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为探讨靶向核糖体进入位点(IRES)区域的siRNA在真核细胞中对FMDV复制的抑制作用,对FMDV WFL株的IRES序列进行了保守性分析和二级结构预测,选择了靶向IRES保守的功能核心区的病毒复制原点附近的2个干扰靶位,设计并构建了shRNA真核表达质粒,转染到IBRS-2细胞后感染FMDV,通过双抗夹心ELISA和real-timeRT-PCR检测FMDV复制情况,结果表明,针对IRES区域的RNAi能够在一定程度上抑制FMDV的复制。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2015,(11)
内部核糖体进入位点(IRES)是微RNA病毒起始蛋白合成的关键元件。为研究IRES元件在病毒致病过程中的作用,本研究以口蹄疫病毒(FMDV)为模型,在已建立的O型FMDV c DNA感染性克隆的基础上,利用融合PCR的方法以脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES替换FMDV的IRES,构建并拯救出含有EMCV IRES的嵌合病毒(r FMDV-EIRES)。一步生长曲线结果显示r FMDV-EIRES无论是在鼠源BHK-21细胞还是在猪源IBRS-2细胞中的复制能力均与亲本病毒相近。另外,r FMDV-EIRES对乳鼠的致病力与亲本病毒也相同。以上研究结果表明,虽然EMCV IRES与FMDV IRES一级序列存在显著差异,但二者的置换并不影响FMDV的复制和毒力,该结果有助于加深IRES在微RNA病毒复制和致病性功能的认识。 相似文献
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探究RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对口蹄疫病毒复制的抑制作用,本研究选取O型口蹄疫病毒ON株,以ON株口蹄疫病毒3C、3D、VP1蛋白基因作为靶基因。对每一个靶基因设计并合成两对小片段发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)引物,分别命名为VP1-1、VP1-2、3C-1、3C-2、3D-1、3D-2,依据RNAi的原理构建6个shRNA的重组表达质粒,转染BHK21细胞后并接种ON口蹄疫病毒,通过对TCID50的测定和使用实时荧光定量PCR的检测筛选出能高效抑制ON口蹄疫病毒复制的重组质粒;将能够高效抑制ON口蹄疫病毒复制的重组质粒进行慢病毒的制备并筛选稳定的BHK21细胞系,通过对TCID50的测定和使用实时荧光定量PCR的检测慢病毒干扰载体对ON口蹄疫病毒复制的抑制作用。结果显示,构建的6个shRNA重组表达质粒抑制率均在71.5%~93.2%,其中PLKO.1-VP1-2和PLKO.1-3D-1的抑制效果最为明显,分别为93.2%和90.8%;慢病毒干扰载体PLKO.1-VP1-2和PLKO.1-3D-1的抑制效率在88.3%~95.49%。对研究结果表明,在细胞的水平上挑选出有效抑制ON口蹄疫病毒复制的基因干扰片段,并成功制备慢病毒干扰载体,为后续抗口蹄疫病毒的转基因羊生产培育奠定了实验基础。 相似文献
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为筛选出可抑制多种血清型口蹄疫病毒(FMDV)的小干扰RNA(siRNA),本试验通过多血清型口蹄疫病毒序列比对与siRNA设计分析，筛选出潜在抗多血清型siRNA位点；通过体外合成A型、O型和Asia I型病毒部分基因序列，制备绿色荧光蛋白(GPF)基因融合表达载体；将化学合成的siRNA与融合表达载体共转染，通过GFP观察、Western blot和实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)方法检验目标siRNA对融合基因的抑制效率。生物信息分析发现，多血清型口蹄疫病毒3C基因高度保守并存在潜在siRNA作用靶位，GFP-3C融合表达载体成功构建，与化学合成的siRNA1-3C共转染293T细胞，GFP观察发现，siRNA1-3C可有效抑制来源于A型、O型和Asia I型3C基因的GFP-3C荧光信号且持续时间达72 h, Western blot检测证实此结果。qRT-PCR检测发现，siRNA1-3C对3个GFP-3C融合基因转录水平抑制效率超85%,且作用可维持72 h。本试验利用GFP作为筛选标记成功筛选出1个作用于FMDV 3C基因的siRNA,为开发多血清型口蹄疫抑制剂... 相似文献
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《中国预防兽医学报》2020,(5)
正真核生物的蛋白翻译,依赖于m RNA 5'端的帽子结构。而口蹄疫病毒(FMDV)、脊髓灰质炎病毒、人丙型肝炎病毒等一些RNA病毒,其蛋白的翻译是通过病毒自身的内部核糖体进入位点(Internal ribosomal entry site, IRES)以非帽依赖性方式完成的,即IRES借助宿主细胞的翻译起始因子和反式作用因子招募40S和60S核糖体形成翻译起始复合 相似文献
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《中国预防兽医学报》2020,(4)
口蹄疫病毒(FMDV)内部核糖体进入位点(IRES)是该病毒复制的一种重要RNA元件,介导病毒蛋白的翻译起始,其过程需要多种宿主细胞因子的参与。为筛选与IRES相互作用的宿主蛋白,本研究以生物素标记的FMDV IRES RNA为"诱饵",通过RNA pulldown试验结合质谱分析筛选得到4种有可能与IRES存在相互作用的宿主蛋白,包括eEF1a、RPS3、DDX5和DDX3X。对筛选获得的宿主蛋白评分分析后,针对丰度高的宿主蛋白eEF1a进行IRES RNA pulldown分析以及western blot检测,结果显示eEF1a蛋白与FMDV IRES存在相互作用。激光共聚焦显微镜观察显示,FMDV感染宿主细胞后eEF1a蛋白从细胞核转移至细胞质中,并与FMDV基因组RNA在细胞质中共定位。此外,western blot检测显示,瞬时过表达eEF1a蛋白显著抑制FMDV在BHK-21细胞中的复制。本研究首次证实了宿主蛋白eEF1a能够与FMDV IRES RNA元件特异性结合,并抑制FMDV的复制,为深入了解IRES介导的翻译起始机制以及FMDV在宿主体内复制的分子调控机制奠定了基础。 相似文献
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口蹄疫病毒基因组结构及其功能 总被引：9，自引：0，他引：9
口蹄疫病毒的基因组结构和功能是开展口蹄疫其他研究如鉴别诊断、新型疫苗研制和疫源追踪等工作的基础。口蹄疫病毒的基因组由5′UTR、ORF和3′UTR及Po ly(A)组成,全长约8 500 nt。VPg可能充当RNA合成引物的作用, 5′UTR 内的Poly(C)和内部核糖体进入位点(internalribosomaentrysite, IRES)是当前研究的热点之一。Poly(C)可能与病毒的感染性有关,IRES 对翻译的起始有重要作用。一般认为Poly(A)越长,病毒的感染性越强。病毒的ORF包括P1、P2、P3基因。L、P2、P3研究的相对较少,其中3A与病毒的宿主嗜性有关,3D为RNA聚合酶,可作为免疫和自然感染动物的鉴别诊断抗原。P1 为口蹄疫病毒的抗原结构,是研究口蹄疫免疫机制和新型疫苗的基础。VP1 可以作为分子流行病学调查,被很多国家所采用。 相似文献
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OBJECTIVE: To evaluate and implement rapid molecular diagnostic techniques for the detection of foot and mouth disease virus (FMDV) suitable for use in Australia. DESIGN: Two PCR TaqMan assays targeted to the FMDV internal ribosome entry site or the 3D polymerase coding region for the rapid detection of FMDV were evaluated using non-infectious materials to determine the test most appropriate for implementation as part of Australia's national preparedness for the rapid detection and diagnosis of FMD outbreaks. RESULTS: Two published tests (PCR TaqMan assays targeted to the FMDV IRES region or the FMDV 3D polymerase coding region) were evaluated for their ability to detect FMDV genetic material in non-infectious FMDV ELISA antigen stocks held at Australian Animal Health Laboratory. Both tests were able to detect FMDV genetic material from strains O1 Manisa, O-3039, A22, A24, A Malaysia, C, Asia 1 and SAT 1, 2 and 3. With the exception of Asia 1, the TaqMan assay targeted to the FMD 3D polymerase coding region had Ct values equal to or lower than for the TaqMan assay targeted to the IRES region suggesting that this test may provide broader serotype detection and sensitivity. However, the TaqMan assay directed to the FMDV IRES is the only one to date to have undergone substantial evaluation using clinical samples collected during an outbreak. The greatest differences observed were for O-3039, SAT 1, and 3. CONCLUSION: Given the ease of setting up both tests, AAHL currently runs both tests on highly suspect FMD investigations to provide independent confirmation of the absence of FMDV because the tests are focused on two independent regions of the FMDV genome. These tests add substantially to Australia's preparedness for FMD diagnosis complementing the already well-established virus isolation and antigen capture ELISA tests for index case diagnosis of FMD in Australia. 相似文献
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为验证Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)基因组5'非编码区(UTR)是否含有内部核糖体进入位点元件,本研究利用体外翻译系统,结合细胞转染试验对DHV-Ⅰ5'UTR的结构和功能进行分析。结果表明:DHV-Ⅰ的5'UTR具有典型的内部核糖体结合元件(IRES)功能,能够内部起始下游蛋白的翻译,IRES元件位于360 nt～620 nt,共260个碱基。对IRES的二级结构进行预测和分析显示,DHV-ⅠIRES的结构与丙型肝炎病毒相似。利用定点突变方法,破坏IRES的颈环结构(SL)1、2以及IIIe区的关键性核苷酸,检测该突变对IRES功能的影响。研究结果显示,SL1、SL2和IIIe结构的破坏使得DHV-ⅠIRES的功能消失,表明SL1、SL2和IIIe区是维持IRES启动内部翻译起始功能的关键性结构域。 相似文献
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利用RNAi抑制口蹄疫病毒的复制 总被引：2，自引：0，他引：2
根据口蹄疫病毒 IRES和 L 串联序列两侧的保守区域设计了 2个引物 ,利用 RT- PCR和 PCR方法扩增出该串联序列 ,并进行了测序。测序结果表明 ,扩增产物与 Gen Bank上相应的序列具有很高的序列同源性 (大于 99% )。在测序的基础上 ,选择了 L 基因上的 1个靶位点 (位于启始密码子下游第 2 2 9nt后 2 1 nt长的序列 ) ,合成了 si RNA表达盒SEC- L2 2 9。细胞单层长成 5 0 %～ 70 %时 ,将纯化的 SEC- L2 2 9转染到 BHK细胞中 ,转染 4 h后用高感染复数 FMDV接种 ,2 4 h后用间接免疫荧光方法对口蹄疫病毒在 BHK细胞中的复制进行检测。研究结果表明 ,SEC- L 2 2 9极大地抑制了口蹄疫病毒在 BHK细胞中的复制 ,且该抑制作用具有序列特异性 ,并降低了 BHK细胞的死亡率。另外 ,2 5 ng和5 0 ng SEC- L2 2 9处理组间对病毒复制的抑制作用差异不明显 ,可能是病毒基因组发生了突变。本试验表明 ,利用 PCR方法合成的 SEC在 BHK细胞中能特异性地抑制 FMDV的复制 ,RNAi技术可能为防治口蹄疫提供一个新的途径 相似文献
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通过PCR和RT-PCR扩增出目的基因,将FMDV P1和3C基因通过IRES串联,构建出重组腺病毒穿梭质粒,在BJ5173细菌中同源重组获得同源重组腺病毒质粒,转化XL1-Gold超级感受态细胞以扩大培养,PacⅠ酶切后转染AD-293细胞,纯化获得了重组腺病毒。该重组腺病毒于AD-293细胞连续传代培养,初步浓缩后TCID50为1010.71/mL。应用O型口蹄疫病毒阳性血清进行间接荧光抗体试验,病毒感染的AD-293细胞可见清晰荧光,证明该重组腺病毒对目的基因进行了成功的表达,为FMDVP1/3C基因共表达腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
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In order to use nucleotide sequencing for foot-and-mouth disease virus (FMDV) diagnostic subtyping, it is necessary to shorten the time required for preparation of suitable templates. The time required for analysis was reduced by use of the viral RNA present in the total RNA extract of tissue from infected cattle as a template in the Sanger sequencing reaction. Results are now available within 3 days. The sequences determined encode capsid protein VP1 and therefore major neutralization epitopes. Such a sequence of FMDV O1Kaufbeuren, cultured in the animal, was compared with those of tissue-cultured viruses. They did not differ. It was concluded that a change of virus culture conditions does not necessarily account for antigenic variation. 相似文献
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Wei Cong Hong Jin Chengda Jiang Weiyao Yan Mingqiu Liu Jiulian Chen Xiaoping Zuo Zhaoxin Zheng 《Veterinary research》2010,41(3)
In this study, specific sequences within three genes (3D, VP4 and 2B) of the foot-and-mouth disease virus (FMDV) genome were determined to be effective RNAi targets. These sequences are highly conserved among different serotype viruses based on sequence analysis. Small interfering RNA (siRNA)-expressing plasmids (p3D-NT19, p3D-NT56, pVP4-NT19, pVP4-NT65 and p2B-NT25) were constructed to express siRNA targeting 3D, VP4 and 2B, respectively. The antiviral potential of these siRNA for various FMDV isolates was investigated in baby hamster kidney (BHK-21) cells and suckling mice. The results show that these siRNA inhibited virus yield 10- to 300-fold for different FMDV isolates of serotype O and serotype Asia I at 48 h post infection in BHK-21 cells compared to control cells. In suckling mice, p3D-NT56 and p2B-NT25 delayed the death of mice. Twenty percent to 40% of the animals that received a single siRNA dose survived 5 days post infection with serotype O or serotype Asia I. We used an attenuated Salmonella choleraesuis (C500) vaccine strain, to carry the plasmid that expresses siRNA directed against the polymerase gene 3D (p3D-NT56) of FMDV. We used guinea pigs to evaluate the inhibitory effects of recombinant S. cho (p3D-NT56/S. cho) on FMDV infection. The results show that 80% of guinea pigs inoculated with 109 CFU of p3D-NT56/S. cho and challenged 36 h later with 50 ID50 of homologous FMDV were protected. We also measured the antiviral activity of p3D-NT56/S. cho in swine. The results indicate that 100% of the animals treated with 5 × 109 CFU of p3D-NT56/S. cho were protected in 9 days. 相似文献