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根据已发表的IL-18蛋白cDNA序列保守区设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术从ConA活化的牛外周血单核细胞中扩增到编码牛IL-18蛋白基因,其大小为582 bp。将该基因克隆到pMD18-T载体中,经序列测定表明该基因与gengbank上发表的牛白细胞介素-18基因序列同源性为98%。将该基因从重组pMD-gIL-18质粒中亚克隆到表达载体pET-32 a（＋）质粒中,构建原核表达重组质粒,经酶切和PCR鉴定后表明构建的重组质粒为阳性。 相似文献
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应用RT-PCR技术从罗曼鸡脾淋巴细胞RNA中扩增鸡白细胞介素18(ChIL-18)全基因,并克隆和测序。结果表明,获得了ChIL-18全序列,其大小为597 bp。将其成熟蛋白基因(510 bp)亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下表达融合蛋白(GST-ChIL-18)。SDS-PAGE可检测到分子质量为约46 kDa的融合蛋白,Western blot证实该融合蛋白可与鼠抗鸡IL-18单克隆抗体发生特异性反应。用MTT法测定表明,重组蛋白能明显促进鸡T细胞转化的活性。 相似文献
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串联IL-2的犬瘟热病毒F-H融合基因重组乳酸杆菌的构建与表达 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研发犬瘟热乳酸杆菌载体疫苗,更好地预防犬瘟热,试验采用重叠延伸PCR(SOEPCR)技术扩增IL2-F-H融合基因,将IL2-F-H融合基因亚克隆至穿梭载体pSIP409上,构建pSIP-IL2-F-H重组表达载体,并电转化至植物乳杆菌NC8感受态细胞中,构建串联水貂白细胞介素-2(IL-2)的犬瘟热病毒(CDV)F-H融合基因重组乳酸杆菌;利用SDS-PAGE和Western-blot检测IL2-F-H融合蛋白的表达情况。检测表明,重组乳酸杆菌表达了分子量约为80.16kDa的IL2-F-H融合蛋白,且该融合蛋白能与CDV抗体发生反应,具有反应原性。 相似文献
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根据Ovis aries interleukin(IL-2)序列设计1对引物,用PCR法扩增的目的基因进行克隆,将测序正确的IL-2基因片段和表达载体pPIC9K同时双酶切后相连,构建pPIC9K-IL-2重组表达载体.将线性化的载体pPIC9K-IL-2电转化毕赤酵母GS115,对重组酵母转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,用G418(4g/L)筛选到多拷贝菌株,进行不同条件下甲醇诱导表达.结果表明:经PCR鉴定IL-2基因已整合到酵母基因组中,表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现相对分子质量约为18ku目的蛋白表达条带,本研究成功构建了高效表达重组羊IL-2毕赤酵母菌株,为新型细胞因子佐剂的研发奠定了基础. 相似文献
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【目的】构建人白细胞介素32(IL-32)和IgG4 Fc段的融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOp-tiVEC,建立稳定转染的中华仓鼠卵巢细胞(CHO/DG44)克隆,并检测其重组蛋白的表达。【方法】用PCR方法从脂多糖(LPS)激活的人CD4+T细胞cDNA中扩增出IL-32蛋白基因,并克隆到IgG4(Fc)-pOptiVEC载体上,构建重组质粒IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,并进行酶切和测序鉴定。采用脂质体法,将重组质粒线性化后转染CHO/DG44细胞,进行RT-PCR检测,筛选阳性克隆,并对筛选的阳性克隆进行氨甲喋呤(MTX)加压筛选。利用ProteinG-Agarose亲和层析纯化转染CHO/DG44细胞培养上清液中的融合蛋白IL-32-IgG4(Fc),通过SDS-PAGE、Western-blot对融合蛋白IL-32-IgG4(Fc)的表达和生物学活性进行检测。【结果】PCR扩增获得了长度为564 bp的人IL-32蛋白基因cDNA,经测序与GenBank报道的序列一致。真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,获得了IL-32蛋白基因片段,其长度为564 bp。筛选出了能稳定表达IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆。亲和纯化后的IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,其分子质量约为50.0 ku,与预期结果一致。MTX加压后,IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白的表达量明显升高。【结论】成功构建了人IL-32蛋白融合基因的真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,获得了能够表达具有生物学活性的IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆。 相似文献
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白细胞介素15(Interleukin-15,IL-15)是一个多功能细胞因子,在免疫系统和非免疫系统中都有重要作用,包括刺激T细胞增殖和激活自然杀伤细胞,可引起肌肉萎缩性刺激和肌肉收缩反应.但是,在山羊中该基因的研究尚未见报道.该研究采用RT-PCR方法克隆了山羊肌肉IL-15基因,使用荧光定量的方法构建该基因组织表达谱.序列分析表明山羊IL-15包含486bp全长编码序列,该序列编码162个氨基酸,可形成4-α-螺旋的空间结构,其核苷酸和氨基酸序列与绵羊(97.55%,94.48%)和牛(95.91%,92.02%)的同源性最高,与鸡的同源性最低(48.59%,27.89%).荧光定量检测表明该基因在肌肉和脾中相对表达量最高,在大脑中相对表达量最低.进一步通过PCR方法获得缺失长信号肽的成熟肽蛋白基因序列,重组到原核表达载体pET32a(+)中进行原核表达,获得29kDa的融合蛋白,并通过Western blot方法进行了鉴定.这些结果说明IL-15序列在哺乳动物间是保守的,在山羊中的功能与其他动物相似.成功构建的山羊IL-15表达系统为进一步研究山羊该基因的功能及应用奠定了基础. 相似文献
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猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株N基因的克隆及原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
通过PCR方法扩增猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株核衣壳蛋白(N)基因,然后将重组到pMD18-T载体中的约1174 bp的基因片段亚克隆到PET-32a( )表达载体上,通过酶切及PCR鉴定阳性的重组质粒命名为PET-N,核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,将阳性重组质粒转化BL21(DE3),经IPTG诱导可表达分子量约66 kD的融合蛋白,N基因的表达可为传染性胃肠炎病毒的诊断提供良好的物质材料。 相似文献
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为观察重组MPB83蛋白的免疫活性,揭示该蛋白在牛结核病的诊断和防治中的作用,克隆了牛分枝杆菌MPB83基因,构建了克隆载体pGEM-MPB83和表达载体pET30a-MPB83,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。试验结果表明:牛分枝杆菌MPB83基因体外扩增产物与预期值相符,约600 bp;所构建表达质粒pET30a-MPB83经测序,结果与预期一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以包涵体的形式表达,其分子质量约为26 ku,蛋白表达量占菌体总蛋白的20%;该蛋白经电洗脱纯化后,纯度达95%以上;免疫印迹分析表明,原核表达的融合蛋白可与兔抗牛分枝杆菌多克隆抗体结合,并且具特异的免疫反应性。 相似文献
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根据GenBank发表的鸭白细胞介素-2(IL-2)基因序列设计并合成了特异性引物,以经ConA诱导的广州白鸭外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出长度为360 bp的目的基因片段. 将该基因克隆到pMD18-T simple vector上,经酶切、PCR鉴定及序列测定,结果表明获得了鸭IL-2成熟蛋白基因的完整克隆. 构建的表达质粒pET-IL-2经BamHI、XhoⅠ双酶切鉴定构建正确;经SDS-PAGE分析,在约33 000处出现新的蛋白条带,Western-blotting分析表明,融合蛋白能够被抗His单克隆抗体识别,体外活性检测表明,重组蛋白具有促进淋巴细胞增殖的活性. 相似文献
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4种中药多糖体外抗猪伪狂犬病毒的作用研究 总被引：1，自引：0，他引：1
采用先加多糖与细胞作用后再加病毒(研究多糖对病毒的阻断作用)、先病毒吸附细胞后再加多糖(研究多糖对病毒的抑制作用)和病毒与多糖作用之后再加细胞(研究多糖对病毒的直接杀灭作用)3种不同用药方式,用细胞培养和中性红染色法,测定了板蓝根多糖(IRPS)、黄芪多糖(APS)、牛膝多糖(ARPS)和山药多糖(CYPS)抗猪伪狂犬病毒(PRV)感染的作用效果。结果表明,4种中药多糖对PRV感染均具有显著的阻断作用,其中APS、IRPS还具有抑制和直接杀灭PRV作用。 相似文献
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利用15N示踪技术探讨烟株对氮素肥料的吸收与分配 总被引：12，自引：0，他引：12
通过不同施肥方法的15N示踪技术研究得到:烟株各部位总氮含量以叶片＞茎＞根＞顶杈,烟叶叶片总氮积累量为上部叶＞中部叶＞下部叶的规律.不同施肥方法的氮肥利用率、总氮含量以肥料1/3基施2/3追施处理较高,2/3基施1/3追施处理居中,全部条施处理较低.氮肥利用率以栽后100d左右较高.通过15N的原子百分超的测定结果得到烟株全氮中来源于吸收肥料氮的比例在不同部位的分布是随着叶位的升高而降低,来源于土壤氮的比例随着叶位的升高而增加.不同施肥方法的肥料氮比例以肥料1/3基施2/3追施处理较高,2/3基施1/3追施处理居中,全部条施处理较低. 相似文献
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探讨不同滴灌施肥方式下土壤水、盐、氮和棉花根系的分布,对于滴灌条件下水肥盐的合理调控具有重要意义。在温室条件下应用15N标记尿素进行了不同滴灌施肥方式对土壤水、盐和氮素分布的影响及其与棉花根系分布之间关系的盆栽试验。根据滴灌灌水(W)和施肥(N)的先后顺序,设置4种不同氮肥施用方式:①氮肥在一次灌溉过程的前期施用(N-W);②后期(W-N);③中间(W-N-W);④全程施用(NW)。同时以传统的氮肥直接施入土壤后浇灌(SN-W)为对照。土壤水盐分布明显受灌溉方式的影响,但滴灌条件下不同施肥方式对土壤水盐分布无影响。氮肥滴灌施肥24h后15N主要分布在0~20cm深度土层,但不同施肥方式之间差异明显。NW处理15N在土壤中的垂直分布最深,但水平分布范围较小,且收获后土壤硝态氮在下层大量积累,容易造成淋失。相比之下,N-W处理15N在0~20cm土层分布最均匀,收获后土壤硝态氮的残留量也最小,且棉花根系的生长和分布也优于其它处理。滴灌条件下,氮肥在一次灌溉过程的前期施用有利于提高氮肥利用率,减少氮素的淋洗损失。 相似文献
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耕层水氮调控对小麦利用土壤深层累积硝态氮的影响 总被引：6，自引：2，他引：4
【目的】研究华北平原耕层水氮调控对小麦利用土壤深层累积硝态氮的影响。【方法】设置0、150kgN·hm-22个氮水平和传统灌溉、优化灌溉2种灌水方式,共4个处理:不施氮传统灌溉(N0W1)、不施氮优化灌溉(N0W2)、施氮传统灌溉(N150W1)、施氮优化灌溉(N150W2)。采用15N微区注射技术,布置田间微区试验,将15N标记于110cm土层处。【结果】在本试验条件下,小麦能够吸收注射在110cm处的标记硝态氮;不施氮的传统及优化灌溉、施氮的传统及优化灌溉对深层标记氮的吸收量分别为336.7、900.3、497.4和657.1mg·m-2,利用率分别是8.4%、22.4%、12.4%和16.3%,适当的水氮胁迫有利于小麦对土壤剖面深层标记硝态氮的吸收利用。4个处理80—150cm土层根长密度占总根长密度(0—150cm)的24.4%、32.3%、26.4%和28.2%,氮素不足优化灌溉有利于小麦中下层根系发育。【结论】耕层氮素养分不足及水分适度胁迫促进小麦中下层根系发育,提高小麦对土壤深层硝态氮的利用。 相似文献
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太湖和滇池流域保护地蔬菜氮肥去向研究 总被引：4，自引：0，他引：4
为了研究化肥氮在保护地土壤-蔬菜系统中的当季利用与损失,在浙汀嘉兴和云南昆明15个点位上进行15N田间微区试验.结果表明,保护地莴苣化肥氮当季利用率为8.32%～14.52%,保护地西芹化肥氮当季利用率为6.34%～13.85%,保护地结球生菜化肥氮当季利用率为11.34%.相同土壤、同一种类蔬菜保护地种植中,随着保护地种植年限的增加,蔬菜对化肥氮当季利用率显著降低.莴苣和西芹吸收化肥氮和土壤氮的比例在不同种植年限保护地土壤上差异不显著.当季蔬菜收获后,0～20 cm土层15N丰度和化肥氮残留量显著高于20 cm以下各土层.在保护地莴苣种植系统中,施入土壤中的化肥氮有18.98%～42.5%损失.在保护地西芹种植系统中,有11.7%～18.9%损失.在保护地生菜种植系统中,施入土壤中的化肥氮有16.0%损失. 相似文献
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应用15N示踪研究不同来源氮素在烤烟体内的累积和分配 总被引：16，自引：1，他引：15
【目的】了解水稻土植烟土壤供氮特征及对烤烟氮素累积分配和烟叶品质的影响。【方法】在云南省玉溪市红塔区赵桅村6组烟田和赵桅实验基地设置了田间原位矿化培养试验和大田15N示踪试验,研究在不施氮和施氮90 kg•ha-1条件下,烟株不同生育期水稻土氮素矿化特征,烤烟体内不同来源氮素的累积和分配及烟叶的产量和品质状况。【结果】6组烟田和实验基地土壤供氮能力均较强,在施氮90 kg•ha-1条件下,烟株整个生育期吸收的氮素主要来自于土壤氮,且吸收的土壤氮量及其占总吸氮量的比例随生育期延长和烟叶着生部位升高明显增加。在本试验中,尽管施氮的增产作用不显著,但显著提高了烟叶总氮和烟碱含量,改善了烟叶品质,但由于烟株生育后期土壤供氮过多,上部烟叶存在烟碱含量偏高的问题。【结论】控制烟株生育后期水稻土土壤供氮量,对提高烟叶尤其上部烟叶质量至关重要。 相似文献
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磷对小麦利用土壤深层累积硝态氮的影响 总被引：11，自引：1，他引：10
【目的】在粮食主产区华北平原,研究磷对小麦利用土壤深层累积硝态氮的影响。【方法】采用15N微区注射技术,布置田间微区试验,将15N标记于110 cm土层处。【结果】在本试验条件下,小麦能够利用注射并扩散于100～120 cm土壤层次的标记硝态氮,3种磷水平的利用率分别为6.8%、16.4%和11.2%;耕层施用磷肥有利于小麦地下部根系发育,根长密度及根干重较不施磷均有增加,提高了小麦对深层硝态氮的利用,耕层适量供磷有利于小麦对土壤剖面深层标记硝态氮的吸收利用。【结论】磷促进小麦根系发育,提高小麦对土壤深层累积硝态氮的利用,过量施磷起抑制作用。 相似文献
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不同滴灌施肥方式下棉花根区的水、盐和氮素分布 总被引：6，自引：0，他引：6
【目的】探讨不同滴灌施肥方式下土壤水、盐、氮和棉花根系的分布，对于滴灌条件下水肥盐的合理调控具有重要意义。【方法】在温室条件下应用15N标记尿素进行了不同滴灌施肥方式对土壤水、盐和氮素分布的影响及其与棉花根系分布之间关系的盆栽试验。根据滴灌灌水（W）和施肥（N）的先后顺序，设置4种不同氮肥施用方式：①氮肥在一次灌溉过程的前期施用（N-W）;②后期（W-N）;③中间（W-N-W）;④全程施用（NW）。同时以传统的氮肥直接施入土壤后浇灌（SN-W）为对照。【结果】土壤水盐分布明显受灌溉方式的影响，但滴灌条件下不同施肥方式对土壤水盐分布无影响。氮肥滴灌施肥24 h后15N主要分布在0～20 cm深度土层，但不同施肥方式之间差异明显。NW处理15N在土壤中的垂直分布最深，但水平分布范围较小，且收获后土壤硝态氮在下层大量积累，容易造成淋失。相比之下，N-W处理15N在0～20 cm土层分布最均匀，收获后土壤硝态氮的残留量也最小，且棉花根系的生长和分布也优于其它处理。【结论】滴灌条件下，氮肥在一次灌溉过程的前期施用有利于提高氮肥利用率，减少氮素的淋洗损失。 相似文献