共查询到10条相似文献，搜索用时 31 毫秒
1.
2.
以嗜酸乳杆菌为受体菌株,将pW425et-Vp4重组质粒电转化入嗜酸乳杆菌,构建猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌,对影响电转化效率的主要因素进行研究,并对构建的乳酸菌进行表达分析.结果表明,在MRS培养基中加入1％甘氨酸+0.3 mol/L蔗糖,电场强度为11 kV/cm,脉冲时间为3.8 ms,电击后细胞复苏3～4 h等条件时,得到较高的转化效率,最高可达3.8×104 CFU/μg DNA. pW425et-Vp4乳酸菌阳性克隆经Western-blot分析表明,其蛋白具有与猪轮状病毒多克隆抗体的反应原性. 相似文献
3.
酸性纤维素酶CBH Ⅱ基因与非抗性穿梭表达载体的重组及在乳酸杆菌的表达及其活性检测 总被引：3，自引：0，他引：3
以SmaI和SphI双酶切pMD18-T-CBHⅡ和以胸苷酸合成酶基因（thymidylate synthase,thyA）为选择压力的非抗生素抗性的穿梭表达载体pW425t,胶回收酸性纤维素酶CBHⅡ基因和载体大片段,并将纯化的CBHⅡ基因和表达载体pW425t大片段进行连接,构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425t-CBHⅡ。将pW425t-CBHⅡ转化至thyA基因缺陷型的乳酸杆菌感受态细胞中,通过质粒提取、酶切鉴定、PCR鉴定、测序分析和生长功能弥补筛选阳性克隆。SDS-PAGE分析,可见约49.6 ku的蛋白,并且刚果红染色显示重组乳酸杆菌可产生明显的水解圈。 相似文献
4.
用Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切克隆质粒pGEM-T-Vp4和(以胸苷酸合成酶基因(thymidylate synthase,thyA)及红霉素基因(Erythromycin)为选择压力的双标记的可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的)质粒载体pW425et,并将纯化回收的Vp4基因亚克隆至表达载体pW425et中,构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425et-VpC,并将pW425et-Vp4分别转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coli X13和乳酸杆菌感受态中,经生长功能弥补筛选阳性克隆,SDS-PAGE分析,可见约87 ku的融合蛋白.Western-blot分析结果表明,该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性. 相似文献
5.
以猪A组轮状病毒mRNA为模板，应用优化的反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）技术，扩增了2331 bp的Vp4全长基因，通过T-A克隆技术，将PCR产物克隆至克隆载体pGEM-T中，构建质粒pGEM-T-Vp4。以SalⅠ和KpnⅠ双酶切pGEM—T—Vp4．和以胸苷酸合成酶基因（thymidylate synthase，thyA）为选择压力的非抗生素抗性的穿梭表达载体pW425t，并将纯化的Vp4基因亚克隆至表达载体pW425t中，构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425t-Vp4。将pW425t-Vp4转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E．coli X13中，通过生长功能弥补筛选阳性克隆，SDS-PAGE分析，可见约87.67Ku融合蛋白。Western blot分析表明，该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性，研究结果为pW425t-Vp4在乳酸菌受体菌株中表达提供科学依据。 相似文献
6.
鸡白痢沙门氏茵外膜蛋白C基因（OmpC）的克隆与表达 总被引：1，自引：0，他引：1
以鸡白痢沙门氏菌基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增得到1 026 bp的OmpC基因片段.将扩增的OmpC基因克隆至大肠杆茵-乳酸茵穿梭表达载体pW425et中,构建原核表达重组质粒pW425et-OmpC.将pW425et-OmpC转化至 thyA基因缺陷型大肠杆茵感受态E.coli X13中.SDS-PAGE分析可见1条约36 ku的融合蛋白.Western blot分析表明,该重组蛋白具有反应原性,本研究结果为pW425et-OmpC在乳酸茵中的表达提供了实验依据. 相似文献
7.
【目的】构建不同组成型启动子的乳酸菌表达载体系统,评价不同启动子驱动外源基因表达的活性,筛选出强表达的启动子,为后续研究乳酸菌作为活菌载体表达外源抗原或功能性蛋白提供理论依据。【方法】以大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体pPG为骨架,将表达载体中启动子序列分别替换为组成型强启动子Pldh、PHH和Phce,利用PCR方法扩增报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和氨苄青霉素抗性基因(Ampr),并在下游多克隆位点中分别插入荧光素酶(LUC)、EGFP和Ampr报告基因,构建9种乳酸菌表达质粒,电转入副干酪乳杆菌HLJ-27感受态细胞,筛选获得9株重组乳酸菌。通过实时荧光定量PCR检测报告基因在重组菌中的mRNA转录水平,利用Western blotting和间接ELISA检测蛋白的表达量,并检测表达蛋白的活性,以评估3个启动子的活性强弱。【结果】PCR成功扩增出大小约720 bp的EGFP基因和850 bp的Ampr基因。Western blotting结果显示,在9株重组乳酸菌中,分别成功表达出了58 ku的LUC蛋白、26 ku的EGFP蛋白和28 ku的Ampr蛋白。实时荧光定量PCR和间... 相似文献
8.
乳酸菌宿主对表达载体的启动子具有高度的选择性,本研究利用PCR技术扩增嗜酸乳杆菌表面蛋白SlpA基因启动子,以诱导型表达载体pSIP409为基本框架删除其诱导型启动子,采用能快速连接的无缝克隆技术将SlpA基因启动子连接到gusA基因上游,获得重组质粒409SlpA电转化至植物乳杆菌NC8中,Western Blot定性测定的gusA表达情况,同时利用MRS-X-gluC培养基特异性显色反应来鉴定阳性重组子表达gusA的活性,为利用该启动子表达外源蛋白研制新型基因工程微生态制剂奠定基础。 相似文献
9.
《中国兽医杂志》2018,(10)
本研究旨在克隆犬细小病毒VP2(CPV-VP2)基因,构建乳酸菌重组表达载体,以乳酸菌表达CPV-VP2目的蛋白,通过重组目的蛋白检测及分析,为CPV乳酸菌口服疫苗研究提供支撑。以PCR方法扩增CPV-VP2编码目的基因,纯化后连接表达载体pMG36e,构建重组乳酸菌表达载体p MG36e-VP2,电转至乳酸球菌MG1363感受态,经PCR鉴定、双酶切鉴定及测序分析,挑选阳性重组菌株,命名为:pMG36e-VP2-MG1363。使用诱导剂Nisin诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting鉴定重组蛋白。结果显示,成功构建重组表达载体pMG36e-VP2,SDS-PAGE,结果表明,重组目的蛋白分子大小约65 kD,与理论值相符; Western Blotting结果表明,重组目的蛋白可被犬源CPV阳性血清所识别,具有良好免疫反应性。本研究用乳酸菌成功表达犬细小病毒蛋白,为该病新型疫苗的研究提供基础。 相似文献
10.
为了解猪轮状病毒(RV)Vp4基因工程乳酸菌口服免疫小鼠是否能产生有效的免疫保护作用,本研究应用电转化技术将猪源A组RV重组质粒pW425et-Vp4转化至嗜酸乳杆菌中,重组菌经SDS-PAGE分析可见约87 ku的重组蛋白.Western blot分析表明该蛋白能与猪RV多克隆抗体反应.大量培养pW425et-Vp4乳酸菌,经离心加入灭菌脱脂乳液给BALB/c小鼠灌服;应用ELISA方法检测血清抗体水平,试剂盒检测肠黏膜SIgA水平,最后进行小鼠免疫保护性试验.结果表明pW425et-Vp4乳酸菌能增强小鼠的黏膜免疫反应,对猪PV强毒株的攻击具有一定的保护作用,为下一步在猪体内进行试验奠定基础. 相似文献