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1.
《中国预防兽医学报》2021,(4)
为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究参照已有的研究报告,对PEDV ORF3基因序列进一步比较优化,选择PEDV ORF3更为保守的序列设计引物,经PCR扩增目的片段后构建了PEDV ORF3基因的重组质粒标准品pMD18-T-ORF3,以其为模板,经反应条件优化,建立了基于PEDV ORF3基因的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,以重组质粒标准品构建的标准曲线的相关系数为0.9982,Ct值与质粒标准品在102拷贝/μL～1010拷贝/μL范围内具有良好的线性关系。该方法除对PEDV检测结果为阳性外,对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪圆环病毒3型和猪繁殖与呼吸道综合征病毒核酸扩增结果均为阴性,特异性强;该方法对重组质粒标准品的检测下限为102拷贝/μL,比普通RT-PCR灵敏100倍,敏感性高;批内和批间重复试验的变异系数均小于5%,重复性好。临床样品的检测结果显示,本研究建立的荧光定量RT-PCR检出阳性样品22份,而常规RT-PCR仅检出16份阳性样品,二者的符合率为82.86%。本研究建立的荧光定量RT-PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,对PEDV的快速及定量检测具有重要意义。 相似文献
2.
《饲料与畜牧》2017,(12)
为了建立猪流行性腹泻病毒变异毒株快速、敏感的检测方法。本研究利用RT-PCR技术扩增出猪流行性腹泻病毒变异毒株S基因中298bp的保守序列,并克隆到pM D18-T载体中作为标准品制作标准曲线,建立了PEDV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达5.2×10~1拷贝,与猪流行性腹泻病毒经典毒株、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪蓝耳病毒、猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PEDV变异毒株的检测。 相似文献
3.
《中国预防兽医学报》2015,(6)
为建立一种快捷、特异、敏感检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的方法,本研究根据Gen Bank中登录的PEDV ZKHFQ株的N基因序列的保守区设计一对特异性引物,经过对反应条件进行优化,建立了检测PEDV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法。该方法对常见的病毒均未检测到荧光信号,而仅对PEDV检测为阳性,其灵敏度为57拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于1%。利用该方法对26份疑似PEDV感染的病料样品进行检测,结果显示本研究所建立的方法对PED的检出率比常规PCR高23.07%。本实验建立的荧光定量RT-PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可以用于临床PEDV的检测。 相似文献
4.
猪丁型冠状病毒与猪流行性腹泻病毒双重实时荧光定量RT-PCR方法的建立和初步应用 总被引：1，自引：0，他引：1
猪丁型冠状病毒(PDCoV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV)均为致病性冠状病毒,可以引起猪呕吐、腹泻脱水和新生仔猪死亡。为了建立一种快速检测PDCoV和PEDV的双重SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法,根据GenBank登录的2种病毒基因的保守序列,设计了两对特异性引物,分别扩增其N、M基因保守区,并将其克隆至pMD19-T载体;将10倍梯度稀释的混合重组质粒作为标准品模板,建立了一种检测PDCoV和PEDV的双重的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法,并对其反应的敏感度、特异性和重复性进行了检测。结果表明,本试验所建立的双重荧光定量RT-PCR检测方法对PDCoV和PEDV的最低检测量分别为51和32拷贝·μL-1,且与PBoV、TGEV、PRV、PCV2无交叉反应,特异性较好;对2016年至2017年在河北省收集的130份仔猪腹泻样本检测,结果显示,PDCoV的检出率为16.9%,PEDV的检出率为66.2%,二者同时感染的检出率为2.3%,与普通RT-PCR检测方法相比,敏感性更高。本研究为PDCoV和PEDV的诊断及分子流行病学调查提供了一种快速、定量检测方法。 相似文献
5.
为建立一种快速检测猪星状病毒4型(PAstV4)的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,根据已知的猪星状病毒4型序列的ORF1a基因设计了特异性引物,并将扩增片段克隆到pMD19-T载体上;将构建的重组质粒作为标准品建立SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,并对建立方法的灵敏性、特异性及重复性进行验证。结果显示,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法最低检测量为50.3拷贝·μL-1,其灵敏度是普通PCR的100倍;与CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、PDCoV无交叉反应,特异性较好;建立的标准曲线呈良好的线性关系,相关系数R2=1.00。应用该方法检测了2018-2019年收集的43份临床样品,阳性率为18.6%。本研究为猪星状病毒4型的临床检测建立了一种快速、灵敏、特异性强的方法。 相似文献
6.
《畜牧兽医学报》2020,(2)
为建立一种快速检测猪星状病毒4型(PAstV4)的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,根据已知的猪星状病毒4型序列的ORF1a基因设计了特异性引物,并将扩增片段克隆到pMD19-T载体上;将构建的重组质粒作为标准品建立SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,并对建立方法的灵敏性、特异性及重复性进行验证。结果显示,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法最低检测量为50.3拷贝·μL~(-1),其灵敏度是普通PCR的100倍;与CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、PDCoV无交叉反应,特异性较好;建立的标准曲线呈良好的线性关系,相关系数R~2=1.00。应用该方法检测了2018—2019年收集的43份临床样品,阳性率为18.6%。本研究为猪星状病毒4型的临床检测建立了一种快速、灵敏、特异性强的方法。 相似文献
7.
本试验旨在建立一种检测猪A组轮状病毒的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法.参考GenBank上登录的猪轮状病毒OSU株的VP6基因序列保守区设计一对特异性引物,通过RT-PCR方法克隆目的基因,并将其连入pMD 19-T Vector,制备阳性标准品,优化反应条件.建立的方法在1.0×102～1.0×109拷贝/μL范围内线性关系良好,反应扩增效率大于90％,扩增相关系数大于0.98.对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒及猪圆环病毒2型均检测不到荧光信号,表明该方法特异性强.该方法批内和批间变异系数均小于2％,重复性好.结果表明,建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法可为A组猪轮状病毒早期感染的诊断及病毒定量分析提供技术支持. 相似文献
8.
《中国预防兽医学报》2019,(1)
为建立猪肠道α冠状病毒(SeACoV)荧光定量检测方法,本研究采用RT-PCR方法扩增SeACoV N基因保守区序列,将其克隆至p EASY-Blunt载体,构建重组质粒p EASY-Blunt-PA-N作为标准阳性质粒,以其为模板建立SeACoV的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验验证。结果显示,建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法 Ct值与标准品模板在9.47×101拷贝/μL～9.47×107拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.996,斜率为-3.91。本实验建立的方法对PEDV、TGEV、PDCo V、PRRSV等猪常见腹泻病样品检测无扩增,表明特异性良好;敏感性试验结果显示,该方法检测下限可达到9.47×101拷贝/μL;重复性试验结果显示,组内变异系数在0.82%～1.01%,组间变异系数在1.20%～1.69%,重复性较好。采用本研究建立的方法对广西和云南等地70份临床样品进行检测,结果显示除阳性对照外,临床样品均为阴性,表明该病毒尚未传播至广东以外的省份。本实验首次建立了SeACoV N基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,为SeACoV快速检测和病毒感染预防提供技术手段。 相似文献
9.
为建立同时快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪圆环病毒3型(PCV3)的二重PCR方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV M基因和PCV3 Rep基因高度同源保守序列设计并合成2对特异性引物,分别扩增PEDV M基因与PCV3 Rep基因,经过反应条件优化,建立了检测PEDV与PCV3的二重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:该方法对PEDV和PCV3的检测结果为阳性,而对猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒等8种常见的病原体均未检测到荧光信号;且具有良好的线性关系,R^2为0.99;应用本方法对PEDV和PCV3的最低检出量分别为37.6拷贝/μL和61.2拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于2%。结果表明:本试验建立的PEDV和PCV3二重实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效、定量检测PEDV和PCV3提供了技术帮助。 相似文献
10.
为建立一种特异、灵敏、量化、快速的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,设计1对PEDV N基因的特异性引物,建立Eva Green染料的实时荧光定量RT-PCR的检测方法,并对疑似PEDV感染的临床样品进行检测。结果显示,所建立的实时荧光定量RT-PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数R2=0.999;不与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)发生交叉反应,具有较强的特异性;灵敏度比常规RT-PCR方法高100倍;重复性试验的变异系数均小于5%,重复性良好。对43份临床样品进行检测,结果比普通PCR多检出2份阳性。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法在特异性、灵敏度和重复性方面都很好,可用于临床PEDV检测。 相似文献