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1.
【目的】病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术已在植物基因功能研究领域得到广泛应用。建立以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,为将烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默技术在大豆与大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）互作体系中对大豆基因功能进行研究提供基础。【方法】从大豆品种冀豆7号（J7）叶片中特异性扩增八氢番茄红素脱氢酶基因（GmPDS）的部分片段,并将该基因片段插入质粒pTRV﹕RNA2中;向J7的第一位真叶注射携带有TRV或TRV﹕GmPDS的农杆菌,注射后对上部未接种病毒的叶片进行表型观察,并通过半定量RT-PCR检测GmPDS的表达量。为探讨接种TRV是否影响大豆对SMV的抗性表现,在大豆第一片真叶上预接种TRV病毒后10 d,再分别接种SMV株系N3和SC-8,以单独接种N3或SC-8作为对照。待接种SMV后第5天观察未接种的上位叶表型并检测SMV的外壳蛋白基因CP。【结果】大豆叶片注射携带有TRV﹕GmPDS的农杆菌后25 d,上部未接种病毒的叶片出现了白化现象,通过半定量RT-PCR分析,发生白化的植株中GmPDS的表达量明显降低。在此基础上,向大豆叶片预注射携带有TRV的农杆菌后再接种SMV,SMV株系N3和SC-8与J7分别组成不亲和与亲和组合。 发现J7第一片真叶上预接种TRV后再接种SMV株系N3,与单独接种N3对上位叶的影响在表型上表现一致,对未接种的上位叶片进行病毒外壳蛋白基因CP检测,发现J7单独接种N3以及预接种TRV后再接种N3的上位叶片上均未能检测到CP表达。而J7单独接种SMV株系SC-8,以及预接种TRV后再接种SC-8均在上位叶上能够检测到CP。说明在J7上预接种TRV不影响J7对SMV的抗性。在感病品种南农1138-2上也获得了相似结果。【结论】建立了以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,并证明在大豆上先接种TRV不改变大豆对SMV的抗性表现。 相似文献
2.
【目的】沉默辣椒CaDXS和CaPDS基因,比较分析两者白化表型的差异,寻找新的辣椒沉默标记基因。【方法】利用双酶切克隆技术构建CaDXS和CaPDS基因的沉默载体;通过农杆菌介导转化侵染辣椒,观察辣椒的沉默表型;采用实时荧光定量PCR技术检测CaDXS和CaPDS基因的沉默效率。【结果】农杆菌浸润21 d后,沉默CaDXS基因的辣椒叶片出现褪绿症状,沉默CaPDS基因的辣椒叶片出现白化。农杆菌浸润30 d后,沉默CaDXS基因的辣椒叶片出现较为明显的白化;沉默CaPDS基因的辣椒叶片白化程度加剧,新叶近乎白化。与CaDXS基因相比,沉默CaPDS基因导致的辣椒白化表型更明显和高效。沉默组辣椒叶片中CaDXS和CaPDS基因的表达量均显著降低(P<0.05),沉默效率分别为86.80%和93.08%,表明辣椒CaDXS和CaPDS基因被成功沉默。【结论】CaDXS基因可以作为辣椒的沉默标记基因,但沉默CaPDS基因的辣椒白化表型出现更早且明显,因此,CaPDS基因比CaDXS基因更适合作为辣椒沉默标记基因。 相似文献
3.
【目的】由大豆花叶病毒（soybean mosaic virus,SMV）引起的大豆花叶病是世界性大豆病害之一,利用病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）技术研究GmSZFP在大豆与SMV互作过程中发挥的功能,为深入探讨其分子机制奠定基础。【方法】以大豆品种冀豆7号与SMV毒株SC-8、N3组成的亲和、不亲和组合为试验材料,运用生物信息学预测GmSZFP的分子结构特征;以酵母转录激活试验检测其转录因子活性;借助实时定量PCR（RT-qPCR）验证GmSZFP在大豆与SMV互作中转录水平的表达特征;结合VIGS技术探究GmSZFP在大豆与SMV互作过程中的功能。【结果】通过PCR克隆GmSZFP的CDS区,序列全长为1 071 bp;氨基酸序列分析和酵母转录激活试验发现GmSZFP为C2H2型锌指蛋白转录因子,且具有转录激活活性;RT-qPCR结果显示,GmSZFP受SMV的强烈诱导,在亲和组合与不亲和组合中的表达模式不同,在不亲和组合中,GmSZFP呈先上升后下降的表达趋势,其表达水平明显高于亲和组合,若在接种病毒前给叶片预注射咪唑,GmSZFP的表达水平降低,并与亲和组合相近,说明GmSZFP在转录水平响应SMV的侵染并受胞内H2O2信号调控;利用VIGS技术沉默GmSZFP后,发现接种部位胼胝质的积累水平较对照大大降低,RT-qPCR检测胼胝质合酶基因GmGSL7c和GmGSL12b的表达量较对照降低,胼胝质水解酶基因BG的表达量较对照增加;在基因沉默植株叶片上点接种SMV后72 h,病毒向外扩散至2 mm,在96 h时病毒扩散至3 mm,而对照组叶片在接种点外始终未能检测到SMV外壳蛋白CP的表达;摩擦接种SMV后10 d,在基因沉默植株的上位叶表现出花叶、失绿和卷曲等感病症状,并检测到CP的表达,说明沉默GmSZFP后,SMV在胞间扩散和长距离运输的能力均增强。【结论】大豆GmSZFP是典型的C2H2型单锌指蛋白,GmSZFP在大豆抵抗SMV侵染过程中发挥正调控作用。 相似文献
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大豆对SMV株系SC10的抗性遗传及抗病基因的定位研究 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】明确大豆对SMV株系SC10的抗性遗传方式以及不同抗源所携带的抗病基因间的等位关系,并对科丰1号所携带的抗SC10基因进行标记定位。【方法】利用抗中国南方大豆产区流行株系SC10的科丰1号、晋大74、大白麻、汾豆56、中作229、徐豆1号、邳县茶豆、Kwanggyo、跃进4号配制部分抗抗杂交组合并与感病品种南农1138-2和8101配制抗感组合,在接种SC10的条件下,调查各组合后代的抗感反应;并利用科丰1号×南农1138-2的F2群体和分离群体分组分析法（BSA）及SSR标记对抗病基因进行标记定位。【结果】科丰1号、晋大74、大白麻、汾豆56、中作229和徐豆1号与感病品种杂交的F1表现抗病,F2呈3抗﹕1感分离比例,F2:3家系呈1抗﹕2分离﹕1感病的分离比率;晋大74×汾豆56、徐豆1号×邳县茶豆的F1表现抗病、F2未发现感病株。科丰1号×Kwanggyo、汾豆56、中作229,晋大74×中作229、Kwanggyo,大白麻×汾豆56、科丰1号和跃进4号×Kwanggyo的F1表现抗病,F2呈15抗﹕1感的分离比例,F2:3家系符合7抗﹕4分离（15抗﹕1感）﹕4分离（3抗﹕1感）﹕1感的分离比例;D1b连锁群上的SSR标记Satt558、Sat_254、Satt634、Gm020580、Gm020584、Gm020562和Gm020546与抗病基因RSC10连锁,遗传距离分别为6.1、2.0、0.9、0.8、2.0、4.6和9.2 cM。【结论】科丰1号、晋大74、大白麻、徐豆1号、汾豆56、中作229各有一个显性基因控制对SC10株系的抗性;晋大74与汾豆56,徐豆1号与邳县茶豆的抗病基因是等位的或紧密连锁的;科丰1号与Kwanggyo、汾豆56、中作229携带的抗SC10株系的基因处于不同位点,晋大74与中作229、Kwanggyo携带的抗SC10株系的基因处于不同位点,大白麻与汾豆56、科丰1号携带的抗SC10株系的基因处于不同位点,跃进4号与Kwanggyo携带的抗SC10株系的基因处于不同位点;科丰1号对SC10株系的抗病基因RSC10位于D1b连锁群。 相似文献
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【目的】大豆胞囊线虫（soybean cyst nematode,SCN）病是一种重要的世界性大豆病害,种植抗病品种是防治SCN最经济有效的措施。黄淮地区SCN发生普遍,通过对该地区育成大豆品种中抗SCN的基因型分析,为指导抗病品种的合理有效利用提供依据。【方法】利用针对抗SCN主效位点Rhg1和Rhg4开发的4个KASP标记,先对已知抗性表型的ZDD2315、中黄57、山西小黑豆等16份抗病材料和Willams、Lee等3份感病材料进行基因分型,验证所选用KASP标记的有效性;然后对黄淮海育成的豫豆系列、商豆系列、周豆系列等170份大豆品种进行基因型鉴定;选择含有多个优异等位变异的品种,通过温室接种黄淮地区分布较广的2号、4号、5号以及强致病力小种X12,对这些品种进一步进行表型抗性鉴定。【结果】含Rhg1-2(CC) 和Rhg1-5(CC) 优异等位变异的品种分别有5份和6份,含Rhg4-3(TT) 和Rhg4-5(CC) 优异等位变异的品种分别有6份和7份。同时含2个优异等位变异的品种有6份,分别为：开豆4号、商豆1201、鲁0305-2、漯4903、潍豆12和潍豆91861,占所检测品种的3.53%。通过接种鉴定,发现这6个品种对2号、4号、X12号小种均表现不同程度的感病,而鲁0305-2和潍豆91861对5号小种表现高抗（FI分别为（10.00±0.48）和（7.00±0.63））,商豆1201对5号小种表现抗病（FI=（26.20±0.91））,开豆4号、漯4903和潍豆12 对5号小种表现感病或高感（FI分别为（35.00±2.48）、（64.80±3.91）和（58.20±2.19））。【结论】黄淮育成品种中,含Rhg1或Rhg4优异等位变异的品种偏少,育种中应注重优异等位变异位点的引入,结合黄淮地区大豆胞囊线虫发生情况,培育兼抗多个生理小种的大豆品种;这些KASP标记可用于中国大豆资源表型鉴定、抗源的快速筛选。 相似文献
7.
【目的】对南方根结线虫乳酸脱氢酶基因（mildh）进行克隆分析,并探索mildh沉默对南方根结线虫（Meloidogyne incognita）病害的抑制作用。【方法】在前期研究中,利用生物信息学方法在线虫全基因组中预测了一些线虫RNA干扰（RNAi）表型基因。本研究以预测的线虫ldh设计特异引物克隆南方根结线虫中mildh。对克隆到的mildh序列进行了特征分析后,利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术,将其导入番茄植株,并接种南方根结线虫,研究mildh基因沉默对根结线虫根结数量影响。【结果】克隆到的mildh包含1个完整的编码框序列,编码315个氨基酸。该基因与预测到的mildh核苷酸序列一致性高达94.9%,所编码的氨基酸一致性高达95.5%。构建烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的沉默载体pTV-mildhi,并用该沉默载体对番茄植株进行处理后,接种南方根结线虫。60 d后统计发现,pTV-mildhi处理的番茄植株上根结数分别比空载体对照减少48.6%,比清水对照降低48.4%。【结论】mildh基因沉默对南方根结线虫具有显著的抑制作用,也说明mildh可能参与根结线虫的致病性,该研究对线虫的病理学研究及线虫病害防控研究提供了新的理论基础。 相似文献
8.
【目的】利用农杆菌介导的VIGS基因沉默技术,研究陆地棉抗病相关基因在棉花抗黄萎病中的功能。【方法】利用分子生物学技术构建VIGS病毒载体,建立VIGS病毒诱导沉默体系;利用此体系将棉花中的一个钙依赖蛋白(CDPK)基因,通过农杆菌介导在陆地棉中沉默,根据此基因沉默植株在病原菌环境下的发病情况研究该基因在棉花抗病中的功能。【结果】利用包含有GhCPK抗病基因片段的VIGS病毒载体的农杆菌侵染棉花子叶,病毒载体上的目的基因片段由RNA聚合酶识别并合成双链RNA(double stranded RNA,dsRNA),dsRNA由Dicer酶识别并于其它RNA形成RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex, RISC),RISC对内源GhCPK mRNA进行识别和切割作用,内源GhCPK mRNA降解而发生基因沉默。GhCPK基因沉默导致棉苗对黄萎病敏感性增加,证明GhCPK基因参与调控棉花抗病功能。【结论】病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)能够快速有效的研究GhCPKs基因在棉花抗病中的功能。 相似文献
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《宁夏农林科技》2021,(2)
【目的】本项研究旨在通过建立一个异源VIGS体系,为枸杞重要性状相关基因的功能鉴定提供前期信息。【方法】从枸杞叶片中克隆获得409 bp长的八氢番茄红素脱饱和酶基因(phytoene desaturase, PDS)的编码区片段,构建入基于烟草脆裂病毒的VIGS空载体中,通过农杆菌介导的侵润接种,将重组的病毒沉默载体p TRV2-PDS转入本氏烟中。【结果】本氏烟幼苗被侵染接种后,沉默处理植株的叶片呈现整叶白化的表型,而阴性对照植株叶片一直未出现变白的症状,q RT-PCR检测表明,接种17 d后,与阴性对照植株相比,沉默处理植株PDS基因的表达显著地被抑制(P0.05),说明枸杞PDS基因的同源基因在本氏烟中得到了有效沉默。【结论】该VIGS体系的构建,可用于对枸杞部分基因功能的快速初步鉴定和筛选,旨在提高枸杞基因功能研究的效率。 相似文献
10.
【目的】白粉病（powdery mildew）是番茄生产上的重要病害,严重影响番茄的产量。番茄基因组测序工作的完成为抗病基因挖掘提供了重要的信息资源。ARP2/3（actin-related protein 2 and 3）复合体是肌动蛋白微丝骨架动力学的主要调控因子,能够参与包括响应外界胁迫等多种细胞学过程。本研究通过对番茄ARPC5（actin-related protein C5）进行克隆和抗病功能验证,为番茄基因组信息完善、抗病机制解析和分子育种等方面打下基础。【方法】从番茄LA1777（Solanum habrochaites）cDNA中PCR扩增ShARPC5,使用DNAMAN 6.0进行多序列比对;MEGA 6.0构建系统发育树;应用在线工具ProtComp v. 9.0进行亚细胞定位预测。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）比较接种白粉菌（Oidium neolycopersici,On-Lz）后高感品种Moneymaker（MM）和高抗品种LA1777中番茄ARPC5的表达特征,分析白粉菌侵染与ARPC5表达的相关性。应用病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术进一步验证该基因在番茄中的抗病功能,观察沉默株和野生型株系接种后表型变化,利用台盼蓝和DAB染色法检测植株产生过敏性坏死和H2O2的能力,并检测ShARPC5沉默后一些与植物抗病相关标记基因的表达变化。采用农杆菌浸花法遗传转化拟南芥过表达ShARPC5植株,观察转基因和野生型株系接种后表型变化,并统计单病斑分生孢子数。【结果】从番茄品种LA1777中克隆到ShARPC5,编码132个氨基酸残基,包含一个保守的P16-Arc结构域。与番茄MM-白粉菌亲和互作相比,非亲和互作的番茄品种LA1777在接种白粉菌后,ShARPC5显著上调表达,尤其在接种后18 h。在番茄上沉默ShARPC5能够增加植株对白粉菌On-Lz的敏感性,防卫反应基因PR1b1显著下调表达。组织学观察显示与对照植株相比,ShARPC5沉默植株接种后诱导产生过敏性坏死和活性氧减少。在烟草上瞬时过表达ShARPC5能够诱导产生坏死斑。相反,在拟南芥上过表达ShARPC5能够增加植物的抗病性。【结论】ShARPC5是番茄响应白粉菌侵染的重要基因,可减轻番茄白粉病的发病程度,在番茄抗白粉病机理研究方面具有较大的应用价值,可作为番茄抗白粉病分子育种的一个候选基因。 相似文献
11.
【目的】马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）是危害烟草、马铃薯、番茄、辣椒等主要农作物的重要病毒,给农业生产带来巨大损失。论文旨在克隆Hsc70-2蛋白在本氏烟（Nicotiana benthamiana）中的基因序列并分析其生物学信息,研究NbHsc70-2蛋白对PVY侵染烟草的影响,为进一步解析PVY的侵染机制提供理论依据。【方法】以本氏烟为材料,克隆NbHsc70-2蛋白的基因编码序列（coding sequence,CDS）,利用MEGA 6.0 进行多序列比对并构建系统进化树;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析NbHsc70-2在本氏烟各组织中的表达水平;采用在线软件BaCeILo和SignalP 4.0对NbHsc70-2进行生物信息学分析;构建NbHsc70-2-RFP融合蛋白确定该蛋白的亚细胞定位;研究PVY处理对本氏烟叶片中NbHsc70-2的影响;利用激光共聚焦观察PVY-GFP处理对NbHsc70-2-RFP定位的影响;构建NbHsc70-2 VIGS沉默体系及瞬时表达载体,采用qRT-PCR比较NbHsc70-2在沉默/过表达后对PVY表达的影响。【结果】NbHsc70-2编码649个氨基酸,系统进化树分析表明,NbHsc70-2与普通烟NaHsc70-2序列相似性最高,亲缘关系最近,属于热激蛋白家族,C端具有热激蛋白家族的高度保守基序结构;qRT-PCR分析表明,NbHsc70-2在叶中表达量最高,在根和茎中的表达量较低;BaCeILo预测及激光共聚焦显微镜观察均显示NbHsc70-2定位在细胞质中,并且PVY-GFP侵染本氏烟后NbHsc70-2-RFP部分转移至细胞核,与PVY-GFP共定位在细胞质及细胞核中;将NbHsc70-2基因沉默载体pTRV::NbHsc70-2导入本氏烟中7 d后相比于对照组,沉默组出现心叶皱缩及矮化现象;接种PVY-GFP 7 d后通过手持紫外灯观察到沉默组中无明显绿色荧光出现,而对照组中PVY-GFP系统侵染使得非接种叶片呈现荧光现象,沉默组荧光点数约为对照组28%;接种PVY后,利用qRT-PCR检测沉默NbHsc70-2后1、3、5 d的PVY CP基因积累量,结果表明沉默NbHsc70-2后PVY CP基因积累量下降,其中3 d和5 d与对照相比差异显著,基因表达水平分别为对照的14%和0.004%;将NbHsc70-2过表达载体pEarleyGate100::GWC::NbHsc70-2与PVY同时导入本氏烟后,结果表明相比于对照组,过表达组48 h和72 h 其PVY CP基因积累量显著上升,基因表达水平分别为对照组的2.31、2.56倍。【结论】PVY侵染会引起NbHsc70-2表达量上升;NbHsc70-2是PVY侵染本氏烟重要的组成成分,沉默该基因显著抑制PVY的表达,过表达NbHsc70-2则显著提高PVY的表达,即NbHsc70-2的表达水平与PVY复制呈正相关,NbHsc70-2蛋白促进PVY对烟草的侵染。 相似文献
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【目的】NS3编码的蛋白是水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）RNA沉默抑制子。笔者前期研究发现,转NS3本氏烟（Nicotiana benthamiana）对RSV有一定的抗性。为深入揭示NS3在寄主体内的作用机制,本文将进一步探究转NS3本氏烟对其他烟草病害的抗性。【方法】以野生型本氏烟和转NS3本氏烟为试验材料,通过农杆菌浸润法接种马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）侵染性克隆,观察病毒症状,抽提系统发病叶片总RNA,并利用RT-qPCR方法检测病毒的相对积累量;采用灌根接种法分别接种烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）,观察植株表型并统计发病率和病情指数。【结果】PVX侵染本氏烟后,植株叶片主要表现为花叶、褪绿等症状,NS3表达植株与野生型植株具有相同的PVX症状表现。在接种PVX 10 d后,RT-qPCR检测发现与野生型植株病毒积累量相比,NS3表达抑制了PVX在本氏烟体内的积累水平,两个转NS3株系（NS3-6、NS3-9）中PVX的相对积累量分别为野生型植株的68.17%和81.01%。青枯病菌在野生型植株和转基因植株上均引起萎蔫、猝倒等典型的病害症状,且两者的症状无明显差异。在青枯病菌侵染早期,NS3表达在一定程度上利于病菌的侵染,表现出对青枯病较为敏感;而在接种14 d,野生型植株的发病率为100.00%,病情指数为78.67,而NS3-6、NS3-9株系的发病率分别为95.00％、98.33％,病情指数分别为70.00、73.00;14 d之后发病率和病情指数逐渐升高,而NS3表达株系的病情指数均低于野生型植株。黑胫病菌在野生型植株和转基因植株上均为在茎基部出现黑褐色坏死斑等典型病害症状,且NS3表达也不影响本氏烟的症状表现。在黑胫病菌的侵染初期,NS3-6株系的发病率高于野生型植株;但在整个黑胫病发生过程中,转NS3株系的病情指数均低于野生型植株,在接种12 d,野生型本氏烟的发病率为96.67％,病情指数为77.50,而NS3-6、NS3-9株系的发病率分别为90.00％、86.67％,病情指数分别为64.17、62.08。【结论】通过病原侵染过程观察表明NS3表达在一定程度上影响了烟草病害在本氏烟上的侵染和严重程度,且对不同病原菌的影响不同。 相似文献
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【目的】 构建基于柑橘叶斑驳病毒（citrus leaf blotch virus,CLBV）的表达载体,通过系统表达抗菌肽提高植物抗病性,为柑橘溃疡病、柑橘黄龙病等病害的防控提供新型技术手段。【方法】 基于前期构建的侵染性克隆pCY-CLBV201,在外壳蛋白基因终止子后插入亚基因组启动子序列及多克隆位点,构建病毒表达载体pCLBV202。在多克隆位点插入绿色荧光蛋白（green fluorescent protein）基因（gfp）,通过农杆菌介导接种、荧光观察验证pCLBV202-GFP表达GFP的情况。克隆天蚕的抗菌肽（cecropin B,CB）基因并构建重组载体pCLBV202-CB,通过农杆菌介导分别注射接种本氏烟和真空浸润接种柑橘实生苗,筛选阳性植株并分别注射接种和根灌接种烟草青枯病菌及针刺离体叶片接种柑橘溃疡病菌,同时设空载体接种植株为对照,通过症状观察、发病率及病情指数评价接种植株的烟草青枯病抗性;通过柑橘叶片的病斑数量、发病率及菌落浓度评价其溃疡病抗性。【结果】 pCLBV202-GFP接种烟草和尤力克柠檬后,均可以在系统新叶上观察到绿色荧光,在烟草上表现更为明亮,说明基于CLBV的表达载体构建成功。接种青枯病菌后,处理组（pCLBV202-CB）较对照组（pCLBV202）发病时间延迟4 d。在接种后第24天（24 dpi）,处理组发病率为14.3%,对照组发病率为100%,差异显著。处理组相对于对照组的抗性指数为-2.66,抗性评价为高抗,表明利用pCLBV202-CB系统表达CB增强了对烟草青枯病的抗性。尤力克柠檬叶片针刺接种柑橘溃疡病菌,7 dpi时,处理组病斑数为47个,发病率为43.5%,对照组病斑个数为73个,发病率为67.6%。菌群数变化检测发现,处理组菌群数小于对照组菌群数,表明利用pCLBV202-CB系统表达CB增强了尤力克柠檬的溃疡病抗性。【结论】 构建了基于CLBV的病毒表达载体pCLBV202。利用pCLBV202在本氏烟和柑橘中系统表达CB可以提高植株对细菌性病害的抗性,这为柑橘细菌性病害的防控提供了新技术。 相似文献
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【目的】烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）是危害茄科、十字花科、葫芦科等农作物的重要病毒,给农业生产造成了巨大损失。通过分子克隆获得本氏烟（Nicotiana benthamiana）多蛋白桥梁因子1c（multiprotein bridging factor 1c,MBF1c）,综合应用生物信息学、细胞生物学以及分子生物学手段,明确NbMBF1c的抗病毒功能和机制,为作物的抗病毒育种提供理论依据。【方法】根据Sol Genomics Network中报道的NbMBF1c序列全长,设计引物克隆NbMBF1c全长序列;使用GeneDoc及MEGA X对NbMBF1c蛋白和其他物种中的同源蛋白序列进行比对并构建系统进化树;利用生物信息学分析NbMBF1c的基因特征和蛋白结构;使用实时荧光定量PCR检测其组织表达及其在TMV侵染中的表达;利用烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）诱导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）技术沉默NbMBF1c后通过摩擦接种TMV-GFP,明确NbMBF1c对病毒侵染的影响;构建pART27-GFP-NbMBF1c和pART27-Myc-NbMBF1c瞬时过表达载体,在本氏烟叶片中表达融合蛋白GFP-NbMBF1c后在共聚焦显微镜下观察亚细胞定位,表达融合蛋白Myc-NbMBF1c后接种病毒观察TMV-GFP侵染情况;采用实时荧光定量PCR检测沉默NbMBF1c后相关激素基因的表达,分析NbMBF1c影响病毒侵染的机制。【结果】NbMBF1c全长441 bp,编码146个氨基酸,包含一个保守结构域HTH（helix-turn-helix）;系统发育分析表明,NbMBF1c与绒毛状烟草（Nicotiana tomentosiformis）MBF1c（XP_009614458.1）亲缘关系最近;NbMBF1c的表达具有特异性,在根中的表达量最高,其次是茎、叶和花;NbMBF1c定位于细胞质和细胞核中;沉默NbMBF1c会显著影响本氏烟株高,出现矮化等症状,接种TMV-GFP第5天时,沉默处理相较于对照组植株新叶病毒含量更高;瞬时过表达Myc-NbMBF1c融合蛋白,在注射叶接种TMV-GFP后,病毒侵染减少,但NbMBF1c并不与TMV组分互作;沉默NbMBF1c后,脱落酸（abscisic acid,ABA）合成关键酶基因NCED3、脱落酸受体PYL1、ABA信号转导因子ABAI1和蛋白激酶SnRK2E的表达量显著上调;茉莉酸（jasmonic acid,JA）合成途径AOS1上调表达,茉莉酸信号通路上的受体COI1下调表达。【结论】本氏烟MBF1家族NbMBF1c的表达受TMV侵染诱导,且主要定位于细胞质和细胞核。NbMBF1c作为植物抗TMV的正调控因子抑制病毒在本氏烟上的侵染。NbMBF1c不通过与TMV组分互作来抑制病毒侵染,而是通过调控植物激素的产生和信号传导来抑制病毒侵染。 相似文献
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【目的】构建柑橘黄化花叶病毒（citrus yellow mosaic virus,CYMV）侵染性克隆,为深入研究其分子特性及致病机理打下基础。【方法】利用In-Fusion同源重组技术将分段扩增的CYMV基因组序列与三元表达载体pCY重组连接,构建该病毒1.4倍基因组全长DNA克隆并开展序列分析。将所获克隆通过农杆菌介导接种尤力克柠檬实生苗,通过分子检测、症状和病毒粒子观察及再嫁接实验鉴定其侵染性。利用所获侵染性克隆接种不同的柑橘品种及草本植物,通过RT-PCR检测确定侵染率,观察不同柑橘品种受侵染后的症状差异。基于侵染性克隆构建ORFⅠ和ORFⅡ分别替换为绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein,gfp）的突变体,分析突变对病毒侵染性的影响。【结果】利用In-Fusion同源重组技术获得CYMV 1.4倍基因组全长DNA克隆7个。其中,CYMV-3与已登录GenBank的9个CYMV分离株基因组相应核苷酸序列一致性为90%—100%,与分离株CYMV-SO（AF347695）同源性最高并在遗传进化树上聚为一簇。侵染性鉴定结果表明,CYMV-3接种的14株尤力克柠檬植株中有4株呈RT-PCR阳性,并观察到点状褪绿症状;提取侵染植株系统新叶DNA,PCR扩增获得预期的覆盖CYMV基因组全长的特异性片段;以CYMV-3侵染显症植株为毒源嫁接接种粗柠檬实生苗,通过RT-PCR在90 dpi可检测到CYMV特异性条带;取CYMV-3侵染显症植株的新叶进行固定切片并电镜观察,可见大小约130 nm×30 nm的杆状病毒粒子,说明CYMV-3为CYMV侵染性克隆。将CYMV-3通过农杆菌介导真空浸润接种10个柑橘品种,注射接种5个柑橘品种并进行RT-PCR检测,结果显示前者侵染率为11.11%—100.00%,后者侵染率为63.16%—90.00%,部分柑橘品种出现黄化、花叶、斑块状黄化等CYMV侵染症状。通过农杆菌介导注射接种本氏烟、玉米、豇豆和高粱,结果显示仅高粱检测到RT-PCR阳性植株,且系统叶片沿叶脉周边出现条状褪绿带,表明CYMV可以侵染高粱。构建了CYMV-3 ORFⅠ和ORFⅡ分别替换为gfp的突变体,通过农杆菌介导注射接种粗柠檬,RT-PCR检测结果均为阴性,且无侵染症状。【结论】成功构建了CYMV的侵染性克隆,通过农杆菌介导注射可高效接种柑橘植株,侵染症状在不同品种上具有差异。 相似文献
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【目的】明确抗病毒化合物氯吲哚酰肼（chloroinconazide,CHI）诱导的本氏烟（Nicotiana benthamiana）半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteinase,CP）在烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）侵染过程中的作用及其基因家族特征,为理解茄科作物抗病毒分子机制及化学调控提供理论依据。【方法】利用全基因组策略,从茄科作物基因组数据库Sol Genomics Network中检索获得本氏烟NbCP的全家族基因序列,利用生物信息学分析NbCP基因家族的进化关系、Motif基序及启动子顺式作用元件。根据生物信息分析结果,利用实时荧光定量PCR技术分析TMV侵染后NbCP基因的表达,以此筛选出潜在抗病蛋白。使用烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默技术和马铃薯X病毒（potato virus X,PVX）介导的基因过表达技术验证该关键蛋白对TMV-GFP侵染的影响,结合实时荧光定量PCR手段探索该关键蛋白的抗病毒机制。【结果】NbCP家族共有24个成员,根据其染色体定位命名为NbCP1—NbCP24。进化关系分析表明NbCP分成5个亚家族,其中Group V含有7个NbCP,而Group I仅含2个NbCP;Motif分析表明不同分支NbCP具有相似的motif分布;启动子顺式作用元件分析表明NbCP家族基因受光调控,并且多个NbCP家族基因启动子含有茉莉酸甲酯、水杨酸甲酯、脱落酸、赤霉素和生长素等激素响应元件。结合生物信息学分析,从上述各个亚家族中分别筛选1个关键潜在抗病相关NbCP基因（NbCP8、NbCP12、NbCP13、NbCP18、NbCP22）,并利用实时荧光定量PCR技术分析上述基因在TMV侵染第5天的表达,发现NbCP8表达差异性最大,上升了2.6倍,NbCP8在叶中的表达量最高,其次是茎和根,在花中的表达量最低。TRV介导的NbCP8沉默能显著增加TMV-GFP的侵染,而PVX介导的NbCP8过表达能显著抑制TMV-GFP侵染,表明NbCP8作为植物正调控因子抑制病毒侵染。沉默NbCP8显著抑制了水杨酸信号途径相关基因PR1以及茉莉酸信号途径相关基因MYC2的表达,但对NPR1、COI1以及脱落酸信号途径相关基因ABA1和NCED1的表达无显著影响;而过表达NbCP8则显著提高了PR1以及ABA1的表达,但对NPR1、MYC2、COI1和NCED1的表达无显著影响。【结论】本氏烟NbCP参与了植物胁迫防御,其中NbCP8在抗TMV防御中起显著作用,其分子机制是通过诱导水杨酸信号途径参与抗病防御,研究结果可为茄科作物抗病毒的分子机制提供证据。 相似文献
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【目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染瓜类作物的主要病毒之一,对瓜类产业造成巨大的危害。本研究旨在探明侵染广东省连州市葫芦的CGMMV分离物(CGMMV-GDLZ)分子特征及其在系统进化中的地位,并测定其对黄瓜、葫芦和西瓜的致病性,为CGMMV的防控提供理论依据。【方法】从广东省连州市葫芦种植基地采集2个疑似CGMMV侵染的病样以及1个无症状样品,提取总RNA,根据CGMMV参考序列（GenBank登录号：KX883801）设计引物进行RT-PCR检测,引物序列为F：CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG/R：TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT,退火温度53℃,扩增长度890 bp。将CGMMV全长序列分为前后两段,前半段1—3 511 nt,扩增引物序列为F：AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTTTTAATTTTTATAA TTAAACAAA/R：AGTTCTGCATTAATTGCTATTTGGTAGGCACAGTGGTAG;后半段3 301—6 423 nt,扩增引物序列为F：GTGCGTGCTACCCCGACTCCAATAGGTTTGATTGCCCGTG/R：GGTGGAGATGCCATGCCGACCCTGGGCCCCTACCCGGGGAAAGG。将前后两段PCR产物通过同源重组的方法克隆到pCB301双元载体上,测序得到CGMMV-GDLZ分离物全长序列。利用CGMMV-GDLZ分离物全长序列在NCBI中进行Blast分析,然后通过MEGA7软件对CGMMV-GDLZ以及其他已经报道的CGMMV分离物进行系统进化树分析。将构建好的pCB301-CGMMV侵染性克隆注射接种本生烟验证其侵染性,然后再注射接种黄瓜、葫芦和西瓜的子叶,测定CGMMV-GDLZ分离物的致病性。【结果】RT-PCR结果证实,广东省连州市葫芦病样感染了CGMMV。CGMMV-GDLZ分离物全长序列为6 423 nt,编码4个蛋白,分别为129K复制酶（61—3 495 nt）、186K复制相关蛋白（61—5 007 nt）、运动蛋白MP（4 994—5 788 nt）和外壳蛋白CP（5 763—6 248 nt）。CGMMV-GDLZ核苷酸序列与CGMMV-eWT分离物（GenBank登录号：KY753928）同源性最高,为99.97%。系统进化树分析结果显示,CGMMV-GDLZ分离物与日本、韩国等东亚CGMMV分离物同属Group 1,在遗传距离上与山东、浙江和河南的CGMMV分离物最接近。pCB301-CGMMV侵染性克隆可以系统侵染本生烟,造成本生烟上部叶片出现皱缩、斑驳、凸起等症状,RT-PCR和Western blot进一步确认了侵染性克隆的侵染性。注射接种CGMMV-GDLZ分离物后15 dpi,葫芦和西瓜即可产生斑驳、花叶、突起、生长迟缓等症状,24 dpi时症状更明显。而15 dpi时,CGMMV-GDLZ分离物在黄瓜上的症状不明显,与未接种对照植株几乎没有区别;将植株从控温接种室移入网室中,30 dpi时,黄瓜植株上部叶片开始出现斑驳和花叶,40 dpi时,症状已经非常明显。RT-PCR和Western blot检测进一步确认了上述结果。【结论】侵染广东省连州市葫芦的CGMMV-GDLZ分离物与山东、浙江和河南的CGMMV分离物很可能具有相同的传染源;CGMMV-GDLZ分离物可以侵染本生烟、黄瓜、葫芦和西瓜等作物,但对这些作物的致病性存在差异。 相似文献
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【背景】大豆是重要的经济作物,能够为人类提供大量的植物蛋白和油脂。大豆在生长过程中,能够与根瘤菌形成共生体系进行共生固氮,该形式的共生固氮能够将空气中的氮气还原成氨,为大豆生长发育提供丰富氮源。根瘤菌Ⅲ型分泌系统是根瘤菌中重要的蛋白分泌结构,能够通过分泌Ⅲ型效应因子在共生体系建立过程中发挥重要调控作用。根瘤菌rhcN编码一种ATP转移酶,是根瘤菌Ⅲ型分泌系统的重要组成部分,能够保障根瘤菌Ⅲ型效应因子向宿主细胞的正常分泌。【目的】探索rhcN突变情况下对根瘤菌结瘤能力的影响,提高大豆-根瘤菌共生体系的固氮效率,为大豆农业生产提供必要的参考和支持。【方法】通过三亲杂交和同源重组,在rhcN起始密码子ATG下游插入了一个Km抗性基因,利用PCR扩增和Southern blot对插入情况进行验证,从而构建rhcN插入突变体HH103ΩrhcN。利用大豆染料木苷（Genistin）对野生型根瘤菌HH103及HH103ΩrhcN突变体进行诱导,并对处理组合对照组进行胞外蛋白纯化,通过Western blot检测rhcN突变对根瘤菌III型效应因子NopC及NopT分泌的影响。利用双层钵植物培养系统对大豆Williams82进行野生型根瘤菌HH103和HH103ΩrhcN突变体接种,分析rhcN突变对根瘤表型的影响。利用前期收集的100份基因型差异的大豆品种进行结瘤能力鉴定,分析根瘤菌Ⅲ型效应因子分泌异常情况下在不同基因型大豆品种中的结瘤表现。【结果】通过PCR扩增和Southern blot验证了成功构建的HH103ΩrhcN突变体,胞外蛋白鉴定表明rhcN突变能够抑制根瘤菌Ⅲ型效应因子NopC和NopT分泌。利用HH103ΩrhcN突变体和野生型HH103在Williams82进行结瘤鉴定,结果表明,rhcN突变能够显著抑制根瘤数和根瘤干重。对100份基因型差异的大豆品种进行结瘤鉴定,结果表明,rhcN突变能够引起其中80份大豆资源根瘤数目降低,13份根瘤数目显著升高,7份不发生显著性变化。【结论】rhcN突变能够引起根瘤菌Ⅲ型效应因子的异常分泌,进而能够影响共生体系的建立。根瘤菌III型效应因子在大豆-根瘤菌共生体系形成过程中发挥着重要作用,并且不同基因型大豆遗传背景对根瘤菌Ⅲ型效应因子具有不同应对反应。 相似文献
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【目的】 鉴定大豆根特异性启动子及其最小调控片段,并利用启动子工程技术构建时空特异人工启动子并评价其在根腐病抗性中的应用价值,为大豆抗疫霉根腐病的遗传改良提供遗传元件。【方法】 通过分析大豆根、茎和叶片转录组数据,筛选在根中特异高水平表达的基因,克隆获得其启动子序列。根据顺式元件的分布位置构建截短载体,并驱动GUS报告基因在大豆发状根组织中超表达,筛选控制根特异性表达的核心片段。将获得的核心启动子片段与疫霉菌诱导启动子元件p4XD串联构建人工启动子驱动疫霉抗性相关基因GmNDR1在大豆发状根中超表达,分析转基因组织对疫霉菌抗性水平及目的基因在病原菌侵染过程中的表达水平。利用转基因本氏烟草从整株水平评价转基因材料对疫霉菌的抗性水平。【结果】 通过筛选发现6个大豆根特异性表达的PR1同源基因,其中,pGmPR1-9具有最高的启动子表达活性。PLACE在线预测发现其启动子区域含有大量的根特异表达相关顺式元件。对pGmPR1-9启动子进行截短试验,发现5′端截短片段L1、L2、L3、L4和L5均具有启动GUS表达活性,长度为166 bp的L5（-166—-1）片段具有全长启动子80%的活性,并可驱动GUS在转基因烟草根中特异表达;3个3′端截短片段R1、R2、R3和1个双端截短片段M1几乎检测不到GUS酶活性。p4XD-L5融合片段驱动GmNDR1在大豆发状根中超表达后可显著提高大豆发状根对疫霉菌的抗性,超表达发状根接种病原菌后发病程度和病斑长度显著低于对照,疫霉菌丝积累量在接种48 h时减少66.5%。GmNDR1在超表达组织中始终维持在高表达水平,在接种前,表达量是对照组织的39.2倍,接种后,表达量受疫霉菌侵染诱导进一步上调,并在36 h达到最高。GmNDR1在p4XD-L5::NDR1转基因本氏烟草根中的表达量显著高于茎和叶片,表现出明显的根部表达偏好性。超表达株系接种辣椒疫霉菌15 d后的株高、根长和鲜重显著高于对照,同时叶片萎蔫率和病斑长度显著低于对照植株。【结论】 鉴定获得一个大豆根特异性表达启动子及其核心序列,融合诱导性和组织特异性启动子核心元件的人工启动子p4XD-L5驱动抗性基因GmNDR1超表达,可显著增强转基因大豆发状根和本氏烟草对疫霉菌的抗病性。 相似文献