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1.
【目的】光作为一种环境信号,可影响植物的基因表达、酶活性和形态建成。光敏色素互作因子在光信号传导过程中起着重要作用。本研究旨在构建水稻光敏色素互作因子OsPIL15的CRISPR/Cas9表达载体,创制OsPIL15突变体,挖掘水稻功能基因,丰富和完善水稻光信号调控分子机制。【方法】依据CRISPR/Cas9技术原理,设计OsPIL15突变靶点。将所设计靶序列在水稻基因组中进行比对,排除非特异性靶位点,同时使该靶序列含有常用酶切位点,方便后期突变体鉴定。化学合成靶位点寡核苷酸序列并与载体pBUN411连接构建CRISPR/Cas9表达载体,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴,以除草剂抗性标记筛选获得阳性转基因植株。利用酶切法判断T0代转基因植株是否发生突变,结合测序结果分析突变单株的突变基因型。将靶点序列在水稻全基因组中进行比对分析,选择5个与靶序列同源性较高且错配在4 bp以内的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估,分析所设计靶序列特异性。【结果】所构建表达载体成功实现了对OsPIL15的定向编辑,酶切显示在选取的25株T0代转基因植株中获得15株突变体,其中包括5株纯合突变体、6株双等位突变体和4株杂合突变体,共10种不同突变基因型和11个突变株系。突变类型以单碱基插入或缺失为主,同时也得到2种56和66 bp较大片段缺失株系。对部分纯合突变、双等位突变和杂合突变体的T1代植株进行分析,结果表明,T0代产生的突变基因型绝大部分能稳定遗传给下一代。T0代纯合突变体后代为纯合突变单株,仅在株系14纯合突变体后代中检测到1株未突变单株;T0代双等位突变体后代可得到2种纯合突变型和1种双等位突变型;T0代杂合突变体后代则可得到纯合、杂合及未突变3种类型。对T0代未突变植株的后继世代酶切分析显示,62株T1代转基因植株均未发生突变,表明CRISPR/Cas9在T1代转基因阳性植株中未重新发挥基因编辑作用。对20株突变体的5个潜在脱靶位点进行分析,5个潜在脱靶位点均未检测出脱靶效应,表明所设计靶序列具有较高特异性。对选取的3组不同基因型ospil15 T1代突变体表型进行初步观察,结果表明,突变体生育期和分蘖数未出现明显变化,株高极显著下降,籽粒粒长极显著增加,最大增幅达5.69%。【结论】CRISPR/Cas9系统能对OsPIL15进行定向编辑,获得的10种不同突变基因型的ospil15突变体与野生型相比株高极显著降低、籽粒粒长极显著增大。 相似文献
2.
【目的】香味是作物的重要食味品质之一。2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline,2-AP）是主要香味物。BADH2是控制水稻等作物香味性状的关键基因,敲除该基因可以产生香味稻米。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在北京市农林科学院自育的玉米骨干亲本京724上敲除BADH2同源基因,以期获得有香米味道的玉米新种质材料。【方法】利用Ensembl数据库在线BLAST工具,将水稻OsBADH2蛋白序列在拟南芥、水稻和玉米蛋白序列数据库中进行序列比对,获得上述3个物种的BADH基因家族成员,并利用UniProt蛋白数据库中的结构域信息进行验证。进一步使用MEGA软件进行系统进化分析,获得玉米BADH2同源基因作为候选编辑靶标。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理,在候选基因的外显子处设计特异性靶点,并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体。再以玉米自交系京724为受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,通过磷酸甘露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase,PMI）抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在靶基因中产生的突变类型。利用气相色谱质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）检测基因编辑株系T1籽粒中香米主要香味物质2-AP的含量,以确认京724在基因编辑前后2-AP含量的变化。【结果】系统进化分析发现,玉米中存在2个BADH2同源基因,分别命名为ZmBADH2-1和ZmBADH2-2。ZmBADH2-1位于第4染色体,ZmBADH2-2位于第1染色体。2个基因均包含15个外显子和14个内含子,第4外显子间的核苷酸序列高度同源。在2个基因的第4外显子区域设计靶点并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过遗传转化获得28株转基因株系。PCR扩增及测序分析结果显示,其中10株材料的2个ZmBADH2s在靶点区域均发生突变,突变基因型包括双等位突变和多等位突变,突变类型为不同数量的碱基缺失和插入。质谱检测结果显示玉米ZmBADH2双基因突变体籽粒中存在与香稻同样成分的2-AP。随机选取的4个T1代基因编辑株系籽粒中,2-AP平均含量分别为438.29、404.63、348.65和161.82 μg·kg-1,而未经过编辑的京724中未检测到2-AP。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对玉米ZmBADH2-1和ZmBADH2-2同时进行定点敲除,创制出籽粒中具有香米味道的玉米骨干亲本新种质材料。 相似文献
3.
【目的】通过CRISPR/Cas9基因编辑技术遗传改良水稻种质,创制高直链淀粉新材料。【方法】以水稻品种中花11为试验材料,利用CRISPR/Cas9编辑系统对水稻淀粉分支酶（Starch branching enzymes, SBE）基因OsSBE3进行靶向编辑,利用PCR技术鉴定无标记纯合突变体,并测定其淀粉含量。【结果】T0代获得10株突变体株系,T1代获得5个无标记纯合突变株系,其中4个株系（sbe3-22-6、sbe3-25-3、sbe3-25-4、sbe3-25-6）的直链淀粉含量和淀粉直支比显著高于野生型。【结论】本研究创制了高直链淀粉含量的水稻新种质,为水稻品质改良提供了参考。 相似文献
4.
为揭示水稻果糖激酶(OsFRK)家族基因的生物学功能,采用CRISPR/Cas9技术,成功创建了2个已鉴定了的水稻OsFRK家族基因的敲除突变体;获得28株OsFRK1的T0代转基因植株,其转基因阳性率、突变率与纯合突变率分别为100%、46.43%和10.71%;获得14株OsFRK2的T0代转基因植株,其转基因阳性率、突变率与纯合突变率分别为92.86%、92.86%和21.43%;T0代敲除纯合突变体中目的蛋白质的功能结构域均发生不同程度的破坏。 相似文献
5.
《浙江农业学报》2017,(5)
以现有水稻CRISPR/Cas9载体系统为起点,优化改造了相应的载体及其构建方法,实现了两步法构建基因敲除载体。利用新的载体和方法,针对水稻日本晴(Oryza sativa L.spp.Japonica cv.Nipponbare)D3基因的3个靶向位点分别构建了相应的CRISPR/Cas9载体,并通过农杆菌介导的遗传转化成功获得一系列转基因植株。T_0代转基因植株靶位点测序结果显示,靶位点DDRC1包括5种突变类型,植株的突变率为35.48%;靶位点DDRC2包括5种突变类型,植株的突变率为25.00%;靶位点DDRC3包括1种突变类型,植株的突变率为20.00%。利用T_1代纯合突变植株,进一步研究了所得纯合突变体的株高、分蘖数表型与CRISPR/Cas9编辑后基因型之间的关系,探讨了CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率、位置效应和突变类型等特点,为进一步利用CRISPR/Cas9系统发展具有不同农艺性状的水稻种质材料提供了参考。 相似文献
6.
《福建农业学报》2020,(5)
【目的】利用基因编辑技术编辑水稻香味基因,改良优质粳稻香味性状。【方法】构建CRISPR/Cas9-BADH基因编辑载体,转化优质粳稻品种龙稻18、龙稻24和秀水134,测序鉴定3个优质粳稻品种的香味基因Betaine aldehyde dehydrogenase 2(Badh2)突变体并分析潜在脱靶效应,利用气相色谱-质谱联用技术测定不同遗传背景badh2突变体稻米的2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline, 2AP)含量。【结果】转化获得的30株T_0代中有24株为badh2突变体,其中53.33%为杂合型突变,16.67%为纯合型突变,10%为双等位突变类型。T_1代非转基因植株内共鉴定获得7种纯合badh2突变基因型。在5个预测位置上未检测到脱靶事件的发生,说明设计的sgRNA具有高度特异性。所有Badh2移码突变体稻米的2AP含量都达到或高于稻花香的水平,但不同品种来源的badh2突变体间2AP含量差异极显著。【结论】本研究提供了一个能够高效诱导水稻Badh2突变的CRISPR/Cas9定向编辑靶点,改良了生产上大面积推广的3个优质水稻品种龙稻18、龙稻24和秀水134的香味性状,发现了不同遗传背景的水稻badh2突变体间2AP含量差异显著,为基于定向编辑Badh2基因的方法培育适合生产应用的香稻品种、提高育种效率提供科学依据。 相似文献
7.
【目的】植物特异性 IQD 家族蛋白质是一类植物特有的钙调素结合靶蛋白,在植物的生物防
御和发育调节中发挥重要作用。前期酵母双杂筛选试验表明,Pik-H4 与 OsIQD1 存在互作关系,为进一步
揭示 OsIQD1 在水稻抗稻瘟病中的生物学功能,利用 CRISPR/Cas9 编辑技术对 OsIQD1 基因进行定点编辑。
【方法】通过序列比对获得水稻 OsIQD1。在 OsIQD1 第 1 外显子和第 5 外显子（DUF4005 结构域）区域设计 2
个 20 bp 的编辑靶点,将 2 个靶点核苷酸片段克隆至 pRGEB32 载体,获得 pRGEB32-OsIQD1-gRNA 载体,利用
农杆菌介导法转化水稻 Pik-H4 NIL 愈伤组织,经再生培养、潮霉素检测获得转基因阳性植株,并对 T0 代转基
因植株靶点区域序列进行 PCR 和测序,分析 osiqd1 的突变类型。【结果】转基因再生植株经过对抗潮霉素基因
HPT Ⅱ的 PCR 鉴定,获得 30 株阳性株系。对 T0 代植株靶点附近序列的测序结果表明,OsIQD1 基因被成功编
辑,两个位点的编辑效率分别为 21.67% 和 26.67%,其中,靶点 2 区域有 1 个纯合突变株系。【结论】研究结
果为进一步利用 osiqd1 突变体开展其参与钙离子 / 钙调素信号转导通路的机制研究提供了遗传材料,初步推定
OsIQD1 参与植物的基础免疫反应。 相似文献
8.
《西南农业学报》2020,(5)
【目的】在植物转基因研究中,使用选择标记基因(Selectable Marker Gene, SMG)使得转化子的筛选更准确便利,但存在SMG的转基因植株可能对人类健康及生态环境造成潜在危害,这也限制了转基因植物商业化的应用前景。因此去除转基因植物中的SMG十分必要。【方法】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对水稻转基因中常用的SMG潮霉素抗性基因(hygromycin phosphotransferase II,hptII)设计构建了编辑载体,利用农杆菌(LBA4404)介导的遗传转化方法转化水稻日本晴,得到转化植株,再将转化植株与带有hptII基因的植株进行杂交。【结果】通过遗传转化及分子鉴定,本研究得到了18株可用于编辑hptII基因的转化植株,进一步对转化植株与带有hptII基因的植株杂交的F_1代进行检测,经PCR检测及测序验证表明,在杂交F_1代植株中,hptII基因的DNA确有编辑发生,包括碱基缺失、替换以及插入等,使得hptII基因不能成功转录。【结论】利用CRISPR/Cas9技术,成功获得了删除hptII基因的转基因水稻。这为植物转基因研究实现无选择标记基因(marker-free)奠定了基础。 相似文献
9.
通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对粳稻品种‘嘉花1号’的谷蛋白基因GluA3(LOC_Os03 g31360)进行编辑获得转基因T0代植株,并对其衍生的T1代28个单株进行鉴定分析。结果表明:获得了两种类型的GluA3编辑突变植株;突变体的未成熟胚乳中GluA3 RNA表达水平明显下调;突变体谷蛋白含量呈下降趋势。对‘嘉花1号’野生型及突变体水稻农艺性状考查发现,突变体水稻穗数和产量下降明显。试验表明,CRISPR/Cas9技术可有效编辑水稻谷蛋白基因,可为水稻谷蛋白品质育种提供理论指导。 相似文献
10.
【目的】OsIAA11参与的生长素信号途径在水稻生长发育阶段和环境因子响应中起重要作用,并影响水稻生育后期的产量形成过程。利用CRISPR/Cas9编辑技术对粳稻中花11（ZH11）的OsIAA11序列进行编辑,获得OsIAA11突变植株,通过对突变植株的农艺性状指标开展田间调查分析,以期探索OsIAA11突变对水稻产量构成因子的影响。【方法】依据CRISPR/Cas9编辑原理,在OsIAA11第1和第2外显子区域设计2个20 bp的编辑靶点,并在水稻基因组数据库中比对分析靶点序列,排除非特异性编辑,将2个靶点核苷酸片段分别与pYLgRNA-U6a和pYLgRNA-U6b载体连接,通过2次PCR扩增,得到含特异性连接接头的U6a-IAA11-T1和U6b-IAA11-T2表达盒,再将2个表达盒连接到pYLCRISPR/Cas9-MT载体上,获得pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12重组表达载体,利用农杆菌介导法转化ZH11愈伤组织,再生培养得到T0代转基因幼苗,通过PCR扩增潮霉素抗性基因获得阳性株系。对T2代植株的靶点区域序列进行PCR扩增和测序分析,鉴定OsIAA11突变类型,并考察突变植株的田间农艺性状。【结果】pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12表达载体成功转化ZH11水稻愈伤组织,并获得25株转基因再生植株,经潮霉素鉴定得到20株阳性株系,从阳性植株的T2后代中鉴定出17种在2个靶点区域都发生编辑的纯合突变类型植株,除osiaa11-20-1、osiaa11-21-2、osiaa11-23和osiaa11-25在第1个靶点、以及osiaa11-22-2在第2个靶点是单碱基插入突变外,其他突变植株在第1个靶点为小片段缺失突变,在第2个靶点多为单碱基缺失突变。对17种不同基因型osiaa11突变体的农艺性状调查表明,与野生型水稻相比,突变体水稻的株高、有效穗数、穗长、穗粒数、结实率、千粒重、收获指数以及谷草比等性状未发生明显变化,而分蘖成穗率则显著降低,表明无效分蘖增多。【结论】采用CRISPR/Cas9技术对OsIAA11序列进行编辑,得到17种不同基因型的osiaa11突变体水稻,其分蘖成穗率显著降低,无效分蘖变多,表明OsIAA11参与了生长素对分蘖芽发生的调节代谢。 相似文献
11.
土壤缓慢水分胁迫下柽柳植物内源激素的变化 总被引：20，自引：0，他引：20
多花柽柳（Tamarix.hohenackeri Bge)、长穗柽柳(T.elongata Ledeb)在土壤缓慢水分胁迫条件下,在干旱处理前期,水分胁迫程度较轻时,脱落酸（ABA）含量增加不多,至干旱处理后期水分胁迫程度较严重,ABA含量急剧增加。两种柽柳的吲哚乙酸（IAA）的含量与对照相比均明显增加,赤霉素（GA）含量均增加。 相似文献
12.
腐殖酸是一类成分复杂的天然有机物质,存在于土壤、煤炭、湖泊、河流及海洋中,传统方法生产腐殖酸主要是采用氨水直接氨化法、碳化氨水法和堆沤发酵法等,现采用碱化酸析法生产腐殖酸,研究其生产的主要设备、操作要点、技术参数及使用方法。结果表明:采用碱化酸析法生产腐殖酸,产品含量高,使用方便,且便于保存。 相似文献
13.
5种酚酸类物质对小麦幼苗的化感作用研究 总被引：2，自引：0，他引：2
为了研究5种酚酸类物质对小麦幼苗生长和生理指标的影响,测定了不同质量浓度的阿魏酸、对香豆酸、丁香酸、对羟基苯甲酸、香草酸5种酚酸类物质处理后小麦幼苗的苗高、根长、CAT活性、POD活性等形态、生理指标,为小麦与药用植物轮作的合理性提供依据。结果表明,小麦幼苗的可溶性糖含量均有所升高,50.00 mg/L对香豆酸和0.01、0.10、1.00 mg/L对羟基苯甲酸处理组分别比空白对照高18.79%、42.60%、42.69%、26.57%,均达显著水平;阿魏酸、对香豆酸和香草酸降低了小麦幼苗的苗高和主根长,对羟基苯甲酸增加了幼苗的主根长,但均不显著;对香豆酸处理组幼苗的可溶性蛋白含量、CAT活性、POD活性以及SOD活性均有所降低,而丁香酸处理组幼苗的可溶性蛋白含量、CAT活性、POD活性均有所升高,0.01、0.10、10.00、100.00 mg/L丁香酸处理组幼苗的可溶性蛋白含量分别比对照(蒸馏水)显著增加9.63%、11.22%、11.50%、8.13%。香草酸处理组幼苗的可溶性蛋白含量、CAT活性、SOD活性也有所增加。从研究结果可以看出,阿魏酸、对香豆酸对小麦幼苗有一定的化感抑制作用,丁香酸、对羟基苯甲酸和香草酸有一定的促进作用,但它们的化感指数均不大。 相似文献
14.
夏枯草不同器官主要药用成分积累规律 总被引：4，自引：0，他引：4
为揭示夏枯草不同器官主要药用成分的积累规律,采用紫外-可见分光光度法测定夏枯草不同器官不同时期总黄酮、熊果酸、齐墩果酸、迷迭香酸和咖啡酸含量。结果表明,总黄酮、熊果酸、齐墩果酸、迷迭香酸和咖啡酸在夏枯草根、茎、叶和花中均有分布,但含量不同;总黄酮在叶中含量最高,齐墩果酸在根中含量最高;熊果酸、迷迭香酸和咖啡酸在花中含量最高。总黄酮、熊果酸、齐墩果酸、迷迭香酸和咖啡酸在同一器官不同生长时期含量不同。研究认为夏枯草根、茎、叶、花中都分布有药用成分,可全草入药,并且在终花期至果实成熟期各部位药用成分含量较高,可在此期间采收。 相似文献
15.
对74份木瓜属种质资源果实的绿原酸、齐墩果酸、熊果酸和总黄酮等有效成分含量进行了测定,结果表明:光皮木瓜中未检测到绿原酸,齐墩果酸和熊果酸含量分别为0.106～0.108 mg/g、0.694～0.840mg/g,总黄酮含量为16.135～28.182 mg/g;日本木瓜绿原酸含量为0.117～1.694 mg/g,齐墩果酸和熊果酸含量分别为0.441～0.911 mg/g、0.366～0.487 mg/g,总黄酮含量为16.424～19.804 mg/g;皱皮木瓜绿原酸含量为0.096～2.746 mg/g,齐墩果酸和熊果酸含量分别为0.360～1.836 mg/g、0.110～1.604 mg/g,总黄酮含量为6.661～40.839 mg/g;毛叶木瓜绿原酸含量为0.297～4.017 mg/g,齐墩果酸和熊果酸含量分别为0.311～1.520 mg/g、0.031～1.345 mg/g,总黄酮含量为8.428～39.517 mg/g。 相似文献
16.
腐殖质对丁草胺在水中的光解效应研究 总被引：9，自引：0，他引：9
以太阳光,氙灯,高压汞灯为光源,研究胡敏酸,Ｆｕ啡酸对水中丁草胺光分解的影响。结果表明,在高压汞灯和氙灯光辐射下,ＨＡ和ＦＡ均使丁草胺的光解速度减缓,而在自然光下ＨＡ,ＦＡ却使丁草胺光解速度加快。 相似文献
17.
日粮添加亚油酸和二十二碳六烯酸对奶牛瘤胃原虫奇数碳链脂肪酸和支链脂肪酸的影响 总被引：1，自引：1，他引：0
试验选取4头安装有永久性瘤胃、十二指肠和回肠瘘管的荷斯坦泌乳奶牛,采用4×4拉丁方试验设计,研究日粮中添加亚油酸(LA)和二十二碳六烯酸(DHA)对瘤胃原虫中奇数碳链脂肪酸和支链脂肪酸的影响.试验结果表明:奇数碳链脂肪酸和支链脂肪酸(OBCFA)是原虫脂肪酸的重要组成部分,与对照组相比,日粮中单独添加LA或DHA对瘤胃原虫中主要OBCFA的含量无显著影响,而当LA和DHA协同添加时C15∶0和C17∶0的含量显著降低(P0.05),但对异构酸和反异构酸的含量无显著影响. 相似文献
18.
人参中焦谷氨酸的分离及其在加工中的转化 总被引：1，自引：0，他引：1
首次从中国红参中提取分离鉴定出焦谷氨酸，其含量测定表明，从高到低依次是群人参＞红参＞大力参＞生晒参；在红参不同部位分布依次为须根＞根茎＞侧根＞主根。通过试验阐明了焦谷氨酸在不同加工方法中转化机理，主要是人参中的谷氨酸与焦谷氨酸互为可逆反应所致，由于不同加工方法处理条件不同，焦谷氨酸与谷氨酸达到某一相对稳定状态。 相似文献
19.
顺反混合菊酸(顺/反=43/57),用氢氧化钠-乙二醇处理,反应产物经~1HNMR 测定表明:反式异构体的含量可达95%,反应收率为86%。 相似文献
20.
48份红花材料种子含油率及其籽油脂肪酸分析 总被引：3，自引：0，他引：3
对川红一号、简阳红花以及来自32个国家的共48份红花材料种子含油率及其籽油脂肪酸组成及含量进行测定,并开展了红花主要农艺性状与种子含油率、籽油中各脂肪酸含量间相关分析。结果表明,来自加拿大的PI559909和法国的PI253529的种子含油率最高,分别达32.68%和31.60%。来自加拿大的PI559909和奥地利的PI253518亚油酸含量最高,分别为83.79%和81.67%。孟加拉国的PI401479油酸含量最高,达53.10%。综合单株种子产量、种子含油率和亚油酸、油酸含量等几个重要指标,发现以加拿大PI559909和匈牙利的PI312275表现较好。试验结果还表明,种子含油率与株高呈极显著负相关和负偏相关,与花期呈显著负相关,与棕榈酸含量呈显著负偏相关。油酸的含量与株高呈显著负相关和负偏相关。亚油酸含量与油酸含量呈极显著负相关,而亚油酸含量与棕榈酸含量呈极显著正相关。棕榈酸含量分别与亚油酸含量和油酸含量呈极显著正偏相关,油酸含量则与亚油酸含量呈极显著负偏相关。 相似文献