共查询到20条相似文献，搜索用时 78 毫秒
1.
选取马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）代表株（NC＿001616.1）外壳蛋白基因37～281区间，采用化学合成方法合成目标序列，将其连接到原核表达载体pET-32a（+），并转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达出45 kDa融合蛋白，回收后免疫日本大耳白兔制备抗血清。Western Blot分析多克隆抗体特异性良好，后制备25 nm胶体金，标记PVY CP37-281多克隆抗体，制备胶体金免疫层析试纸条。结果表明，试纸条能在15 min内检出PVY,PVY病株汁液检测稀释限度可达106倍（W/V），使用常见复合侵染烟草检测，未出现交叉反应。由此可知，该试纸条操作简便，反应灵敏特异，适用于田间一线及种薯生产中马铃薯Y病毒的检测。 相似文献
2.
马铃薯Y病毒属三种病毒通用型单克隆抗体的鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
构建了马铃薯Y病毒属的大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、三叶草黄脉病毒(Clover yellow vein virus,CLYVV)的原核表达载体pET28-SMV CP、pET28-PVY CP和pET28-CLYVV CP,经IPTG诱导、表达和纯化,获得SMV、PVY和CLYVV的CP蛋白。采用ELISA方法,用9株实验室制备的单克隆抗体对含SMV、PVY、CLYVV的病毒汁液和纯化的重组CP蛋白进行检测分析。结果表明,9株单克隆抗体均识别SMV病毒,2D3、4F9、4G12和6E7单克隆抗体能够识别PVY病毒,4F9和4G12能够识别CLYVV病毒,但PVY、CLYVV病毒与抗体的亲和力低于SMV病毒;对于重组表达的衣壳蛋白:SMV、CLYVV与抗体2D3、4F9、4G12和6E7反应强烈,PVY与4F9和4G12抗体反应稍强。综上,本研究鉴定出能识别SMV、PVY、CLYVV的通用单克隆抗体4F9和4G12。 相似文献
3.
采用RT-PCR方法克隆了黄瓜绿斑驳花叶病毒辽宁分离物(Cucumber green mottle mosaic virus Liaoning isolate, CGMMV-LN)的cp基因并连接到原核表达载体pGEX-4T-3和pET-22b (+)上, 将获得的重组子pGEX-4T-3-CGMMV CP和pET-22b (+)-CGMMV CP转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和W estern blot分析表明, cp基因在大肠杆菌中获得了高效表达, 融合蛋白分子量分别为43.8 kDa和17.3 kDa。将17.3 kDa融合蛋白纯化后免疫家兔, 制备了CGMMV特异性抗血清, 抗原包被间接ELISA法(ACP-ELISA)测定抗血清的效价为1/20 000。 相似文献
4.
利用PCR方法从烟草曲茎病毒(TbCSV) Y3 5分离物的病株中获得AC4基因,将其克隆到原核表达载体pET-30a上获得重组质粒pET-Y35AC4,重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中,IPTG诱导后SDS-PAGE发现,AC4蛋白已在大肠杆菌中获得了表达。利用Ni2+-NTA亲和树脂纯化了AC4重组蛋白,免疫家兔获得AC4蛋白的多克隆抗体。利用免疫胶体金技术对感病烟草中AC4蛋白进行定位发现,TbCSV AC4蛋白主要在细胞质的叶绿体和线粒体中积累。 相似文献
5.
松材线虫类毒过敏原蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 总被引：1，自引：0，他引：1
利用重叠延伸PCR基因合成法,按大肠杆菌偏爱密码子,合成松材线虫类毒过敏原蛋白基因（Bxvap2）,将其连接到原核表达载体pET-29b(+)上。获得的重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明,目的蛋白以可溶形式高效表达,占细菌总蛋白的33.5 %。将表达产物经Ni-NTA亲和柱纯化后进行质谱分析,结果显示纯化的蛋白为BXVAP2蛋白。用制备的BXVAP2蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,间接ELISA测得抗体灵敏度5.4 ng·mL-1（效价为1∶1 360 000）,为进一步研究该蛋白的组织定位及功能,明确该基因在致病过程中的作用机理奠定了基础。 相似文献
6.
将番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)运动蛋白NSm基因克隆到原核表达载体pET-32a (+) 中,利用大肠杆菌系统表达NSm蛋白,以Ni2＋-NTA agarose亲和柱纯化该蛋白与His组氨酸的融合蛋白,免疫家兔制备融合蛋白多克隆抗体。Western blot检测显示,该抗体与NSm重组蛋白以及普通烟病叶中的NSm蛋白具有特异性反应。采用该抗体对TSWV感染的普通烟叶片低温超薄切片进行免疫胶体金标记,透射电镜观察发现特异性金颗粒主要定位在病叶细胞的胞间连丝中,而健康烟草叶片组织中没有金颗粒特异性标记。结果表明,该抗体可用于研究NSm在细胞中的定位。 相似文献
7.
8.
采用RT-PCR方法从甘肃地区引种的切花百合上克隆了百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因与细胞质内含体(cytoplasmic inclusions,Cl)基因的3'端600 bp片段,连接到原核表达载体pET-28a(+)上.构建了融合表达的重组质粒pET-28a-CP-CL200.重组质粒转化大肠杆菌BL21成功表达了融合蛋白CP-C1200.经镍柱亲和层析获得纯化的融合蛋白,进一步用其免疫家兔制备了多克隆抗体.Western Blot结果显示,该多抗与感染LMoV的百合叶片中的病毒CP与CI均发生特异性反应,而对健康百合叶片无反应.用该多抗建立双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测百合叶片样品,相对于RT-PCR方法其灵敏度和特异性均达到了93.3%.研究结果为快速、准确检测百合斑驳病毒的试剂盒研制奠定了基础. 相似文献
9.
从山东省感病的烟草上分离获得了一烟草蚀纹病毒(TEV)分离物,命名为TEV-SD1.根据已报道烟草蚀纹病毒外壳蛋白(coat protein CP)基因序列设计并合成2条引物,通过RT-PCR扩增得到长度约800bp的目的片段.将目的片段与质粒pET-22b( )连接,构建了包含TEV CP基因的原核表达载体pETEV-CP,并导入大肠杆菌BL21中.序列分析表明:TEV-SD1的CP基因全长789bp,编码263个氨基酸;与GenBank中已报道的TEV 5个分离物CP基因相比,核苷酸及推导的氨基酸序列同源性为94.1%～98.6%.37℃培养条件下,BL21/pETEV-CP经IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示,表达的TEV CP融合蛋白的相对分子质量约为33 kDa.以表达的融合蛋白为抗原,免疫家兔,制备的抗血清的效价为1/2048,且具有良好的特异性. 相似文献
10.
采用RT-PCR方法从甘肃地区引种的切花百合上克隆了百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的外壳蛋白(coatprotein,CP)基因与细胞质内含体(cytoplasmic inclusions,CI)基因的3′端600 bp片段,连接到原核表达载体pET-28a(+)上,构建了融合表达的重组质粒pET-28a-CP-CI200。重组质粒转化大肠杆菌BL21成功表达了融合蛋白CP-CI200。经镍柱亲和层析获得纯化的融合蛋白,进一步用其免疫家兔制备了多克隆抗体。Western Blot结果显示,该多抗与感染LMoV的百合叶片中的病毒CP与CI均发生特异性反应,而对健康百合叶片无反应。用该多抗建立双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测百合叶片样品,相对于RT-PCR方法其灵敏度和特异性均达到了93.3%。研究结果为快速、准确检测百合斑驳病毒的试剂盒研制奠定了基础。 相似文献
11.
12.
基于桃小食心虫Carposina sasakii触角转录组测序数据,利用RACE技术克隆了桃小食心虫2个普通气味结合蛋白GOBPs和3个性信息素结合蛋白PBPs全长基因,分别命名为CsasGOBP1、CsasGOBP2、CsasPBP1、CsasPBP2和CsasPBP3。5个基因的核苷酸序列全长分别为617、811、755、795和561bp,开放阅读框分别为504、492、507、492和498bp;蛋白分子量分别为16.6、16.34、16.5、15.76和16.66kDa,等电点分别为4.85、4.92、5.41、4.91和4.93,并具有的6个典型保守的半胱氨酸位点。进化树分析结果表明,5个基因能够与其他鳞翅目昆虫中的GOBPs和PBPs聚在不同的分支。qPCR对其雌雄不同部位表达谱分析发现,5个基因均在雄虫触角中显著表达,在头、胸、腹、足和翅中低量表达。该研究为更好地了解其在桃小食心虫嗅觉识别过程中的作用奠定了基础。 相似文献
13.
表皮蛋白是昆虫表皮的重要组成成份，在昆虫的生长发育过程中起着重要作用，有可能成为农业害虫的防治靶标。双叉犀金龟Trypoxylus dichotomus是铁皮石斛的一种重要害虫，且对其表皮蛋白的研究较少。本文通过研究双叉犀金龟表皮蛋白Td14144的表达纯化及与几丁质结合的相关性质明确Td14144功能的重要性。根据双叉犀金龟转录组测序数据，利用RT-PCR获得表皮蛋白Td14144基因（GenBank登录号：MZ463195），并对其进行生物信息学分析。序列分析表明表皮蛋白Td14144属于CPR家族中RR-2亚族，含有R&R保守结构域；系统进化分析结果表明，Td14144与光肩星天牛Anoplophora glabripennis的AgCP的亲缘关系最近。随后将基因片段与pET-28a载体同源重组构建表达载体pET28a-14144，在大肠杆菌Escherichia coli BL21中原核表达，并使用金属螯合层析进行分离纯化，SDS-PAGE及Western blot验证重组蛋白的表达纯化，成功获得95%以上纯度的Td14144蛋白。利用几丁质结合试验评估Td14144与不同类型几丁质结合的能力，发现Td14144可以与壳聚糖、α-几丁质、β-几丁质和胶体几丁质结合，其中对壳聚糖和α-几丁质的结合能力最强。 相似文献
14.
Elaine C Fitches Howard A Bell Michelle E Powell Emma Back Chiara Sargiotti Robert J Weaver John A Gatehouse 《Pest management science》2010,66(1):74-83
BACKGROUND: The toxicity of a fusion protein, ButalT/GNA, comprising a venom toxin (ButaIT) derived from the red scorpion, Mesobuthus tamulus (F.), and Galanthus nivalis agglutinin (GNA), was evaluated under laboratory conditions against several pest insects. Insecticidal activity was compared with SFI1/GNA, a fusion comprising a venom toxin (SFI1) derived from the European spider Segestria florentina (Rossi) and GNA, which has been previously demonstrated to be effective against lepidopteran and hemipteran pests, and to GNA itself. RESULTS: Injection assays demonstrated that both fusion proteins were toxic to lepidopteran larvae, dipteran adults, coleopteran adults and larvae and dictyopteran nymphs. ButalT/GNA was more toxic than SFI1/GNA in all cases. GNA itself made a minor contribution to toxicity. Oral toxicity of ButalT/GNA towards lepidopteran pests was confirmed against neonate Spodoptera littoralis (Boisd.), where incorporation at 2% dietary protein resulted in 50% mortality and > 85% reduction in growth compared with controls. ButaIT/GNA was orally toxic to Musca domestica L. adults, causing 75% mortality at 1 mg mL?1 in aqueous diets and, at 2 mg g?1 it was orally toxic to Tribolium castaneum (Herbst.), causing 60% mortality and a 90% reduction in growth. CONCLUSIONS: Toxicity of the ButaIT/GNA recombinant fusion protein towards a range of insect pests from different orders was demonstrated by injection bioassays. Feeding bioassays demonstrated the potential use of the ButaIT/GNA fusion protein as an orally active insecticide against lepidopteran, dipteran and coleopteran pests. These experiments provide further evidence that the development of fusion protein technology for the generation of new, biorational, anti‐insect molecules holds significant promise. © Crown Copyright 2009. Reproduced with permission of Her Majesty's Stationery Office. Published by John Wiley & Sons, Ltd. 相似文献
15.
为了明确Cry1Ac蛋白在棉铃虫体内与中肠组织的相互作用,采用重叠PCR方法将Bt-cry1Ac基因和绿色荧光蛋白GFP基因融合,构建含Cry1Ac毒蛋白和绿色荧光蛋白GFP原核表达载体,并在大肠杆菌大量表达。利用荧光显微镜观察发现,表达Cry1Ac-GFP融合蛋白的大肠杆菌在蓝光激发下发出绿色荧光。将含有融合蛋白的菌液拌入人工饲料饲喂3龄棉铃虫幼虫96h,取棉铃虫幼虫中肠做冰冻切片并在荧光显微镜下观察。结果显示,取食含有Cry1Ac-GFP融合蛋白饲料的棉铃虫幼虫中肠能够发出强烈荧光。比较Cry1Ac杀虫蛋白敏感和抗性棉铃虫幼虫中肠的发光部位,敏感棉铃虫幼虫的中肠围食膜已经消失,肠壁细胞发出强烈的荧光,而抗性棉铃虫的围食膜较健全并发出荧光。 相似文献
16.
3种转基因成分检测蛋白芯片的研制 总被引：1，自引：0，他引：1
为研制一种可同时检测3种转基因成分BTCry1Ac蛋白、植酸酶蛋白、BTCry1Ah蛋白的蛋白芯片。本文将3种转基因成分蛋白质的单克隆抗体点于化学修饰的基片上,对芯片的表面修饰材料、点样缓冲液成分、封闭液种类、标记二抗使用浓度、反应时间进行优化,并对芯片检测的特异性、灵敏度进行测定。结果表明:研制芯片的表面为环氧修饰,使用含0.1%BSA和30%甘油的点样缓冲液和含1%BSA的封闭液,每次反应时间为30min时,有最佳反应结果;其检测灵敏度为:BTCry1Ac蛋白35ng/mL、植酸酶蛋白20ng/mL、BTCry1Ah蛋白30ng/mL,信号稳定;本研究建立的抗体蛋白芯片检测法可同时检测3种转基因蛋白,并具有较高的灵敏性、特异性和可靠性。 相似文献
17.
不同氮肥运筹对冬小麦产量、蛋白质及其组分的影响 总被引：8，自引：1，他引：7
2003～2004年在大田节水栽培条件下,研究了3个施氮水平(157.5 kg/hm2、226.5 kg/hm2、295.5kg /hm2)下氮肥一次性底施与分次施用(底肥 拔节期追肥)对两个小麦品种(强筋麦济南17与中筋麦石家庄8号)品质和产量的影响.结果表明:节水栽培条件下不同氮素水平及等量氮肥一次性基施与分次施用两小麦品种产量差异不显著,过量施用氮肥产量反而有所下降;施氮越多,氮肥生产力越低;不同处理对两品种小麦籽粒蛋白质及其各组分的影响也同样没有达到显著水平. 相似文献
18.
首次用PCR方法,自大麦条纹花叶病毒中国株(BSMV-CH)的RNA2(GenBank登录号为:AY789694,未报道)中扩增出外壳蛋白(coat protein,CP)基因,并亚克隆到pMD18-T载体上进行测序分析。结果表明BSMV-CH的CP全长597bp,它与BSMV其它株系CP的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为93.1%~93.8%和91.4%~92.4%;与同属的早熟禾半潜病毒(PSLV)和剪秋罗环斑病毒(LRSV)的核苷酸同源性分别为53.0%和41.8%,氨基酸同源性分别为48.1%和40.0%。根据大麦病毒属病毒已经报道的CP氨基酸序列绘制系统发育树,分析表明分离的各毒株在进化上存在明显地理位置的相关性。把CP基因亚克隆到GST融合表达载体pEGX-6p-1上,优化IPTG诱导终浓度后,在37℃ IPTG终浓度为1.0mmol/L时,融合蛋白GST-CP在大肠杆菌BL21中得到了特异表达。12% SDS-PAGE表明,表达产物大小为48.5kDa,主要以包含体形式存在。对蛋白进行定量后,用冰冷的KCl显色,分离表达的蛋白质特异条带制备抗原,免疫家兔得到抗血清,酶联法(enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA)测定的抗血清效价为1/6 400。用抗血清对感病大麦和健康大麦进行检测,结果表明抗血清有很高特异性。 相似文献
19.
20.
灰飞虱Laodelphax striatellus的囊泡相关膜蛋白相关蛋白B(VAP-B)是内质网膜蛋白家族的蛋白,其主要参与调节囊泡运输、脂类的转运代谢以及未折叠蛋白应答等。本研究克隆了灰飞虱VAP-B基因,构建了pCold-SUMO-VAP-B原核表达载体,再将其转化大肠杆菌感受态细胞Rosetta(DE3),经过IPTG低温诱导表达得到了含有HIS和SUMO标签的VAP-B可溶性蛋白,经过Ni2+-NTA亲和层析柱纯化后的蛋白再利用rTEV酶去除SUMO标签,得到无标签的VAP-B蛋白。通过免疫新西兰雄兔制备了VAP-B的多克隆抗体。Western blot检测结果表明该抗体可以特异性检测到灰飞虱的VAP-B蛋白;同时利用该抗体进行免疫荧光标记,发现其能特异性定位灰飞虱唾液腺内的VAP-B蛋白。研究结果表明制备的VAP-B抗体能够成功用于该蛋白的体内外检测,为阐明VAP-B在灰飞虱体内的关键作用奠定了基础。 相似文献