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1.
研究旨在通过构建西农萨能羊脂肪酸合酶(FAS)基因乙酰/丙二酸单酰基转移酶(MAT)区域的重组腺病毒载体,为下一步其在奶山羊乳腺上皮细胞中过表达,进一步研究MAT的功能和作用机制做准备.根据GeneBank收录的西农萨能羊MAT序列设计引物,PCR扩增并克隆测序.连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上并线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy1的E.Coli Bj5183感受态细胞进行同源重组,并用Pac Ⅰ酶切鉴定.提取质粒后转化E.coli Top10进行扩繁.将本次克隆的MAT序列与GeneBank收录的序列相比对,在601 bp处,碱基由G转变为A,导致氨基酸序列由从201转变为Thr201.经鉴定并测序分析,试验成功构建MAT基因的重组腺病毒表达载体,可用于下一步病毒包装. 相似文献
2.
本研究选择O型FMDV VP1基因上保守序列作为可能的干扰位点,合成了siRNA,将siRNA克隆到pSIREN-Shuttle中,获得siRNA重组表达载体pShuttle-VP1。用限制性内切酶PI-Sce I和I-Ceu I双酶切siRNA重组表达载体和腺病毒质粒载体pAdeno-X,利用体外连接法获得了重组质粒。经过PCR扩增、酶切鉴定及序列测定,证明成功构建了重组腺病毒质粒pAdeno-VP1。利用脂质体转染法,将Pac I线性化的重组腺病毒质粒pAdeno-VP1转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒rAdeno-VP1。经过PCR鉴定正确后大量增殖,增殖的重组腺病毒经过浓缩、纯化得到了高滴度的病毒。用终点稀释法测定病毒滴度为2.5×109PFU/mL。将rAdeno-VP1感染IBRS-2细胞后,12 h后再加入100TCID50的FMDV O/HKN/2003。结果显示,重组腺病毒能够抑制FMDV的复制。 相似文献
3.
《畜牧兽医学报》2017,(5)
本研究旨在通过构建腺病毒介导的体外超表达载体,探究腺苷甲硫氨酸转移酶(MAT2B)对猪肌内脂肪细胞分化的影响。本研究以猪脂肪组织为试验材料,提取总RNA,并反转录得到cDNA,参考GenBank收录的猪MAT2B基因mRNA序列设计引物,PCR扩增并连接到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,进行测序鉴定。结果表明,构建的穿梭载体与骨架载体pAdEasy-1可以实现同源重组,即腺病毒重组载体pAd-MAT2B构建成功;用PacⅠ限制性内切酶酶切线性化pAd-MAT2B载体并回收质粒大片段转染293A细胞可以实现病毒的成功包装,病毒滴度测定可满足原代细胞侵染需要。转染猪原代肌内脂肪细胞后,MAT2B的mRNA和蛋白水平实现了显著的上调。油红O染色结果表明,过表达MAT2B促进了肌内脂肪细胞脂质积累;实时定量结果证明,MAT2B促进成脂标志基因PPARγ和aP2表达的显著上调。综上所述,腺病毒介导的体外表达载体可以成功的实现MAT2B基因超表达;MAT2B正向调控猪肌内脂肪细胞分化。 相似文献
4.
猪圆环病毒2型ORF2重组腺病毒的构建与鉴定及其免疫效果研究 总被引：5，自引：2，他引：3
为了研究含有猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的重组腺病毒作为基因工程疫苗的潜在应用价值,本试验根据GenBank中猪圆环病毒2型基因序列,设计了1对引物,用于猪圆环病毒2型ORF2基因的扩增。将目的基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ORF2。经PCR方法和限制性内切酶酶切法及测序证明该基因已成功连接后,重组腺病毒转移载体经PmeⅠ酶切线性化,在BJ5183细菌中与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-CMV-ORF2。经PCR方法和PacⅠ酶切方法及测序鉴定表明该重组腺病毒载体已构建成功。PacⅠ酶切线性化pAd-CMV-ORF2,脂质体法转染AD293细胞进行病毒的包装和扩增。PCR及RT-PCR、IFA、Western blotting检测目的基因及其表达。结果表明,本试验成功构建了重组腺病毒pAd-CMV-ORF2。3次噬斑试验纯化重组腺病毒,测得其TCID50为10-8.75/0.1 mL。将重组腺病毒接种SPF级雌性BALB/c小鼠,用ELISA抗体检测试剂盒检测特异性抗体水平。小鼠免疫试验测得其特异性抗体水平较高,为PCV2重组腺病毒基因工程疫苗的进一步研究打下基础。 相似文献
5.
[目的]旨在通过构建秦川牛丙酮酸脱氢酶β亚基(Pyruvate dehydrogenase β subunit,PDHB)基因的重组腺病毒载体,为研究PDHB基因在牛前体脂肪细胞分化过程中的功能做准备。[方法]根据牛PDHB基因mRNA序列(GenBank Accession No.NM_001035435)设计引物,克隆该基因的编码区(Coding Sequence, CDS)序列。测序验证后将其重组到穿梭载体pAdTrack-CMV上,经PmeⅠ线性化后,转化到含有pAdEasy-1腺病毒骨架载体的E. coli BJ5183感受态细胞中进行同源重组,以获得重组质粒pAd-PDHB。再将经PacⅠ酶切线性化的pAd-PDHB转染到HEK 293A细胞中,进行病毒包装并扩增高滴度病毒Ad-PDHB,绿色荧光蛋白(GFP)标记法测定病毒滴度。将高浓度的Ad-PDHB病毒感染牛肌内前体脂肪细胞,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PDHB的表达量。[结果]经测序验证,本实验克隆获得的牛PDHB基因CDS与数据库GenBank收录的序列一致。将PDHB基因CDS与穿梭载体pAdTrack-CMV重组并转染HEK 293A细胞后成功获得了重组腺病毒Ad-PDHB,其滴度为1.66×109 PFU.mL-1。腺病毒Ad-PDHB侵染牛肌内前体脂肪细胞后,PDHB在mRNA的表达水平比对照组高25.5倍。[结论]成功克隆了秦川牛PDHB基因并构建了重组腺病毒质粒pAd-PDHB,并获得能够在牛肌内前体脂肪细胞中过表达PDHB基因的高滴度重组腺病毒Ad-PDHB。 相似文献
6.
应用PCR技术扩增牛新孢子虫NcSRS2基因,纯化PCR产物后与克隆载体pMD18-T Simple Vector连接,将PCR、酶切鉴定及测序分析正确的pMD-18T-NcSRS2重组质粒进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,克隆至相同酶切回收后的腺病毒穿梭载体pCR259中,再将PCR、酶切鉴定正确的pCR259-NcSRS2重组质粒转染293细胞,应用IF-AT和Western-blotting技术检测重组质粒在293细胞中的表达情况。结果显示,扩增的牛新孢子虫NcSRS2基因长度为1 227bp,与GenBank中发表的NcSRS2（AF061249）核苷酸序列同源性为99%,构建的pCR259-NcSRS2重组质粒在293细胞中得到瞬时表达,表达蛋白的相对分子质量为43 000,具有较好的反应原性。本试验为新孢子虫病腺病毒载体疫苗的构建奠定了基础。 相似文献
7.
将携带有化学合成的SREBP-1c基因的质粒先用Xba Ⅰ酶切,Klenow补平突出末端,纯化回收后再用Hind Ⅲ酶切,切胶回收目的基因片段;并将其克隆至用EcoR Ⅴ/HindⅢ酶切回收的pShuttle-EGFP-CMV(-)TEMP穿梭载体上.经酶切鉴定后,重组穿梭质粒和腺病毒pAdxsi质粒分别用I-Ceu Ⅰ+I-Sce Ⅰ双酶切处理,T4DNA连接酶连接,获得重组质粒pAdxsi-GFP-SREBP1c,酶切鉴定后经Pac Ⅰ酶切线性化转染HEK293细胞,经包装扩增后用TCID50测定病毒滴度.以重组腺病毒感染犊牛原代肝细胞,采用qRT-PCR和Western blot检测细胞中SREBP1c mRNA和蛋白的表达量.结果显示,重组腺病毒酶切鉴定正确,滴度可达1.2×1010,腺病毒感染犊牛原代肝细胞中SREBP-1c mRNA和蛋白的表达显著升高.结果表明,本试验成功构建了SREBP-1c基因过表达重组腺病毒,且SREBP-1c在犊牛原代肝细胞中高度表达. 相似文献
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为构建猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒,试验根据GenBank中登录的猪附红细胞体ENO基因序列（登录号：CP002525.1）设计特异性引物,对ENO基因进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物克隆到pMD19-T载体中。用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ对pMD19T-ENO进行双酶切后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体PCR259中,构建PCR259-ENO重组质粒,提取重组质粒进行鉴定。应用脂质体介导转染法将鉴定正确的PCR259-ENO重组穿梭质粒转染293细胞,应用间接免疫荧光法（IFTA）检测ENO基因在293细胞中的表达。结果显示,试验克隆的ENO基因长为1 182 bp,编码393个氨基酸,与GenBank中ENO基因序列（登录号：CP002525.1）同源性为99%。构建的重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO经PCR和酶切鉴定正确,并且能在293细胞中表达,表明ENO基因成功插入腺病毒穿梭质粒PCR259中,重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO构建成功。 相似文献
9.
为构建猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒,试验根据GenBank中登录的猪附红细胞体ENO基因序列(登录号:CP002525.1)设计特异性引物,对ENO基因进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物克隆到pMD19-T载体中。用KpnⅠ和XhoⅠ对pMD19T-ENO进行双酶切后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体PCR~259中,构建PCR~259-ENO重组质粒,提取重组质粒进行鉴定。应用脂质体介导转染法将鉴定正确的PCR~259-ENO重组穿梭质粒转染293细胞,应用间接免疫荧光法(IFTA)检测ENO基因在293细胞中的表达。结果显示,试验克隆的ENO基因长为1 182bp,编码393个氨基酸,与GenBank中ENO基因序列(登录号:CP002525.1)同源性为99%。构建的重组腺病毒穿梭质粒PCR~259-ENO经PCR和酶切鉴定正确,并且能在293细胞中表达,表明ENO基因成功插入腺病毒穿梭质粒PCR~259中,重组腺病毒穿梭质粒PCR~259-ENO构建成功。 相似文献
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《中国兽医学报》2017,(2):254-257
PCR扩增牛源犬新孢子虫NcAMA1基因,克隆至pMD18-T simple载体;将鉴定正确的NcAMA1基因亚克隆至pCR259腺病毒穿梭载体,构建重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcAMA1;依次转化HighQ-1Transpose-AdTM294和HighQ-1TM感受态细胞,构建NcAMA1基因重组腺病毒表达质粒T294-NcAMA1;PacⅠ酶线性化后,脂质体介导转染至QBI-HEK293细胞,包装Ad5-NcAMA1重组腺病毒。结果表明,获得Ad5-NcAMA1重组腺病毒滴度为5.6×109 TCID50/mL;经PCR检测到重组腺病毒NcAMA1基因;经IFAT和Western blot检测NcAMA1基因在QBIHEK293细胞中获得表达,表达蛋白相对分子质量为68 000,具有较好的反应原性。本试验成功构建了Ad5-NcAMA1重组腺病毒,为牛源犬新孢子虫NcAMA1基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定基础。 相似文献
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本研究通过构建腺病毒介导的体外超表达载体，探究腺苷甲硫氨酸转移酶2A（methionine adenosyltransferase 2A，MAT2A）基因在猪肌内脂肪细胞分化中的作用。根据GenBank中猪MAT2A基因mRNA序列（登录号：NM_001167650.1）设计引物，提取猪脂肪组织细胞总RNA并反转录获得cDNA，以此为模板进行PCR扩增并连接到pAdTrack-CMV腺病毒穿梭载体中，对重组质粒pAd-MAT2A进行测序鉴定；pAd-MAT2A载体经PacⅠ限制酶酶切线性化，经质粒大片段回收纯化后转染293A细胞进行病毒包装；采用实时荧光定量PCR检测MAT2A基因表达情况，并提取蛋白进行Western blotting分析，取分化第8天的细胞进行油红O染色。结果表明，穿梭载体pAdTrack-CMV-MAT2A构建成功，并能与骨架载体pAdEasy-1实现同源重组；腺病毒载体pAd-MAT2A转染293A细胞后，病毒滴度达到1E+6 PFU/mL，可满足侵染猪肌内脂肪细胞的需要。实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示，MAT2A基因mRNA和蛋白水平均显著上调。油红O染色结果显示，过表达MAT2A基因可促进猪肌内脂肪细胞内脂滴聚积。结果表明，腺病毒介导的MAT2A基因过表达在猪肌内脂肪细胞中呈上调趋势，MAT2A基因可促进脂质积累。 相似文献
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为构建牛分支杆菌ag85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出ag85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒。将此重组质粒转化入大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定。酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同。结果表明,成功地克隆并构建了ag85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b。 相似文献
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J.‐J. Luo H.‐W. Song B. Zhang L.‐L. Li Y.‐G. Chen Y. Peng L.‐Z. Wu J.‐X. Fan J.‐S. Zhan 《Journal of animal physiology and animal nutrition》2014,98(3):517-521
To clone adiponectin (ADPN) gene from Shaziling porcine adipocyte and construct its eukaryotic expression vector, total RNA was extracted from subcutaneous fatty tissue. One pair of specific primers was designed by Primer 5.0 software according to the sequence of ADPN gene of porcine available in GenBank. The ADPN gene was amplified by PCR from cDNA and cloned into pMD18‐T vector to construct recombinant clonal vector pMD‐ADPN, sequenced and analysed. A recombinant expression plasmid pPICZaA‐ADPN was constructed by subcloning the cloned ADPN gene into the linearized pPICZaA vector. Then, the plasmid pPICZaA‐ADPN was expressed in Pichia pastoris (GS115) by electrotransformation. Western blot and Bradford analysis were used to determine the target protein induced by methanol. Results showed that the genome size of ADPN was 732 bp and encoded 244 amino acid, the nucleotide sequence of ADPN shared 100% identity with that of porcine available in GenBank. Western blot and Bradford analysis showed that the recombinant ADPN was expressed in GS115 correctly and has certain immune activity. The expression level of ADPN was 28.5 μg/ml. In conclusion, the recombinant ADPN could express in eukaryotic expression vector pPICZaA‐ADPN constructed in this study effectively. 相似文献
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【目的】构建猪神经介素B受体(NMBR)基因慢病毒过表达载体,并检测其在猪Leydig细胞中的表达,为研究NMBR基因过表达在猪睾丸间质(Leydig)细胞中的功能提供参考。【方法】根据猪NMBR基因(GenBank登录号:KM058699)CDS序列设计并合成特异性酶切引物,通过RT-PCR扩增获得猪NMBR CDS全长序列,构建pMD19-T-NMBR质粒;通过Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ对pCD513B-1和pMD19-T-NMBR质粒双酶切,构建pCD513B-1-NMBR重组质粒;将pCD513B-1-NMBR重组质粒与辅助质粒共转染人胚肾细胞(HEK-293T),转染48 h后通过荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)情况,收集细胞培养液上清获得猪NMBR基因过表达慢病毒,并通过倍比稀释法测病毒效价;然后将猪NMBR基因过表达慢病毒转染猪Leydig细胞,转染48 h后观察细胞中GFP表达,收集细胞并通过实时荧光定量PCR检测NMBR mRNA的表达情况。【结果】通过RT-PCR成功扩增获得猪NMBR CDS全长序列,大小为1 173 bp;pMD19-T-NMBR重组质粒双酶切为2条特异性条带,条带大小分别与pMD19-T质粒和猪NMBR CDS序列片段大小一致,表明成功构建pMD19-T-NMBR质粒;通过双酶切获得线性化的pCD513B-1和NMBR序列;RT-PCR和测序结果表明,成功构建慢病毒过表达载体pCD513B-1-NMBR;pCD513B-1-NMBR转染48 h后,HEK-293T细胞中呈现大量绿色荧光,表明病毒包装成功,病毒效价约为4×106 TU/mL;NMBR基因慢病毒转染猪Leydig细胞48 h后,80%以上细胞有GFP表达,表明大部分细胞成功转染慢病毒;实时荧光定量PCR检测结果表明,转染慢病毒后能够极显著增加NMBR mRNA的表达(P＜0.01)。【结论】本试验成功构建了猪NMBR基因慢病毒过表达载体,并证实猪NMBR基因过表达慢病毒能够增加猪Leydig细胞NMBR基因的表达,为研究NMBR基因过表达在猪Leydig细胞中的作用奠定基础。 相似文献
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为了构建叉头框L2(Forkhead box L2,FOXL2)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因复制缺陷型腺病毒载体,试验将克隆的FOXL2基因与IRES-GFP片段通过酶切、纯化等方法共同连接到pShuttle-CMV载体中,再与pAdEasy-1腺病毒质粒在BJ5183大肠杆菌中进行同源重组,得到复制缺陷型AD-FOXL2腺病毒载体,再用PacⅠ酶线性化后转染HEK293细胞,观察绿色荧光表达,并测量病毒效价。结果表明:将AD-FOXL2腺病毒载体用PacⅠ酶线性化后,得到1个大于23 kb的大片段和1个4.5 kb的特异性小片段,证明同源重组成功;将所得的腺病毒载体转染HEK293细胞,可以观察到GFP的表达,证明包装成功,并测得病毒效价为1×10-8.61/0.1 mLTCID50。 相似文献
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试验利用Trizol法从鸡肠道组织提取总RNA,采用特异性引物通过RT-PCR扩增出α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ(α-2,3-sialyltransferaseⅠ,ST3GALⅠ)基因的cDNA片段,并将其克隆至pGEM-T easy载体,获得阳性重组质粒,再以阳性重组质粒为模板亚克隆ST3GALⅠ基因的完整ORF区,定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,进行PCR、限制性酶切和DNA序列分析鉴定。结果表明,ST3GALⅠ基因全长1029 bp,测序结果同GenBank数据库收录的序列一致,无任何密码子缺失与突变,插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上的目的基因大小方向均正确。本研究成功构建了pcDNA3.1(+)-ST3GALⅠ真核表达载体,为下一步的真核表达及对ST3GALⅠ基因的功能研究奠定了基础。 相似文献
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根据GenBank上发表的牛舌抗菌肽(Lingual antimicrobial peptide,LAP)基因cDNA序列设计1对特异引物,从患乳腺炎的奶牛乳腺组织中以RT-PCR方法扩增LAP基因片段,将其克隆到pMD19-T Simple载体中测序。重组质粒经EcoRⅠ+BamHⅠ双酶切回收目的基因片段,亚克隆入增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1中构建重组融合表达质粒pEGFP-LAP,将其脂质体转染COS-7细胞,经荧光显微镜观察到融合表达的绿色荧光蛋白,采用RT-PCR检测到LAP基因在COS-7细胞中转录。pEGFP-LAP重组表达质粒的成功构建为进一步研究奶牛LAP基因的表达特性及利用基因工程技术防治奶牛乳腺炎奠定了基础。 相似文献
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根据GenBank中已发表的犬新孢子虫SAG1基因序列(AF132217),设计了一对含有Kozak序列、起始密码子、终止密码子、BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的引物。以含有SAG1基因的重组质粒pMD-18T-SAG1为模板,经PCR扩增获得SAG1基因,利用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切该片段,回收含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点粘性末端的SAG1基因片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pVAX1真核表达载体中,获得重组质粒pVAX1-SAG1,经PCR鉴定、酶切分析和重组质粒的序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。 相似文献
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本研究根据GenBank已收录奶牛ApoB100基因序列,设计特异性引物获得目的基因。经pGM-T载体克隆,对重组质粒进行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定并测序,序列同源性达100%;将目的基因连接到pET-28a表达载体中,提取质粒,转化到Rosetta(DE3)中,筛选的阳性克隆经IPTG诱导。SDS-PAGE初步分析表明,成功获得分子质量为35 ku的蛋白质;Western blotting结果呈阳性,表明通过本试验成功获得了目的蛋白。 相似文献