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为探讨miR-376b-5p靶向调控IGF1影响绵羊多羔性状的分子机制，本研究根据产羔记录选取高、低产羔数小尾寒羊各5只，同期发情处理后，采集卵泡期卵巢及其他6个组织，通过RT-qPCR、Western blot和双荧光素酶报告基因检测系统分析miR-376b-5p与IGF1在高、低产羔数小尾寒羊各组织中的表达量；并确定二者之间的靶向关系；随后，将体外合成的miR-376b-5p模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)转染至绵羊卵巢颗粒细胞中，检测miR-376b-5p对IGF1表达水平的调控情况，同时对多羔性状TGF-β信号通路中TGFβ1和PTGS2标志因子的表达进行分析。结果表明：1)组织表达谱显示，IGF1在绵羊卵巢组织中的表达量显著高于其他组织(P<0.05);RT-qPCR和Western blot显示，IGF1在高产羔数小尾寒羊卵巢组织中的表达量极显著高于低产羔数小尾寒羊(P<0.01);miR-376b-5p定量结果显示其表达趋势与IGF1相反(P<0.01);2)在线软件预测和双荧光素酶报告系统检测显示，miR-376b-5p可靶向结合IG... 相似文献
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【目的】卵巢颗粒细胞的增殖和分化是原始卵泡生长启动的关键因素,卵巢颗粒细胞过度凋亡是卵泡闭锁的主要原因,因此卵巢颗粒细胞的功能对卵泡生长发育、排卵、激素分泌等至关重要。研究通过探究连环蛋白β1（catenin beta 1, CTNNB1）对猪卵泡发育过程中颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素分泌等功能的影响,为猪卵泡发育的分子调控机制研究提供参考。 【方法】利用RNA抽提、实时定量PCR（Quantitative real time PCR, qRT-PCR）等方法,构建CTNNB1在母猪卵巢、肌肉、大脑等9个组织的表达谱;检测母猪性成熟过程中卵巢组织和小（≤3 mm）、中（3—6 mm）、大（≥6 mm）卵泡颗粒细胞中CTNNB1的表达情况。构建CTNNB1的真核表达载体及合成siRNA,转染至猪卵巢颗粒细胞,采用EdU、Annexin V- FITC/PI双染、ELISA等方法,检测CTNNB1对颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素分泌的影响,以及对类固醇激素合成通路重要基因转录表达的影响。【结果】与肌肉、大脑等组织相比,CTNNB1在卵巢中mRNA表达水平最高。性成熟母猪卵巢中CTNNB1转录水平显著高于性成熟前和性成熟后的母猪;卵巢卵泡中CTNNB1转录和蛋白水平随卵泡发育明显上调;且卵巢颗粒细胞中CTNNB1转录和蛋白水平也随卵泡的发育逐渐上调。更重要的是,CTNNB1显著促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡;CTNNB1能够上调CYP1A1和HSD17B7的转录水平,下调CYP11A1、ESR1、ESR2、FSHR、LHR和NR5A1等类固醇激素合成相关基因的转录水平,进而促进颗粒细胞雌激素的分泌,抑制颗粒细胞雄激素和孕激素的分泌。【结论】本研究证实CTNNB1可能通过促进颗粒细胞增殖及雌激素的合成和分泌,抑制颗粒细胞凋亡及雄激素、孕激素的合成和分泌,进而促进卵泡的生长发育。 相似文献
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【背景】卵泡是卵巢的基本结构和功能单位,其主要功能是排卵和分泌激素。颗粒细胞能促进卵泡发育,其过度凋亡能抑制卵泡发育,诱导卵泡闭锁,进而降低雌性动物发情频率,影响雌性动物繁殖力。现已有研究发现,KISS1在卵巢组织中发挥着重要作用。【目的】研究通过干扰KISS1,以阐释KISS1对猪卵巢颗粒细胞凋亡、周期及分泌雌激素能力的影响,为完善KISS1在猪颗粒细胞中的分子调控机制提供一定的依据。【方法】设计KISS1的干扰片段KISS1-siRNA,转染体外培养的母猪卵巢颗粒细胞,通过实时定量PCR（quantitative real time PCR, qRT-PCR）检测干扰KISS1对母猪卵巢颗粒细胞中磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase, PI3K）信号通路部分基因转录水平的影响;采用流式检测法、Annexin V- FITC及ELISA技术,分别探究干扰KISS1对颗粒细胞周期、凋亡及雌二醇（estradiol, E2）分泌量的影响,最后使用qRT-PCR技术检测KISS1对雌激素受体及雌激素信号通路关键基因转录水平的影响。【结果】在猪颗粒细胞内,干扰KISS1后,PI3K通路激活相关基因PIK3CG、PI3CI、PDK1及AKT1转录水平下降,其中关键基因AKT1的转录水平显著降低（P<0.05）,PI3K通路激活抑制相关基因FOXO3、TSC2及BAD转录水平也有所降低;干扰KISS1后,颗粒细胞周期在细胞分裂间期（G0/ G1）阻断,细胞的凋亡率显著上升,细胞中E2的浓度显著降低（P<0.01）,雌激素受体ESR1和ESR2及雌激素通路的基因Star、CYP17、3B-HSD、17B-HSD和CYP19A转录水平也相应显著下降（P<0.05）。【结论】KISS1能够参与猪颗粒细胞PI3K和雌激素通路,干扰KISS1能够使卵巢颗粒细胞阻滞在细胞分裂间期,促进颗粒细胞凋亡,降低颗粒细胞分泌雌激素的能力,表明KISS1对于卵巢颗粒细胞的分裂与生长、雌激素分泌具有重要作用。 相似文献
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为探讨在卵泡期绵羊生殖器官中细胞凋亡的作用机制,本试验以小尾寒羊和萨福克羊为研究对象,采用DAPI(4′,6′-联脒-2-苯基吲哚)原位荧光标记技术,对高繁殖力品种小尾寒羊和低繁殖力品种萨福克羊成年母羊卵泡期主要生殖器官(卵巢、输卵管、子宫)进行细胞凋亡的确认与定位。结果显示:小尾寒羊和萨福克羊卵巢中卵泡上皮细胞、颗粒细胞、膜细胞均有凋亡现象。在三级卵泡和成熟卵泡的颗粒细胞和膜细胞中,萨福克羊比小尾寒羊表达出较多数量的凋亡细胞,两品种羊在卵泡期输卵管各部,子宫内膜腺体中几乎均未检测到凋亡细胞,子宫内膜基质中检测到少量细胞发生凋亡。因此,研究表明细胞凋亡是母羊生殖器官变化的重要调节机制,可能与造成两者繁殖力高低差异有关。 相似文献
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【目的】通过分析成熟卵泡液外泌体（mature follicular fiuid Exosomes, mffEXs）和闭锁卵泡液外泌体（atretic follicular fiuid Exosomes, affEXs）miRNA的表达差异,探索卵泡液外泌体（EXs）miRNA在卵泡发育和闭锁过程中的调控作用。【方法】本研究通过抽提4—6 mm猪成熟发育和闭锁卵泡的卵泡液分离外泌体,进行粒径分析及Western Blot检测对EXs进行鉴定,接下来对特征性EXs携带的miRNA测序和功能富集分析,筛选关键信号通路和差异基因。最后,将mffEXs和affEXs作为添加剂进行颗粒细胞培养,利用Q-PCR检测技术分析关键基因的表达,验证两类卵泡液内EXs miRNA在卵泡发育中的调控功能。【结果】成功分离了mffEXs和affEXs,对比mffEXs测序结果,affEXs中有90个miRNA上调表达,220个miRNA下调表达,表明了卵泡液中的miRNA表达水平与调控卵泡发育有关;KEGG富集分析结果显示两类卵泡的差异信号通路主要集中在Ras、cAMP、P53和MAPK等信号通路,涉及调控卵母细胞发育、减数分裂以及颗粒细胞细胞周期等生物学功能。在闭锁卵泡中,上调表达的ssc-let-7a和ssc-miR-133a-3p分别潜在靶向调控细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK1）和胰岛素生长因子（IGF1）,抑制了G1和G2/M期的运转和类固醇激素代谢,促使颗粒细胞周期运转受阻和颗粒细胞凋亡,引起卵泡闭锁的发生;下调的ssc-miR-21-5p潜在靶向肿瘤抑癌基因（P53）,抑制细胞周期运转,促使颗粒细胞凋亡。在体外培养的颗粒细胞中分别添加mffEXs和affEXs,Q-PCR结果显示CDK1在mffEXs中显著上调表达,而P53显著下调表达,表明了测序分析结果的可靠性。这些结果均显示了affEXs中miRNA表达水平的变化促使颗粒细胞凋亡和细胞周期阻滞,引起卵泡闭锁。【结论】猪affEXs携带miRNA增加了对CDK1、IGF1和P53的表达调控,抑制颗粒细胞细胞周期运转和类固醇激素代谢等信号通路,引起颗粒细胞凋亡,导致卵泡闭锁。 相似文献
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【目的】长江三角洲白山羊是我国及世界上唯一能生产优质笔料毛的山羊品种,课题组前期转录组测序结果表明：在优质笔料毛与非优质笔料毛个体皮肤组织中,MAP3K1的表达水平存在显著差异。探究优质笔料毛性状形成过程中与MAP3K1相互作用的关键miRNAs及其对山羊毛囊干细胞增殖和凋亡的影响,为长江三角洲白山羊的分子选育提供理论依据。【方法】通过生物信息学网站（StrBase、miRDB、TargetScan、miRWalk、DAVID、KEGG、RNAhybrid）预测、筛选与MAP3K1具有靶向关系的miRNAs,利用在线网站Venny 2.1绘制韦恩图。通过构建miR-31-5p过表达载体,MAP3K1、RASA1野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体,验证miR-31-5p与MAP3K1、RASA1之间的靶向关系,并结合qPCR和Western Blot技术检测过表达后miR-31-5p对MAP3K1、RASA1 mRNA和蛋白表达水平的影响。为探究过表达miR-31-5p后对细胞增殖、凋亡的影响,分析了转染miR-31-5p后毛囊干细胞内增殖相关基因（PCNA, CDK1, CCND2）、抗凋亡基因（Bcl-2）和促凋亡基因（Bax）的mRNA和蛋白表达水平;同时结合CCK-8,EdU,流式细胞术等方法验证过表达miR-31-5p对毛囊干细胞活力、细胞周期以及凋亡的影响。【结果】通过数据库共同预测到3个可能与MAP3K1相作用的miRNAs,结合现有miRNAs在皮肤和毛囊细胞上研究,最终选用评分相对较高的miR-31-5p作为研究对象。转染miR-31-5p后检测细胞内的miR-31-5p的相对表达量,发现miR-31-5p表达含量极显著高于对照组及空白载体组（P<0.01）;双荧光素酶报告基因结果显示过表达miR-31-5p可促使MAP3K1活性升高（P<0.01）,结合TargetScan、KEGG数据库预测发现miR-31-5p可靶向MAPK信号通路中位于MAP3K1的上游抑制因子RASA1。过表达miR-31-5p抑制了RASA1的活性（P<0.01）;同时,qPCR及Western Blot表明：过表达miR-31-5p后显著抑制RASA1的mRNA和蛋白表达,促进了MAP3K1的表达（P<0.01）。CCK-8结果显示过表达miR-31-5p后提高了细胞增殖能力（P<0.01）,通过EdU染色发现过表达miR-31-5p后,EdU阳性细胞率显著高于空白组（P<0.01）,促进细胞增殖;细胞周期数据说明过表达miR-31-5p后, G1/G0期细胞所占比例为52.23%,显著低于Control组（56.81%,P<0.01）,减缓了G1/G0期细胞阻滞,而S期和G2/M期差异不显著,但仍有上升趋势。通过细胞凋亡试验发现过表达miR-31-5p组活细胞率为93.8%,总凋亡率为4.9%,而空白组活细胞率仅为90.1%,总凋亡率为8.41%,说明在过表达miR-31-5p后细胞凋亡率明显下降（P<0.05）;最后检测miR-31-5p对增殖和凋亡相关基因的影响,发现过表达miR-31-5p后显著提高了增殖相关基因、抗凋亡基因（Bcl-2）的mRNA和蛋白表达水平（P<0.05）,降低了促凋亡基因（Bax）的mRNA和蛋白表达水平。最终根据所研究出的结果绘制miR-31-5p在毛囊干细胞中的分子作用机制图。【结论】 miR-31-5p通过靶向抑制MAPK信号通路中的RASA1,上调MAP3K1表达水平,进而促进毛囊干细胞增殖并抑制其凋亡,为进一步阐明调控长江三角洲白山羊优质笔料毛性状的分子形成机制提供理论依据。 相似文献
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研究猪卵泡期内有腔卵泡发育和闭锁中颗粒细胞自噬与凋亡、卵泡内调控因子、类固醇激素及相关酶类的变化,为提高排卵前卵泡发育数量提供理论依据。从猪卵泡期卵巢中分离3~5 mm有腔卵泡,根据发育变化分为健康卵泡、早期闭锁和晚期闭锁3类,应用HE染色观察内部形态结构变化,应用酶免法检测卵泡液中雌二醇(E2)和孕酮(P4)的浓度变化,采用Real-time PCR方法检测自噬相关基因(Becline、LC3B、ATG3、ATG5、ATG7)、凋亡相关基因(Caspase-3、Bim、Bcl-2和Bax)、类固醇合成酶基因(CYP11A1、3βHSD、CYP17A1、CYP19A3)、激素受体和卵泡内关键调控基因(FSHR、ERα、CART、SMAD4)在不同类型卵泡中的表达变化。结果表明,健康卵泡中颗粒细胞层完整,有少量凋亡细胞,早期和晚期闭锁卵泡中颗粒细胞层分散,且凋亡细胞明显增多。早期和晚期闭锁卵泡中P4/E2显著高于健康卵泡,自噬和凋亡相关基因的表达水平在早期和晚期闭锁的卵泡中显著高于健康卵泡,类固醇合成酶基因CYP11A1和3βHSD的表达量在早期和晚期闭锁卵泡中显著高于健康卵泡,CYP17A1、CYP19A3、FSHR、ERα和SMAD4的表达量在早期和晚期闭锁卵泡中显著低于健康卵泡,而CART的表达量则呈现相反的趋势。由此可见,颗粒细胞自噬和凋亡是卵泡闭锁的主要诱因,而类固醇合成酶基因CYP11A1和3βHSD通过提高卵泡液中孕酮的水平加速了卵泡闭锁的进程。 相似文献
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【背景】颗粒细胞类固醇激素的合成能力对卵泡发育及成熟具有重要作用,但其关键的调控因子尚不完全清楚。笔者前期的研究表明肝激酶B1（liver kinase B1,LKB1）基因参与细胞的脂类代谢,类固醇激素的合成与脂类代谢密切相关,并且有研究结果亦显示LKB1敲除可引起小鼠卵巢早衰,表明LKB1对维持卵巢的功能很关键,其在颗粒细胞的确切功能需要进一步研究。【目的】探究LKB1在牛卵泡中的表达模式及其对颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用, 为母牛繁殖生理调控研究提供理论依据。【方法】采用免疫组织化学染色对LKB1蛋白在卵泡中进行定位研究;同时分离培养牛原代颗粒细胞,并以促卵泡素受体（follicle stimulating hormone receptor, FSHR）蛋白作为标记基因,细胞免疫荧光染色鉴定颗粒细胞及纯度;然后以原代颗粒细胞为模型,采用siRNA沉默LKB1的技术,利用qRT-PCR方法检测LKB1功能缺失对类固醇激素合成相关基因表达的影响,另一方面采用腺病毒过表达LKB1,qRT-PCR和ELISA技术验证LKB1对类固醇激素合成相关基因表达的调控作用及雌二醇分泌。【结果】 1) LKB1蛋白在卵泡中的细胞均表达,但颗粒细胞的染色信号强于膜细胞,进一步的定量分析显示颗粒细胞的表达量显著高于卵泡膜细胞。2) 分离培养的牛原代卵泡颗粒细胞贴壁生长、细胞形态多呈圆形,能被颗粒细胞标志基因FSHR抗体标记。3) RNAi技术能显著抑制LKB1的表达。与对照相比,siRNA1和siRNA2干扰LKB1的效率分别为48% (P<0.05)和52% (P<0.05);沉默LKB1显著降低颗粒细胞类固醇激素合成基因 STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,分别下调了约为对照组的60%、80%和50%。4) LKB1过表达腺病毒及对照组对颗粒细胞均具有高的感染效率,LKB1过表达效率高达10倍（P<0.01）;过表达LKB1显著上调STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,进一步研究显示LKB1基因功能获得促进颗粒细胞雌二醇的分泌（P<0.05）。【结论】LKB1在卵泡颗粒细胞中高表达,促进类固醇激素生成基因STAR 、CYP11A1和CYP19A1的表达和雌二醇的分泌。本研究将为LKB1调控牛颗粒细胞类固醇激素合成的功能提供直接的理论依据。 相似文献
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[背景]大豆异黄酮主要包括染料木素和大豆苷元,发挥类雌激素样作用,能够清除自由基,促进细胞增殖.颗粒细胞是卵泡内重要的细胞群体,其生理状态与卵巢功能直接相关.颗粒细胞凋亡常引起卵泡闭锁.牦牛是青藏高原特有物种之一,但其繁殖率低,其具体机制尚不明确.卵巢颗粒细胞是研究雌性动物生殖调控机制的理想细胞模型.[目的]探讨大豆异... 相似文献
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为阐明甘加型藏羊(Ovis arise)发情周期下丘脑-垂体-卵巢(hypothalamic-pituitary-ovarian axis, HPO)轴中雌激素受体β(estrogen receptor β,ERβ)mRNA和蛋白的表达及分布,本试验选取健康且在发情周期内的甘加型藏羊32只,运用qRT-PCR、Western blot 技术和免疫组织化学染色法检测甘加型藏羊发情周期ERβ mRNA及蛋白在HPO轴中的表达和分布差异。结果显示,甘加型藏羊整个发情周期(发情前期、发情期、发情后期及间情期)ERβ mRNA及其蛋白在HPO轴中均有表达和分布。下丘脑中ERβ mRNA及其蛋白在下丘脑中发情前期表达最多,显著高于其他3个时期(P<0.05);垂体中ERβ mRNA及蛋白均在发情前期表达最高,与其他3个时期差异显著(P<0.05);在卵巢中间情期表达最高,显著高于其他3个时期(P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示,ERβ阳性表达主要分布在下丘脑大神经元胞体和轴突中;在垂体中多分布在远侧部及中间部嗜酸性细胞胞浆中,胞核中分布较少;在卵巢中,生长卵泡颗粒细胞胞浆和胞核、卵泡内膜细胞及黄体细胞胞浆中均有分布。ERβ mRNA及其蛋白在甘加型藏羊发情周期HPO轴的差异性表达表明雌激素受体β参与调节甘加型藏羊的生殖生理活动。 相似文献
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【背景】山羊第一卵泡波中的优势卵泡（dominant follicles, DF）和从属卵泡（subordinate follicles, SF）是整个卵泡发育过程中最为关键的两个阶段。随着卵泡的进一步发育,最终DF可能发育成为成熟卵泡,直到排卵;SF将走向闭锁,其中颗粒细胞的凋亡是导致卵泡发生闭锁的关键因素。然而目前对促进卵泡的优势化或导致其闭锁的分子机理尚不清楚。【目的】通过对山羊第一卵泡波中DF和SF颗粒细胞进行高通量测序,旨在筛选影响卵泡发育的关键基因,为深入探究卵泡发育的调控机制提供理论依据。【方法】选取10只1岁龄健康的贵州白山羊分别注射前列腺素F2α,使其同期发情,此后每天用B超检测并记录卵泡的生长情况,发情3 d后,统一屠宰并采集第一卵泡波中DF (直径4.5—6 mm)与SF (直径3 —4.5 mm),分别分离其中的颗粒细胞,提取总RNA、构建文库后通过Illumina Hiseq 2500平台进行测序。利用FastQC对测序产出raw reads进行质量评估并经过过滤后,获得品质较高的clean reads;使用Trinity对得到的clean reads进行重新组装,从而获得unigenes;使用CLC Genomics Workbench将unigenes与山羊RefSeq数据库进行比对获得mRNA;使用DESeq2 软件对获得的mRNA进行差异表达分析;分别采用goseq和kobas软件对得到的差异表达基因进行GO分析及KEGG信号通路分析;最终通过qRT-PCR对筛选出的可能影响卵泡发育的关键基因进行验证。【结果】分别对测序得到的raw reads进行过滤后,在DF颗粒细胞中获得43 217 934条clean reads,占raw reads的比例为95.19%;SF颗粒细胞中获得40 766 348条clean reads,占raw reads的比例为95.35%。将得到的unigenes与山羊的RefSeq 数据库进行比对后,共得到33 896条带有注释的转录本,再通过设定FPKM>1, q value<0.05,共在两种卵泡颗粒细胞中获得13 644个基因。设定参数：FPKM≥1,SF-FPKM/DF-FPKM>1,P<0.05,获得695个差异表达mRNA,其中233个在SF颗粒细胞中表达显著上调,462个表达显著下调;对所获得695个差异表达mRNA进行GO功能富集分析,共分为三大类42组：其中生物学过程占47.6%,细胞组分占47.6%,分子功能占4.8%;KEGG信号通路分析,发现20条通路,其中与核糖体通路相关的基因富集最为显著。通过在Genecard中进行功能分析后,筛选6个可能与山羊卵泡发育密切相关的基因,其中PRLR、PTX3、RGN在SF颗粒细胞中表现为上调;DKK3、ALDH1A2、RARRES1则表现为下调。qRT-PCR显示PRLR、RGN、DKK3、ALDH1A2、RARRES1的表达趋势与高通量测序结果一致,且RGN在从属卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于优势卵泡（P<0.01）;DKK3、ALDH1A2、RARRES1在优势卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于从属卵泡（P<0.01）。【结论】DKK3、ALDH1A2、RARRES1和RGN在优势卵泡和从属卵泡中表达量存在极显著差异,推测在山羊卵泡发育过程中可能促进卵泡的优势化或导致闭锁,对深入探究卵泡发育的调控机制具有重要意义。 相似文献