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1.
柑橘病虫害的蔓延危害是柑橘生产的重要制约因素。近些年,随着云南省玉溪市柑橘种植面积的不断增加,柑橘病虫害发生种类增多,危害加重,致使玉溪市柑橘存在果实品质差、产量低等问题。2014—2020年采取定点调查和普查相结合的方法,对玉溪市柑橘主要病虫害进行详细调查反复核实,共发现病虫害127种,包括病害30种、蛛形纲、昆虫纲、腹足纲3纲10目44科有害生物97种,其中危害较重的病害有溃疡病Xanthomonas axonopodis pv.citri、黄龙病Candidatus Liberibacter spp.、疫菌褐腐病Phytophthora itrophthora、炭疽病Colletotrichum gloeosporioides等4种,占病害种数13.3%;危害较为严重的虫害有柑橘全爪螨Panonychus ciri(McGregor)、柑橘潜叶蛾Phyllocnistis citrella stainton、柑橘小实蝇Dacus dorsalis(Hcndal)、橘蚜Toxoptera citricidus(Kirkaldy)、斜纹夜蛾Prodenia litura(Fabricius)、蓟马Scirtothrips citri(Moulton)等6种,占虫害种数的6.2%;虫害重于病害,优势种群集中。  相似文献   

2.
笔者列出了我国柑橘主产区发生危害的85种柑橘病害名称、病原菌、病害分布、危害部位,其中侵染性病害61种,非侵染性病害24种。侵染性病原物79种,包括病原真菌、病毒(类病毒)、细菌(假细菌)、植原体、线虫和寄生性种子植物。柑橘黄脉病、柑橘褪绿矮缩病、柑橘叶斑驳病、柑橘树皮裂纹类病毒、柑橘类病毒V和柑橘类病毒VI为国内新发现病害。  相似文献   

3.
[背景]在中国,柑橘黄龙病(citrus Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种('Candidatus Liberibacter asiaticus',CLas)所引起的一种毁灭性病害,严重威胁着柑橘产业的可持续发展.前期研究表明CLas全基因组上鉴定出3种单独类型的原噬菌体基因序列,而广东黄龙...  相似文献   

4.
黄龙病是世界柑橘产业的毁灭性病害,引起柑橘黄龙病的病原分为亚洲种、非洲种和美洲种共3个种,目前我国柑橘黄龙病均由亚洲种引起,建立一套快速检测技术对我国柑橘黄龙病的防控具有重要意义.本研究根据柑橘黄龙病亚洲种16S rDNA基因序列设计引物,建立了基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)的检测方法,并评价了该方法的灵敏度和检测准确性.结果表明,本研究所建立的柑橘黄龙病亚洲种RPA快速检测方法特异性强、灵敏度高、操作过程简便,检测灵敏度比常规PCR提高10倍,为基层农技人员开展柑橘黄龙病的快速检测提供了一种新方法.  相似文献   

5.
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《农村百事通》2007,(24):71-72
△广西防城港市读者(手机号:139××××0680)问:柑橘黄龙病该怎样防治?答:柑橘黄龙病是一种毁灭性病害,传播蔓延迅速,且现有的柑橘栽培品种都是感病的,因此,防治柑橘黄龙病必须采取综合措施,方能取得良好的效果。1.严格实施检疫。应严格禁止从病区调运苗木及带病材料(如接穗)。  相似文献   

6.
柑橘主要病虫害防治措施   总被引:1,自引:0,他引:1  
灵溪镇现有柑橘2000亩,主要品种有中熟温州蜜柑和早熟中川,近几年瓯柑发展较快。本地柑橘生产中主要虫害有红蜘蛛、锈壁虱、白粉虱、潜叶蛾,病害主要有黄龙病、疮痂病、炭疽病。以下介绍几种柑橘主要病虫害防治措施:1柑橘全爪螨(柑橘红蜘蛛)柑橘全爪螨是目前我国柑橘上普遍发生  相似文献   

7.
2015年夏季,在吉林省长春市果品市场发现了一种国内从未报道过的病害Monilia sp.所致的柑橘褐腐病.通过描述该病害的症状及病原菌显微镜下的形态,提出对我国柑橘产区病害监测及防治的建议.  相似文献   

8.
柑橘黄龙病(HLB)是世界范围内柑橘生产上的毁灭性病害,已在全球范围造成了巨大的经济损失.黄龙病由韧皮部限制性寄生菌Candidatus liberibacters spp.引起,主要通过柑橘木虱Diaphorina citri(Kuway-ama)在田间传播.目前,黄龙病的主要防治方法有:一是传统的"三板斧"防治策略...  相似文献   

9.
由柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter spp.)引起的柑橘黄龙病是一种极具破坏性的柑橘病害,严重影响柑橘产业的可持续发展。目前关于柑橘黄龙病的研究多以柑橘叶片为研究对象,而柑橘黄龙病是一种系统性病害,其症状在柑橘叶片、果实和根系上均有表现。近年来,越来越多的研究从根系的营养、基因和蛋白表达、根际微生物等角度研究柑橘黄龙病菌对柑橘根系的影响,因此就柑橘黄龙病菌与柑橘根系关系的最新研究结果进行综述,以期为系统开展柑橘黄龙病菌与柑橘根系互作关系的研究提供有益的借鉴和参考。  相似文献   

10.
农业和化学措施对柑橘树脂病和炭疽病的协同控制作用   总被引:2,自引:0,他引:2  
经形态与分子鉴定,上海崇明绿华柑橘基地危害柑橘的2种主要病害柑橘树脂病和炭疽病其病原菌为柑橘间座壳菌(Diaporthe citri)和胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides).对2种病原菌的室内药剂筛选结果表明:咪鲜胺、咪鲜胺锰盐络合物、多菌灵、甲基硫菌灵、丙环唑、苯醚甲环唑、戊唑醇、氟硅唑等药剂对2种病原菌菌丝生长均表现出85%以上的抑制效果.咪鲜胺、多菌灵、氟硅唑对柑橘树脂病菌菌丝生长的EC50分别为0.018、0.059、0.057μg/mL,对柑橘炭疽病病菌丝生长的EC50分别为0.066、0.073、0.266μg/mL.田间试验表明:咪鲜胺、多菌灵分别对柑橘叶片炭疽病、果实沙皮病(树脂病危害果实症状)、枝干树脂病均表现出显著的防治效果,一间一的间伐措施可以明显减轻过度密闭柑橘园柑橘枝干树脂病的发病程度.  相似文献   

11.
【目的】调查柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌(CLas)的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017—2019年3年间柑橘黄龙病的发病情况;同时分别采用已报道的柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)、柑橘裂皮病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘褪绿矮缩病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV)、柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)和柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)的特异性检测引物,提取样品的RNA,反转后以样品的cDNA为模板,通过普通PCR的方法分析梅州市抽检地区柑橘病毒病的发生情况。此外,以基于2种原噬菌体类型(SC1和SC2)对应的超变异基因区域设计的2对引物(Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2),运用普通PCR方法分析该地区CLas菌株原噬菌体的遗传多样性。【结果】除2018年9月梅州大浦顺兴公司蜜柚基地的抽检样品外,梅州市其他被检地区均发现CLas。总体来说,梅州市的脐橙CLas检出率为55.3%,蜜柚为61.5%,沙田柚为61.7%。其中2017年采集自平原县大拓镇的蜜柚和沙田柚样品CLas检出率为100%,兴宁市白马镇的蜜柚为100%,沙田柚为80%;其他抽检地区的样品CLas检出率在16.7%—83.3%。虽然梅州市部分地区的检出率较高,但其病原菌的含量并不高,大部分处于柑橘黄龙病发病初、中期,属可防可控阶段;此外,梅州市柑橘病毒的总检出率不高,CTV、CTLV和CYVCV为梅州的主要病毒,CEVd和CCDaV没有检测到。CTV、CTLV和CYVCV在脐橙上的检出率依次为78.9%、7.9%和21.1%,蜜柚为15.4%、25.0%和9.6%,沙田柚为6.4%、2.1%和4.3%。基于Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2来研究CLas原噬菌体多样性的PCR扩增条带共有4种类型(SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2),经过PCR电泳和测序得出,来自梅州市脐橙和沙田柚的CLas菌株以SC2-1型为主,蜜柚上以SC1-1型为主。【结论】梅州柑橘产区的柑橘黄龙病目前属于可防可控阶段,其病原菌菌株的原噬菌体在不同品种上具有其独特性;由于在抽检时发现有柑橘病毒病的存在,因此在种植过程中需加强种苗监管,同时应采取有效措施对柑橘黄龙病和柑橘木虱(Diaphorina citri)进行绿色防控。  相似文献   

12.
【目的】 柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是制约柑橘产业发展的重大病害,我国发生的黄龙病由韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)引起。本研究通过分析潜在耐黄龙病柑橘品种马蜂柑(Citrus hystrix)在感染黄龙病后不同时期的生物学症状、显微结构和转录组学差异,揭示马蜂柑不同时期对黄龙病菌具有耐性的分子机理,为进一步深入挖掘抗性基因及开展抗病育种打下基础。 【方法】 以嫁接在两年生卡里佐枳橙砧木上的马蜂柑作为供试材料,使用只感染CLas、其他常见柑橘病毒类病原均呈阴性的毒源为接毒材料对马蜂柑进行接种,并在接种毒源后每隔15 d进行定期的荧光定量PCR检测。将马蜂柑接种毒源4个月(最早检测到CLas阳性)作为感病前期处理,接种毒源14个月作为感病后期处理,以健康植株为对照,进行生物学症状和显微结构观察,分析其感病后不同时期的结构变化。结合比较转录组学分析与荧光定量PCR验证,解析其耐病相关机制。 【结果】 症状观察发现,马蜂柑在感病前期和感病后期,植株叶片几乎不显症;显微结构观察表明,马蜂柑在感病前期中脉组织结构清晰,细胞形态正常,无淀粉粒积累的现象,仅在后期出现韧皮部极少数的筛管被堵塞;对转录组测序结果进行筛选鉴定,马蜂柑感病前期共筛选鉴定到181个差异表达基因,感病后期共筛选鉴定到1 384个差异表达基因;比较转录组分析表明,马蜂柑感病前期和后期的差异表达基因主要涉及细胞壁代谢、防御反应、淀粉与蔗糖代谢、胼胝质合成以及信号转导等方面,其中在感病前期,淀粉与蔗糖代谢、细胞壁代谢相关的调控基因下调表达,在感病后期,水杨酸代谢及其信号转导途径、病程相关蛋白和谷胱甘肽转移酶相关的调控基因上调表达。 【结论】 马蜂柑响应CLas早期侵染主要表现为物理结构稳定、淀粉合成和光合作用等途径不受干扰;而水杨酸介导的抗性信号转导、效应蛋白触发免疫反应(effector-triggered immunity,ETI)激活的病程相关蛋白和谷胱甘肽转移酶参与的解毒作用是感病后期的主要耐病机制。  相似文献   

13.
王永  兰青阔  赵新  朱珠  程奕 《中国农业科学》2009,42(4):1473-1477
 【目的】建立转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法。【方法】以转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对CaMV35S基因的6个区域设计4种特异引物,利用1种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃保温1 h,通过荧光显色即可完成对转基因作物鉴定工作。同时对7种转基因作物进行LAMP检测。【结果】该LAMP方法通过特异性检测含有CaMV35S启动子的转基因作物,其检测结果的特异性与常规PCR方法结果一致,灵敏度是常规PCR的10倍。【结论】转基因作物LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合转基因作物的快速检测,有较好的应用价值。  相似文献   

14.
【背景】柑橘系统获得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)在柑橘抗黄龙病(Huanglongbing,HLB)过程中起着重要作用。水杨酸(SA)和水杨酸甲酯(MeSA)信号互换是激活植物SAR的关键信号转导途径,但其在抗HLB危害中的作用依然不清楚。【目的】以柑橘HLB不同耐病品种为材料,研究柑橘SAR及其信号转导的关键酶基因CsSABP2(salicylic acid binding protein 2)在HLB 病原菌‘Candidatus Liberibacter asiaticus’(CLas)侵染中的响应特征,了解柑橘SAR及CsSABP2响应CLas侵染的作用。【方法】从SAR Marker基因CsPR1CsPR2CsPR5表达、活性氧H2O2水平和淀粉含量变化等方面分析CLas侵染、外施SA和MeSA调控柑橘SAR的特征。进一步,基于易感HLB锦橙(Citrus sinensis)和耐HLB酸柚(C. grandis)感染CLas转录组测序比较分析,筛选和克隆响应CLas侵染的CsSABP2差异表达基因;生物信息学分析预测差异基因的生物学功能;qRT-PCR分析差异表达基因在锦橙、酸柚和耐HLB马蜂柑(C. hystrix)中响应CLas感染的表达变化;以锦橙叶片为试材分析差异表达基因响应外源SA和MeSA诱导的表达特征。【结果】SAR Marker基因响应CLas表达分析表明,CsPR1CsPR2CsPR5均正向响应CLas侵染上调表达,CsPR2CsPR5在酸柚和马蜂柑中表达水平高于锦橙,特别是叶肉中两个基因的表达水平均显著高于锦橙;相反,CsPR1在叶脉中上调表达水平明显高于叶肉,且在锦橙叶脉中表达水平显著高于酸柚和马蜂柑叶脉中。离体模拟SA和MeSA调控柑橘SAR反应显示,与SA处理相比,MeSA处理明显诱导CsPR1CsPR2CsPR5上调表达,同时非处理部位基因(特别是CsPR5)表达水平也明显上调。H2O2检测结果表明,外源MeSA诱导非处理部位H2O2积累显著强于SA。同时,通过对外施MeSA、SA的感病叶片进行连续5周的淀粉含量检测,发现MeSA能明显减少感病叶片中淀粉的积累。进一步转录组数据和生物信息学分析表明,4个SAR关键调控基因CsSABP2-1CsSABP2-2CsSABP2-3CsSABP2-4显著响应CLas侵染而差异表达,且编码蛋白质均含SABP2水解活性必需的保守结构域。qRT-PCR结果表明,CsSABP2-1CsSABP2-4在耐病品种酸柚和马蜂柑中受CLas诱导高水平表达且在叶脉中的表达水平高于叶肉;CsSABP2-2CsSABP2-3表达水平变化不明显。激素诱导结果显示,CsSABP2主要响应MeSA的诱导表达,MeSA显著诱导CsSABP2-2高水平表达(>10倍),且显著下调CsSABP2-1CsSABP2-4的表达(下调至0 h表达量的15%—55%)。【结论】耐病品种酸柚和马蜂柑SAR响应CLas的反应明显强于易感病品种锦橙,且MeSA在介导柑橘SAR抗病反应中起正向调控作用。SA与MeSA信号转导的关键酶基因CsSABP2-1 CsSABP2-4在柑橘SAR响应CLas侵染中起着重要作用,其高水平表达与柑橘HLB抗性紧密相关;而且CsSABP2-1 CsSABP2-2 CsSABP2-4在调控SAR应答柑橘CLas侵染中可能起着关键的协同作用。  相似文献   

15.
基于荧光显色的IBV LAMP检测方法研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
【目的】建立基于荧光显色的可视化禽传染性支气管炎病毒(IBV)环介导等温扩增(LAMP)检测体系,为IBV的快速临床检测提供有力的技术支持。【方法】根据NCBI中收录的IBV 5a+5b基因的8个区域设计了3对LAMP引物,通过对反应体系各组分和条件的优化,建立IBV LAMP检测方法,并对该方法的特异性和敏感性进行验证。分别用SYBR Green I和一定浓度比的钙黄绿素/锰离子混合物作为显色剂,对IBV LAMP检测结果进行可视化判定。应用该检测体系和PCR方法对临床送检的60份样品同时进行检测,比较2种方法的阳性检出率。【结果】成功建立了IBV LAMP检测方法,该方法能够在等温(63 ℃)条件下1 h内完成反应,具有良好的敏感性和特异性,最低可以检出1拷贝/μL的阳性重组质粒,比普通PCR方法敏感100倍,而对其他病毒检测结果均为阴性。应用SYBR Green I和钙黄绿素/锰离子显色时,阴阳性样品均有强烈的颜色对比,其中0.05 mmol/L钙黄绿素与0.6 mmol/L锰离子混合液可以用于LAMP扩增产物的判断,其结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致。在对60份临床样本的检测中,LAMP和PCR方法检测出的阳性样本数量分别为49份和42份。【结论】建立了基于荧光显色的IBV LAMP检测方法,该方法具有在科研机构、基层实验室特别是检测现场推广和应用的潜力。  相似文献   

16.
植物罹病组织中象耳豆根结线虫的LAMP快速检测方法   总被引:3,自引:0,他引:3  
【目的】建立一种基于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,从植物罹病组织中直接检测象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)的快速检测方法,为象耳豆根结线虫的监测和防治提供技术支持。【方法】根据象耳豆根结线虫与其它根结线虫ITS序列差异设计LAMP特异性引物,通过对LAMP反应条件中的Mg2+、dNTPs、甜菜碱和反应时间进行优化,同时对检测体系的特异性和灵敏度进行验证,建立一种从罹病植物组织中检测象耳豆根结线虫的LAMP快速检测方法。【结果】象耳豆根结线虫LAMP检测体系优化结果表明在Mg2+的浓度为5.0 mmol•L-1、dNTPs的浓度为2.4 mmol•L-1、不添加甜菜碱、反应时间为45 min的条件下,扩增效率最优。本研究建立的LAMP检测方法能够从11个植物线虫种群中特异检测出象耳豆根结线虫,检测灵敏度为1/200000头线虫DNA,比普通PCR灵敏100倍,能够直接从植物根结中检测出象耳豆根结线虫,准确度为100%。【结论】本研究以rDNA-ITS序列为靶基因建立象耳豆根结线虫LAMP快速分子检测方法,具有特异性强、灵敏度高、简单、快速、经济等特征,能够从罹病植物组织中快速准确地检测出象耳豆根结线虫,具有极高的实践应用价值。  相似文献   

17.
猪细小病毒LAMP检测方法的建立   总被引:5,自引:0,他引:5  
 【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪细小病毒(PPV)环介导等温扩增(LAMP)方法,为诊断猪细小病毒提供准确可靠工具。【方法】根据GenBank公布的PPV序列,在其保守序列区域设计了多套LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测反应进程并筛选最佳引物、反应条件,建立了对PPV病毒DNA进行特异扩增的 LAMP检测方法,并可通过加入SYBR Green I肉眼判断结果。【结果】该方法在63℃恒温下作用45 min,PPV病毒DNA获得了高效率的特异性扩增;其检出限量为0.23 TCID50,敏感性高;在反应结束后加入SYBR Green I肉眼判断结果,与Real Time Turbidimeter LA-320仪监测结果一致。通过对20份临床样品的LAMP检测与免疫荧光鉴定、PCR方法比对,符合率均为20/20。【结论】本研究建立的PPV LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏,操作简单、设备要求低的特点,适合用于临床PPV快速检测。  相似文献   

18.
基于gpd基因的大蒜黑腐病菌实时荧光定量PCR鉴定技术   总被引:2,自引:1,他引:1  
【目的】大蒜黑腐病菌(Embellisia allii (Campanile) Simmons)的检疫鉴定主要采用形态鉴定方法。不仅耗时长,而且大蒜黑腐病菌与本属其他种以及其他属的分生孢子非常相似,极难分辨,需要建立快速、有效的分子诊断方法。研究旨在建立实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)体系以准确、灵敏地鉴定大蒜黑腐病菌。【方法】从NCBI的GenBank数据库中,选取大蒜黑腐病菌和其他大蒜病害以及近似种的3-磷酸甘油脱氢酶(gpd)基因核酸序列数据15种,应用引物设计软件Primer express,根据探针设计原则从理论上选出1条探针和3对引物。根据试验结果对上述引物进行筛选,筛选出能够鉴定出大蒜黑腐病菌的特异性引物对和TaqMan探针。同时对反应体系中复性-延伸温度的反应参数进行优化,设计56、58、60℃ 3个温度梯度;将大蒜黑腐病菌基因组DNA在紫外核酸分析仪上进行定量后进行10倍的梯度稀释,对探针灵敏性进行测试,从而建立大蒜黑腐病菌TaqMan水解探针法qPCR检测体系。【结果】从基于GenBank上的15种gpd基因核酸序列设计的引物和探针中,筛选出能够鉴定大蒜黑腐病菌的特异性引物对Emb21/Emb32和TaqMan探针Emb。在供试的6种菌株中,只有靶标菌大蒜黑腐病菌利用该引物对和探针能够被特异性的检测到阳性,空白对照和其他参试菌均没有荧光信号的增加,检测为阴性。复性-延伸温度反应参数优化中,△Rn荧光信号增加值在58℃时达最大,56、60℃荧光信号增加值降低,经过多次重复试验,确定最佳的复性-延伸温度为58℃。灵敏度测试中,大蒜黑腐病菌DNA浓度稀释到140 pg时,所得的图形较好;当体系中模板浓度稀释到14 pg时,所得的图形较差。最终DNA检测灵敏度为140 pg。应用该引物和探针建立的qPCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出大蒜黑腐病菌。【结论】建立了大蒜黑腐病菌TaqMan探针法qPCR检测体系,该检测技术能够从供试的6种病原菌中特异性检测出大蒜黑腐病菌,检测灵敏度可达140 pg。建立的基于gpd基因的大蒜黑腐病菌qPCR方法具有高度的特异性和灵敏度,适合口岸大蒜黑腐病菌的快速检测。  相似文献   

19.
【目的】通过原噬菌体区域高度变异的基因位点研究柑橘黄龙病病原菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’)的种群分化,探讨病原菌种群遗传多样性水平和遗传结构。【方法】基于2种原噬菌体类型(SC1和SC2)对应的超变异基因区域设计2对引物(Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2),对中国不同柑橘产区的224个‘Ca. L. asiaticus’株系进行PCR检测和序列分析。【结果】PCR扩增的条带类型呈多态性,具有4种条带类型(SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2),西南地区以SC1-1型为主,广东、广西地区以SC2-1型为主,福建、江西、浙江地区没有明显优势的扩增型。分析SC1-1和SC1-2对应序列表明,其差异系由于132 bp的卫星序列和24 bp的小卫星序列2种串联重复序列数不同引起,而SC2-1和SC2-2的差异系由原噬菌体内部基因重排引起。【结论】中国不同地理来源病原菌株系在原噬菌体区域具有较丰富的多态性,对该基因区域研究将有助于揭示中国‘Ca. L. asiaticus’种群的遗传多样性。  相似文献   

20.
【目的】由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)侵染引起的十字花科根肿病是一种世界性土传病害,病原菌长期存在于土壤中,对十字花科作物造成严重威胁。改良叠氮溴化丙锭(propidium monoazide xx,PMAxx)可选择性地穿透受损的死细胞膜,并抑制死细胞DNA的实时荧光定量PCR(qPCR)扩增。本文将PMAxx与qPCR技术相结合,建立一种快速检测芸薹根肿菌活菌的方法,为根肿病的早期诊断及制定科学的防控措施提供依据。【方法】配置浓度分别为0、5、10、20、40、60 µmol·L-1的叠氮溴化丙锭PMA和改良叠氮溴化丙锭PMAxx,比较两种核酸染料对芸薹根肿菌死细胞DNA扩增的抑制效果,确定最佳核酸染料及工作浓度;设置光照时间分别为0、2、5、10、15和20 min,进行最佳光照时间的优化,建立芸薹根肿菌活细胞PMAxx-qPCR快速检测体系。设置芸薹根肿菌活孢子百分比为0、0.01%、0.1%、1%、10%、25%、50%、75%和100%的混合体系,验证PMAxx-qPCR体系的准确性,并应用于田间土壤样本中芸薹根肿菌活孢子的定量检测。【结果】PMAxx对芸薹根肿菌死细胞DNA的扩增抑制效果更好,当芸薹根肿菌浓度为1×108个孢子/mL,PMAxx预处理的最适终浓度为4 µmol·L-1,最佳光照时间为10 min时,可有效地抑制死孢子DNA的扩增,仅以有活力孢子DNA为靶标选择性地扩增。利用PMAxx-qPCR技术检测已知不同活孢子比例的菌悬液样品,各样品实测孢子存活率和理论存活率之间呈正相关(R2=0.992)。对田间采集的25份土壤样本,采用PMAxx-qPCR方法检测到11份样本中携带芸薹根肿菌,活细胞DNA浓度为32.35—6.97×103 fg·g-1。【结论】建立了基于PMAxx-qPCR的芸薹根肿菌活细胞定量检测技术,该技术具有快速、准确、灵敏的特点,解决了qPCR不能仅对活体病原菌进行准确鉴别和定量分析的问题,为制定有效的根肿病防控策略提供了依据。  相似文献   

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