
为探索核基质结合区(matrix attachment regions,MARs)对RNA介导的病毒抗性的影响,我们将从烟草中克隆到的核基质结合区TM2构建在包含马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因的植物表达载体pRPVYCPN的表达盒的两侧,构建了植物表达载体pRTM2CPNTM2。采用农杆菌介导基因转化法,将表达载体pRPVYCPN和pRTM2CPNTM2转入烟草品种NC89中,分别获得了144株和344株转基因烟草。抗病性检测发现,核基质结合区的存在能明显提高RNA介导抗性的产生效率。在含MARs转基因植株中,抗病植株的比率为15.1%,而不含核基质结合区的转基因植株的抗病比率则为8.3%。这一研究结果对抗病毒植物的分子育种和转基因表达调控有指导意义。 相似文献
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为了提高马铃薯对细菌性病害的抗性,以来源于膜翅目昆虫的新多肽抗生素Apidaecin为目的基因,以多肽抗生素Shiva-Ⅰ为对照,对多肽抗生素在马铃薯抗青枯病基因工程中的应用进行了研究。采用农杆菌介导的方法,用含有Apidaecin Shiva-Ⅰ双价基因的植物表达载体pBinPRSIHbI对马铃薯栽培品种米拉、中-5-1、Favorata和尼勒克进行了遗传转化试验,共获得卡那抗性再生植株31个,获得了最佳的植株再生分化体系和遗传转化条件。PCR检测及RT-PCR分析表明,目的基因已成功地整合到转基因植株的染色体上并在转基因马铃薯中进行了转录。 相似文献
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利用RNA介导的抗病性获得高度抗马铃薯Y病毒的转基因烟草 总被引：29，自引：8，他引：21
以马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)的RNA为模板,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,扩增出长度为801 bp的非翻译的马铃薯Y病毒外壳蛋白基因。将扩增的片段克隆到pBSK的BamHI和KpnI之间并进行了序列测定。用BamHI和KpnI从重组克隆载体上切下该基因并插入到质粒pROKII内得到植物表达载体pPVYCP。通过根癌农杆菌(LBA4404)介导的方法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选、PCR和Southern blot检测,获得82株转基因植株。Northern blot和Western blot分析表明,转基因植株只在RNA水平上得到了表达。抗病性试验表明转基因植株之间抗性水平存在着差异,其中有7株是对PVYN高度抗病性的植株。转基因植株抗病特异性试验初步表明,对PVYN表现高度抗病的植株对PVYO也具有高度抗病性。 相似文献
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病原细菌无毒基因avrD介导的抗赤星病转基因烟草 总被引：10，自引：0，他引：10
利用从病原细菌Pseudomonas syringae pv.tomato中获得的无毒基因avrD片段与病原菌诱导型的特异启动子PⅠⅡ、CHS和PAL构建成表达盒,通过土壤农杆菌分别转化烟草品种K326和Bottom Special。经烟草赤星病菌孢子定量接种转基因植株及其离体叶片,筛选到一批高抗植株。Southern分子杂交检测证明,启动子-avrD嵌合基因已整合到寄主染色体并获得表达。 相似文献
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hpRNA的茎环比例对RNA介导的病毒抗性产生的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
以马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因3'端50bp片段为hpRNA的茎,以pUC19不同长度的序列为hpRNA的环,构建了茎环比例分别为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4和1:8的植物表达载体。利用农杆菌介导法转化烟草品种NC89,获得了多种转基因植株。室内抗病性检测发现:不同茎环比例的hpRNA介导的病毒抗性效率不同;茎环比例为4:1、2:1和1:1时效率较高,抗性植株的比例达60%左右;随着环长度的逐渐增加,抗性植株的比例逐渐降低;当茎环比例为1:8时,抗性植株的比例仅为9.52%。Southern blot分析结果表明:外源基因已整合于烟草的基因组中,且转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性。Northern blot分析结果表明:目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,证明所获得的抗病性是RNA介导的。 相似文献