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对头孢菌素C的工业生产菌种顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)原生质体形成和再生条件进行了研究。优化后的制备及再生条件为:在蛋白胨固体培养基上培养110~120 h的菌丝体,30℃条件下经1%蜗牛酶和1%纤维素酶混合液酶解3.5 h,原生质体得率最高可达2.377×107个/mL;在以KC(0.6 mol/L KCl+25mmol/L CaCl2.2H2O)为渗透压稳定剂的再生培养基上进行培养,再生率可达40%。用pMK4-LV质粒通过电击法对原生质体进行转化,成功得到了重组子,转化率约为10个转化子/μg质粒DNA。转化子的PCR鉴定结果表明,外源基因已转入顶头孢霉基因组。 相似文献
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草菇原生质体制备、再生及转化研究 总被引：1，自引：0，他引：1
用酶解法对草菇原生质体制备及再生条件进行了研究.结果表明: 液体静置培养4 d的菌丝,以0.6 mol/L的甘露醇作渗透压稳定剂,溶壁酶质量浓度15 mg/mL,34 ℃下酶解3 h,原生质体制备率最高;草菇原生质体预培养16 h后涂布在再生培养基上,再生率最高.同时,采用PEG法将潮霉素抗性基因转入草菇的原生质体中,经过抗性筛选,得到了具有潮霉素抗性的草菇转化子. 相似文献
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稗草生防潜力菌Helminthosporium gramineum f. sp. echinochloae的原生质体制备和再生 总被引：1，自引：0，他引：1
禾长蠕孢菌（Helminthosporium gramineum f. sp. echinochloae,HGE)是稗草生防潜力菌,为建立HGE的遗传转化体系,研究了菌龄、胞壁降解酶、稳渗剂等对其原生质体制备和再生的影响。结果表明,HGE菌原生质体制备的适宜条件为：26℃下采用1.0%崩溃酶处理菌龄为6 h的HGE菌丝体2 h,0.7 mol/L NaCl为稳渗剂。原生质体再生的适宜条件为：32℃下采用05%崩溃酶处理菌龄为16 h的HGE菌丝体4 h,0.7 mol/L NaCl为稳渗剂,R1为高渗再生培养基。 相似文献
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【目的】广东虫草是我国特有珍稀食药用菌,其营养成分丰富、活性功效显著,已获批新资源食品,产业化应用前景广阔。建立广东虫草原生质体制备及遗传转化方法,可为广东虫草新品种选育及基因功能研究提供参考依据。【方法】以广东虫草菌丝体为材料,采用单因素分析方法对原生质体制备过程中酶解组合、酶解时间、酶解温度、复苏培养基及抗性标记进行筛选。同时以潮霉素抗性标记质粒pCAMBIA1300为转化片段,采用单因素分析方法对PEG介导的原生质体转化过程中亚精胺浓度、PEG加入间隔时间、抗生素添加时间进行筛选。并以广东虫草中的锌指半胱氨酸转录因子CgPro1敲除片段为目的转化片段,对转化系统进行验证。【结果】广东虫草原生质体制备的最佳组合条件为：采用含有裂解酶+崩溃酶的混合酶体系（1∶1）对广东虫草的菌丝体进行酶解,且酶解温度28℃、酶解时间为5.5 h时原生质体得率最高;原生质体复苏过程中,TB3复苏培养基对广东虫草原生质体的复苏效果最好、其次为0.6 mol/L KCl-PDA;PEG介导原生质体转化过程中,加入5 mmol/L亚精胺、PEG加入间隔时间10 min、原生质体复苏3 d后添加250μg/m... 相似文献
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层出镰孢菌原生质体制备条件的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]研究层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)原生质体的最佳条件,建立高效制备层出镰孢菌原生质体制备的方法.[方法]通过对菌丝体菌龄、酶解液组合、酶解反应温度及酶解时间等影响因素进行优化,对层出镰孢菌原生质体的制备条件进行研究.[结果]菌块在CMC液体培养基中25℃培养分生孢子3 d后,过滤离心后转移至YEPD液体培养基中培养12 h,该菌丝最适于层出镰孢菌原生质体的制备;用1.2 mol/L KCl溶液配制含有5 mg/m L裂解酶、25 mg/m L崩溃酶、0.05 mg/m L溶壁酶的酶解液在30℃下对菌丝酶解1.5 h,此时原生质体的数量最大,为2.47×10~9个/m L.原生质体再生培养时,使用40%PTC溶液恢复细胞壁,在TB3液体培养基中30℃过夜培养,离心后与TB3固体培养基混合后倒入平板培养,原生质体再生率可达39.75%.[结论]通过对菌丝体菌龄、酶解液浓度、温度、酶解时间等条件的优化,可提高层出镰孢菌原生质体的产量及再生率,为进一步研究层出镰孢菌致病分子机制提供理论依据. 相似文献
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《贵州农业科学》2016,(4)
为建立稳定的牛樟芝(Antrodia cinnamomea)遗传转化体系,同时筛选出适宜介导牛樟芝原生质体转化的PEG-CaCl_2浓度。利用潮霉素抗性、绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)标记和PCR扩增验证拟转化子。结果表明:新鲜的牛樟芝菌丝体在10 mg/mL溶壁酶溶液中,30℃条件下酶解4h,原生质体的获得率为3.55×105个/mL;菌丝体和原生质体在潮霉素B浓度分别为60μg/mL和40μg/mL时不能生长,最终确定筛选拟转化子的潮霉素B浓度为60μg/mL;浓度为20%~40%的PEG均可介导牛樟芝原生质体转化,且40%的PEG转化效率最高。 相似文献
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荷叶离褶伞液体发酵及生物酶法提取菌丝体多糖的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
首次利用10 L发酵罐研究了荷叶离褶伞菌丝生长、胞内和胞外多糖产量,以及6种酶对发酵菌丝体多糖的提取效果。结果表明,在25℃、120 r/min,空气流量为200 L/h的条件下发酵,8 d时胞内多糖含量（63.1 mg/g干菌丝体）和胞外多糖产量（3.54 g/L）达最高,9 d时菌丝体产量（17.86 g/L）及胞内多糖产量（1.11 g/L）达最高,与摇瓶发酵相比,其产量均显著提高。参试的6种酶中,溶壁酶酶解处理菌丝体获得的多糖产量最高,而中性蛋白酶是最经济适宜的酶类,与不加酶的水提法相比,多糖提取率分别提高了459.29%和376.11%,中性蛋白酶酶解制备菌丝体多糖的适宜条件为:在1%酶用量下,30℃酶解2 h后,95℃提取2次,每次2 h。 相似文献
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为建立稳定的牛樟芝(Antrodia cinnamomea)遗传转化体系,同时筛选出适宜介导牛樟芝原生质体转化的PEG-CaC12浓度.利用潮霉素抗性、绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)标记和PCR扩增验证拟转化子.结果表明:新鲜的牛樟芝菌丝体在10 mg/mL溶壁酶溶液中,30℃条件下酶解4h,原生质体的获得率为3.55×105个/mL;菌丝体和原生质体在潮霉素B浓度分别为60 μg/mL和40μg/mL时不能生长,最终确定筛选拟转化子的潮霉素B浓度为60 μg/mL;浓度为20％～40％的PEG均可介导牛樟芝原生质体转化,且40％的PEG转化效率最高. 相似文献
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通过不同菌龄、酶液、缓冲液?稳定剂系统、酶解时间、再生培养基组合等条件对木霉T25、T55原生质体制备和再生的影响研究,结果表明,木霉T25、T55原生质体制备和再生的最适条件为:崩溃酶13 mg/mL,0.2 mol/L磷酸缓冲液(PBS),pH5.8和0.6 mol/L NaC l组成的缓冲液稳定系统,木霉T25菌龄为20 h,木霉T55菌龄为26 h的菌丝体在30℃下,酶解3h后,可分别获得原生质体数量9.0×106个/mL、6.33×106个/mL,两菌的再生培养基都是以加入0.5%酵母膏和0.5%泛酸钙的改良Czapek与NaC l的组合培养基,T25与T55的再生率分别为1.150%和0.785%。 相似文献
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【目的】探索制备高纯度茂源链霉菌原生质悬液的条件,为原生质体融合提供支持。【方法】在茂源链霉菌菌丝体一级培养不同时间(4,8,12,16,20,24,28,32,36,40,44,48h)后,称取菌丝体干质量,确定一级培养最佳时间;将一级培养的菌丝体转接培养二级菌丝体,在不同培养时间(13,14.5,16,17.5,19,20.5h)根据原生质体制备率、再生率的综合情况及菌丝体形态显微镜观察结果,确定二级菌丝体的培养时间及培养基中添加甘氨酸的最佳质量浓度(0,2,5,10,20g/L),根据原生质体制备率和再生率确定使用溶菌酶的质量浓度(2,5,8,10,20,50mg/mL)和酶解时间(1,2,3,4,5,6,7,8h),使用不同方法(500r/min离心法与双层18μm和0.45μm滤膜过滤法)分离原生质体,对原生质体分离后的损耗情况进行比较,确定分离条件。【结果】茂源链霉菌一级菌丝体的最佳培养时间为28h;二级菌丝体培养的最佳条件为:在培养基中添加5g/L甘氨酸,培养16h,溶菌酶最适质量浓度为8mg/mL,酶解3~4h;以500r/min离心分离原生质体可以获得较纯净的原生质体悬液;茂源链霉菌原生质体制备率最高达97.82%,再生率最高达9.04%,纯度最高达87.53%。【结论】得到了制备高纯度的茂源链霉菌原生质体悬液的条件。 相似文献
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影响农杆菌介导草菇遗传转化的因素研究 总被引：1，自引：0，他引：1
以草菇Volvariella volvacea菌株V51为受体材料,用农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法转入抗冷冻蛋白基因(afp),探索不同的转化受体、农杆菌种类、乙酰丁香酮(AS)的浓度、共培养的温度、时间等因素对转化效率的影响,并采用PCR及Southern杂交检测afp基因是否整合到草菇的基因组中.结果表明:以D660 nm为0.15的EHA105为侵染的农杆菌菌株,加入200μmol/L AS进行预培养,侵染菌丝球后转入含有AS为200μmol/L的IMA培养基上,28℃,共培养60 h为最佳转化条件.PCR与Southern杂交结果证明afp基因已整合到草菇的基因组中. 相似文献
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研究菌丝体培养时间、酶组合、酶浓度、酶解时间、酶解温度、稳渗剂类型、再生培养方式等对绿色木霉原生质体制备及再生的影响。结果表明,绿色木霉原生质体制备的优化条件为：菌丝体培养60h,用1.5%溶菌酶＋0.5%蜗牛酶的混合酶液,在pH值6.0～6.5,30～35℃,酶解4h,以0.7mol/L甘露醇为稳渗剂,原生质体的产量可达1.68×107个/ml;原生质体再生的优化条件为：PDA为再生培养基,以0.5mol/L蔗糖为稳渗剂进行双层固体培养,原生质体的再生率为6.05%～6.12%。 相似文献
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[目的]优化拮抗木霉gz-2菌株原生质体制备及转化条件,快速、高效获得绿色荧光标记菌株,为哈茨木霉及同类真菌的GFP标记提供参考,并为下一步研究其在不同环境中的定殖动态、分布规律及生防特性等打下基础.[方法]采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化体系,从木霉菌株的菌龄、酶解时间、转化体系中质粒的含量及再生培养基中潮霉素B(HmB)的浓度等方面对哈茨木霉gz-2菌株原生质体制备及转化条件进行优化,获得表达稳定的转化子,并与出发菌株的生长特性进行比较,评价转化效果.[结果]gz-2菌株培养36 h菌丝所形成的原生质体稳定性最好,菌丝体酶解3.5 h获得的原生质体数量最多,达11.67×106个/mL;每240μL转化体系中质粒DNA含量为40μL,得到的转化子数量最多,为8.67个/皿;再生培养基中HmB含量为600μg/mL时可获得稳定的强转化子.[结论]筛选获得1株表达稳定的转化子GFP-gz-2菌株,该菌株在菌落形态、菌丝生长速率及产孢量上与出发菌株gz-2无显著差异,且具有较好的遗传稳定性. 相似文献
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【目的】初步构建裂壳菌L-14原生质体制备和再生体系,为同源菌株原生质体制备研究提供理论依据。【方法】研究细胞壁裂解酶组合、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂种类对原生质体制备产量的影响,以获得最优制备方案,同时筛选适合的原生质体再生培养基。【结果】菌株经YEPG液体培养基培养7 d后,使用0.7 mol/L的NaCl作为渗透压稳定剂配置浓度各为20 mg/mL的崩溃酶+裂解酶复合酶液,在30℃、80 r/min条件下酶解5.5 h后可获得较高的原生质体数量,利用PDS培养基的原生质体再生率可达10.65%,显著高于其它类型培养基。【结论】确定了裂壳菌L-14的高效原生质体制备与再生体系,为该菌株遗传转化体系的建立研究奠定基础。 相似文献
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为建立PEG介导的苹果果生刺盘孢Colletotrichum fructicola的遗传转化体系,以果生刺盘孢SQ06-E的幼嫩菌丝为受体,通过PEG介导的原生质体转化法,将含有潮霉素标记的质粒pCB1003转入果生刺盘孢菌丝的原生质体中;对获得的转化子进行遗传稳定性检测、PCR检测和Southern杂交分析。试验获得果生刺盘孢的最优转化体系为:密度为1×106 mL-1分生孢子在M3S培养基中,28℃、200r/min震荡培养8h;过滤收集菌丝,在质量浓度为0.25g/mL崩溃酶+0.05g/mL溶壁酶的10mL酶解液中加入0.5g湿菌体酶解3h;整个试验的渗透压稳定剂为0.8mol/L KCl。试验共得到76个转化子,转化率为1μg DNA获得3~4个转化子。对转化子的PCR检测和Southern杂交分析都表明hph基因已整合入果生刺盘孢的基因组中。所有转化子在PDA培养基上继代5次后仍能正常生长,说明外源基因hph能在果生刺盘孢中稳定遗传。 相似文献
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为人参根腐病菌的侵染及防治提供可视化的检测和分析手段,通过摸索分生孢子最适萌发时间、酶解液组成、酶解温度、摇床转数及渗透压稳定剂种类,研究人参根腐病菌-尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)原生质体制备技术.结果 表明:将人参尖镰孢菌野生型菌株0083分生孢子在YEPD培养基中培养11h,酶解温度37℃、摇床转数180 r/min,渗透压稳定剂为0.7 mol/L NaC1的条件下,酶解液(崩溃酶、溶菌酶、纤维素酶和蜗牛酶质量浓度分别为0.01,0.03,0.02,0.005 g/mL)酶解0.25 g菌丝时,收获的菌丝体最有利于原生质体的形成和释放,共获得2.8× 107/mL原生质体.用聚乙二醇PEG介导外源DNA随机插入的方法,成功获得具有绿色荧光信号和潮霉素B筛选标记的转化子,转化效率(以单位质量的DNA的转化子数计)为1400/mg.选取转化子FOG1菌株经过6代继代培养后,菌落形态、产孢量和绿色荧光蛋白的表达与菌株0083无明显差异.因此,利用聚乙二醇(PEG)为媒介的遗传转化体系是稳定高效的遗传转化体系. 相似文献
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[目的]探索了玉蕈原生质体的制备与再生的适宜条件。[方法]采用斜面、平板培养基和液体培养基,研究了玉蕈菌丝体酶解时间(1~5 h)、酶解温度(25℃)和菌龄(4~7 d)以及渗稳剂种类(甘露醇、蔗糖、KCl、MgSO4)对玉蕈原生质体制备与再生的影响,优化了玉蕈原生质体制备与再生的条件。[结果]玉蕈原生质体制备与再生的适宜条件是:渗稳剂为0.6 mol/L MgSO4.7H2O,玉蕈菌丝体酶解时间2h,酶解温度25℃,菌龄5 d。在此条件下,玉蕈原生质体的产量最高,达16.7×106个/ml。[结论]该研究为利用原生质体技术进行玉蕈育种奠定了基础。 相似文献
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水稻纹枯病菌原生质体制备与再生条件的优化 总被引：2，自引：0，他引：2
为获得进行水稻纹枯病菌遗传转化所需的高质量原生质体,选用该病菌强致病力菌株GD-118,分别从酶种类、菌龄、酶解时间、酶解温度、酶液pH值和渗透压稳定剂及其浓度6个方面优化了原生质体的制备条件,从酶解时间和渗透压稳定剂及其浓度2个方面优化了原生质体的再生条件。结果表明:优化后的水稻纹枯病菌原生质体制备的最佳条件组合是"纤维素酶+溶菌酶+崩溃酶"组合酶、总酶终质量浓度10mg/mL、菌丝菌龄15h、酶解时间3h、酶解温度35℃、酶液pH5.6、以0.6mol/LMgSO4.7H2O为渗透压稳定剂,此最佳条件组合所制备的原生质体产率高达4.00×107/g;原生质体最佳的再生条件是酶解3h的原生质体在含1.0mol/L甘露醇的再生培养基上26℃时进行培养,在此条件下可获得最佳的再生效果,再生率为39%。 相似文献