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1.
为了研究噬茵体尾丝蛋白gp35、gp38在噬菌体宿主识别中的作用,扩增并克隆gp35、gp38基因,分别构建重组表达质粒,得到重组融合蛋白后免疫家兔制备多克隆抗体,并检测不同的抗血清对噬菌体增殖的影响.结果显示,经SDS-PAGE及Western blot鉴定证实得到含有GST标签的67 000、53 000的gp35、gp38重组融合蛋白;抗噬菌体Bp7尾丝蛋白gp38与gp35的抗血清均能明显抑制噬菌体Bp7的增殖,而其中gp38的抗血清更是能完全抑制Bp7增殖,证明gp35、gp38参与噬茵体Bp7的宿主识别过程. 相似文献
2.
《畜牧兽医学报》2018,(11)
为了研究噬菌体Bp7蛋白gp38在噬菌体吸附宿主菌过程中的作用,PCR扩增gp38基因,对gp38蛋白氨基酸序列特征进行分析和同源性比对,构建重组表达质粒pColdTF-gp38,在E.coli BL21中诱导表达,SDSPAGE电泳和Western blot检测重组蛋白gp38的表达;亲和层析法纯化蛋白,制备gp38多克隆抗体。免疫电镜检测gp38在噬菌体Bp7表面的定位,蛋白竞争试验和抗体阻断试验测定gp38及其抗体对噬菌体Bp7吸附效率的影响。序列分析结果表明,gp38蛋白氨基酸序列与T4噬菌体无同源性,与噬菌体T2、T6有同源性,C端序列保守区与高变区间隔排列,呈现马赛克特征;构建的重组质粒pColdTF-gp38在E.coli BL21实现可溶性表达,制备的gp38多克隆抗体效价达1∶16;免疫电镜检测结果表明,gp38蛋白抗体能够与长尾丝结合,引起噬菌体Bp7的聚集;蛋白竞争试验和抗体阻断试验结果表明gp38蛋白及其抗体均能完全抑制噬菌体Bp7对宿主菌E.coli K12的吸附。以上研究结果表明,gp38是噬菌体Bp7的尾丝蛋白,位于长尾丝末端,作为受体识别蛋白在噬菌体Bp7吸附宿主菌过程中具有关键作用,这为进一步阐明宽宿主谱噬菌体Bp7识别受体的机制提供了理论基础。 相似文献
3.
为了研究噬菌体尾丝蛋白gp37在识别宿主菌大肠埃希菌K12过程中的作用,PCR扩增获得gp37基因C端1 161bp序列,以EGFP为荧光标签,构建重组表达质粒pET-28a-EGFP-gp37,在大肠埃希菌BL21(DE3)中IPTG诱导表达重组蛋白EGFP-gp37,亲和层析纯化蛋白。SDS-PAGE及Western blot检测结果表明,重组蛋白EGFP-gp37在大肠埃希菌BL21(DE3)为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白量的23%。EGFP-gp37融合蛋白与大肠埃希菌K12相互作用,激光共聚焦显微镜检测结果显示,尾丝蛋白gp37能够吸附到宿主菌K12表面,表明尾丝蛋白gp37参与宿主菌受体的识别和吸附过程。 相似文献
4.
《动物医学进展》2015,(7)
为了解噬菌体Bp7尾丝蛋白gp38的密码子使用特征,利用生物信息学方法对1株临床分离的多价烈性噬菌体Bp7尾丝蛋白gp38与其他5株T4类噬菌体进行密码子用法的分析比较。结果发现,Bp7尾丝蛋白gp38与其他5株T4类噬菌体密码子的使用模式差别大,Bp7尾丝蛋白gp38偏好于以C结尾的密码子,而其余5株噬菌体偏好A或U结尾;除了AUG(Met)和UGG(Trp)外,还确定了Bp7尾丝蛋白gp38使用的25种高频密码子;通过6株噬菌体gp38的密码子偏性比较发现,Bp7与任何一株噬菌体都存在较大差异;聚类分析的结果也表明,Bp7尾丝蛋白gp38与其余5株噬菌体不属于一类。总体上,噬菌体Bp7尾丝蛋白gp38在密码子使用上比较特殊,gp38基因密码子的分析将为进一步研究噬菌体Bp7的感染机制及扩宽其裂解谱奠定基础。 相似文献
5.
为了解噬菌体vB-EcoP-Bp4(简称Bp4)尾部蛋白基因的密码子使用特性,利用生物信息学方法对N4类噬菌体Bp4的3个尾部蛋白基因gp10、gp11、gp13与其他5株同源性较高的噬菌体进行密码子偏性分析。结果表明,噬菌体Bp4尾部蛋白基因与其他5株噬菌体尾部蛋白基因密码子使用模式基本一致,偏爱以A或U的密码子结尾;除了AUG(M)和UGG(W)外,针对Bp4的3个尾部蛋白基因gp10、gp11、gp13分别确定了14种、17种及16种高频密码子。通过6株噬菌体尾部蛋白基因密码子偏性比较和聚类分析发现,Bp4可预测蛋白gp10与ECBP1最相近,尾丝蛋白gp11与EC1-UPM、PhAPEC5较相近,而尾刺蛋白gp13与ECBP1、EC1-UPM最相近。本研究发现噬菌体Bp4尾部蛋白基因密码子使用的偏性结果与同源性高低相一致,将为进一步研究噬菌体Bp4提供依据。 相似文献
6.
温和噬菌体P88由溶原性大肠杆菌K88诱导得来,前期研究结果表明其尾丝蛋白的716-746位氨基酸为其受体识别的关键区域。本研究旨在确定该关键区域内的关键氨基酸位点。采用大肠杆菌无痕缺失的方法以溶源大肠杆菌K88的基因组为操作对象,将P88尾丝蛋白中的第716、719、721、722、725、730、734、736、744和746位的氨基酸分别定点突变为丙氨酸,丝裂霉素C诱导定点突变溶原菌K88,之后用P88的宿主菌DE048筛选和纯化定点突变噬菌体,并测定定点突变噬菌体宿主谱。在构建的10株大肠杆菌K88定点突变株中,有5株可以诱导出与亲本噬菌体P88具有相同宿主谱的噬菌体突变株,然而尾丝蛋白第719、721、730、734和736位氨基酸定点突变的K88突变株无法用DE048筛选出突变噬菌体粒子,因此推测噬菌体尾丝蛋白第719、721、730、734和736位氨基酸为其受体识别的关键氨基酸位点。本研究为温和噬菌体基因和宿主谱的改造提供了理论基础。 相似文献
7.
《家畜生态学报》2021,42(7)
为了解撒坝猪源大肠杆菌噬菌体分离株的生物学特性。自撒坝猪源大肠杆菌中分离到一株裂解性噬菌体,利用PCR扩增噬菌体衣壳蛋白gp23基因,并通过同源性比对及遗传进化分析来鉴定噬菌体。经增殖纯化培养后测定噬菌体的效价和对菌株的裂解效应,而后测定其最佳感染复数、热稳定性、pH稳定性及绘制生长曲线以探究该噬菌体的生物学特性。结果表明,分离株衣壳蛋白gp23基因与噬菌体slur14亲缘关系最近,属于有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科T4-like噬菌体;分离株具有较高的效价,达8.67×10~9 pfu/m;针对实验室保存的92株已确定血清型的大肠杆菌裂解率为61.95%,完全裂解率为27.17%;在60℃条件下作用30 min,或在pH5和pH9时,噬菌体的效价表现明显下降;生长曲线绘制后可知该噬菌体感染宿主菌的潜伏时间约为30 min,爆发时间约为120 min,裂解量为41 pfu/cell。该试验成功分离得到裂解能力较强、裂解谱较广且对理化因素耐受力较强的T4-like噬菌体。 相似文献
8.
为拓宽噬菌体宿主谱,本研究通过将产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)特异性噬菌体v B_Eco M_JS09与肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7细菌进行多轮共培养,筛选到了6株能够同时裂解ETEC和EHEC O157∶H7的噬菌体,并多次传代和宿主谱鉴定,选择其中1株噬菌体Bp47-12鉴定其生物学特性。双层琼脂平板试验结果表明,噬菌体Bp47-12在平板上均呈现出了典型的裂解性噬菌体特征,空斑透亮,边缘整齐清晰,无晕环噬菌斑;宿主谱鉴定结果表明,ETEC和EHEC O157∶H7菌株均对噬菌体Bp47-12敏感,实现了噬菌体在ETEC和EHEC O157∶H7菌株之间的交叉裂解反应,拓宽了亲本噬菌体JS09的宿主谱;噬菌体Bp47-12能够耐受60℃左右高温,在p H值3~9时效价稳定;最佳感染复数为1;潜伏期为30 min,爆发期为70 min,平均爆发量分别为15;体外裂解试验结果表明,在5 h之内噬菌体Bp47-12能够有效裂解ETEC和EHEC O157∶H7菌株,OD600值下降约0.66;吸附曲线结果表明,在25 min之内,效价为105 PFU/mL的噬菌体Bp47-12能够完全吸附到宿主菌表面。本研究具有潜在的应用价值,也为拓宽裂解性噬菌体宿主谱和应用噬菌体提供了科学依据。 相似文献
9.
裂解性噬菌体能够特异性裂解细菌,本研究分析了一株从自然界中分离的宽宿主谱裂解性大肠杆菌噬菌体的种属和进化关系。前期用Adams双层平板琼脂法从猪场污水中分离纯化出一株裂解性噬菌体v B_Eco M_JS09,裂解谱分析能够裂解禽致病性大肠杆菌和产肠毒素大肠杆菌。扩增分析gene18、gene 23序列,并根据gp18和gp23氨基酸序列构建系统进化树,分析JS09的遗传进化关系。结果表明噬菌体v B_Eco M_JS09基因组为ds DNA,属于有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科、T4-like噬菌体、T-evens亚群。其gp18氨基酸序列与大肠杆菌噬菌体RB69同源性最高,为100%;gp23氨基酸序列与大肠杆菌T4噬菌体同源性最高为96%。该结果为禽致病性大肠杆菌和产肠毒素大肠杆菌的防控提供了生物学基础。 相似文献
10.
《畜牧兽医学报》2017,(12)
为了研究噬菌体Bp7穿孔素holin的特征及其对细菌的抑制作用,根据噬菌体Bp7的基因序列,设计引物PCR扩增穿孔素holin基因,并对其序列进行比对和分析。构建holin原核重组表达质粒pCold-holin,在大肠杆菌BL21中诱导表达,摸索最佳表达条件。亲和层析法纯化蛋白质,并对其抑菌活性进行测定。结果表明,噬菌体Bp7的holin蛋白含有一个跨膜区,属于Phage-holin-T家族;在E.coli BL21表达的重组holin蛋白以可溶性形式存在。表达菌E.coli BL21浊度测定试验结果表明holin蛋白的表达在4h内能够显著抑制表达菌E.coli BL21的增殖,活菌数减少,菌体出现凝集现象。研究结果提示噬菌体Bp7的holin蛋白具有抑菌活性,这将为进一步研究穿孔素的抑菌机制奠定基础。 相似文献
11.
通过生物信息学软件对噬菌体vB_EcoM-Bp7裂解酶基因的密码子用法及偏性分析。利用Mobyle中的CodonW 1.4.4及cusp程序计算密码子偏性的各种指标,并对7个噬菌体裂解酶基因序列中的总GC含量、密码子第1、2位GC含量平均值和第3位的GC含量进行分析,利用MegAlign软件对7株噬菌体裂解酶进行氨基酸序列分析,构建系统发育树。结果表明,除噬菌体phi68外,Bp7裂解酶基因与其他5株噬菌体的裂解酶基因密码子使用模式基本一致。偏爱使用以A或U为结尾的密码子;除了AUG(Met)和UGG(Trp)外,还确定了Bp7裂解酶使用的12种高频密码子;偏性比较发现,Bp7裂解酶基因密码子偏性与IME08最相近,与JS98次之;进化分析及聚类分析均表明Bp7裂解酶基因与IME08亲缘关系最近。分析结果将为进一步研究噬菌体Bp7的进化奠定基础。 相似文献
12.
利用大肠杆菌BL21表达禽流感病毒蛋白AM2,分离纯化目的蛋白,进行小鼠免疫制备多克隆抗体。将A型禽流感病毒M2基因的原核表达重组质粒pGEX-6p-1-AM2转化大肠杆菌感受态细胞BL21,经IPTG诱导后,在大肠杆菌表达系统中获得表达,并分离纯化蛋白,制备抗原免疫动物,得到了pGEX-6p-1-AM2的多克隆抗体。经western-blot免疫印迹分析,自制的多克隆抗体能特异地与AM2蛋白相互作用,这说明试验制备了特异性良好的抗AM2的多克隆抗体。 相似文献
13.
In order to study the function of canine distemper virus (CDV) V protein,V gene fragment was inserted into the pGEX-6p-1 vector,and then pGEX-6p-1-CDV-V recombinant expression plasmid was obtained.Purified V protein immunized BALB/c mice to prepare the positive serum.Meanwhile,to confirm the distribution of V protein and subcellular localization with confocal laser technology,a eukaryotic expression recombinant plasmid pcDNA3.1-CDV-V was built,then transfected into Vero cells.The results showed that V protein was successfully expressed and the positive serum was prepared.The recombinant plasmid pcDNA3.1-CDV-V was expressed in Vero cells and mainly expressed in cytoplasm.The results laid a function for functional studies of CDV V protein. 相似文献
14.
为研究犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV） V蛋白的功能,将CDV V基因片段与pGEX-6P-1载体连接,构建pGEX-6P-1-CDV-V重组表达质粒,通过原核表达系统表达了V蛋白,并将纯化的V蛋白免疫BALB/c小鼠,制备阳性血清。同时,将CDV V基因片段与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNA3.1-CDV-V重组表达质粒,经转染Vero细胞后,用激光共聚焦技术确定V蛋白在真核细胞中的分布及亚细胞定位。结果显示,成功表达了V蛋白,并制备了阳性血清。重组质粒pcDNA3.1-CDV-V在外源真核细胞Vero中获得了表达,表达蛋白主要聚集于细胞质。本试验结果为进行CDV V蛋白的功能研究奠定了基础。 相似文献
15.
为了解乳酸菌噬菌体的生物学特性,并为制定乳酸菌发酵生产过程中噬菌体污染的防控措施提供试验数据和参考,本研究通过斑点试验和双层琼脂平板法,以干酪乳杆菌（L. casei） ATCC 393、戊糖乳杆菌（L. pentosus） KLDS 1.0413、短小乳杆菌（L. brevis） ATCC 367为指示菌从乳制品、泡菜样品中分离乳酸菌噬菌体,通过透射电镜观察噬菌体形态,噬菌体基因组限制性内切酶作用分析其包装机制,并进行宿主范围和一步生长曲线的测定,SDS-PAGE分析噬菌体结构蛋白,对获得的噬菌体进行生物学特性鉴定。结果显示,分离获得3株烈性乳酸菌噬菌体,依次命名为Lc、Lpen和Lbre。电镜结果显示,噬菌体Lc、Lpen均由多面体头部和非收缩性尾部组成,而噬菌体Lbre由多面体头部和收缩性尾部组成。根据形态学分析,Lc和Lpen属于长尾噬菌体科（Siphoviridae）,B1类,Lbre属于肌尾噬菌体科（Myoviridae）,A1类。噬菌体基因组经限制性内切酶作用后,核酸电泳结果显示,噬菌体Lc、Lpen基因组均为异质平末端,其包装机制属满头包装,即pac-型,而Lbre含有黏性末端,其包装机制属于cos-型。宿主范围测定结果显示,噬菌体Lc、Lbre对宿主专一,而Lpen宿主谱较广。一步生长曲线显示,噬菌体Lc、Lpen和Lbre潜伏期分别为60、45和150 min,裂解期分别为45、90和105 min,裂解量分别为47、24和30 PFU/cell。SDS-PAGE分析显示,噬菌体Lc结构蛋白有7个,主要结构蛋白分子质量约为50 ku;噬菌体Lpen和Lbre结构蛋白均有5个,主要结构蛋白分子质量分别约为55和50 ku。综上,本研究分离获得3株乳酸菌烈性噬菌体,并对其主要生物学特性进行鉴定,对了解乳酸菌噬菌体及后续乳酸菌噬菌体污染的防治提供了试验数据和理论依据。 相似文献
16.
本研究从河北省保定地区6份疑似感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)病猪的肺脏中,通过RT-PCR获得PRRSV GP5蛋白完整的基因片段,克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,再设计一对引物从重组载体pMD18-T-GP5中扩增出缺失了N端30个氨基酸残基的dGP5的编码序列dORF5,克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,构建原核重组质粒(pGEX-6p-dGP5),转化至E.coli BL21感受态细胞。经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳可检测到分子质量为40ku的目的蛋白。经Western blot分析表明,该蛋白与PRRS阳性血清具有良好的免疫反应性,为进一步研究PRRS新型基因工程疫苗和诊断试剂奠定了基础。 相似文献
17.
应用RT-PCR技术,利用含有酶切位点的上、下游引物扩增得到Vero E6细胞中编码B23.1蛋白的基因片段,并进行序列测定及分析,结果表明,B23.1基因含有一个长901 bp的开放阅读框(ORF),未发现碱基的插入和缺失。将其进行BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,而后定向克隆到经相同双酶切的pGEX-6p-1载体中,构建的重组质粒命名为pGEX-6p-B23.1;将该质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,在IPTG诱导下进行表达;SDS-PAGE结果表明,表达出与预期大小相符的约68 ku的重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式存在;Western blotting分析结果表明,表达的重组蛋白与B23蛋白单克隆抗体有很好的反应活性。 相似文献
18.
猪蓝耳病病毒抗体双抗原夹心ELISA方法的建立及初步应用 总被引：2，自引：0，他引：2
根据PRRSV VR-2332株序列设计了1对扩增PRRSV N蛋白基因的特异性引物,从PRRSV北方株感染细胞中提取总RNA,通过RT-PCR获得长约372 bp的N蛋白编码基因片段。将其克隆到pGEX-6p-1质粒,构建了原核表达载体pPRRS-N。重组基因在大肠杆菌中表达出相对分子质量约为41 000的融合蛋白,目的蛋白表达量约占菌体蛋白的28.5%。利用此重组融合N蛋白建立了一种检测PRRSV特异性抗体的双抗原夹心ELISA,并通过与商品化试剂盒的应用比较对本方法进行了系统评价。分析了来自北京、山东、河南、河北4省区13个养猪场的260份血清,结果表明,本方法的敏感性和特异性分别为93.5%和86.7%,与IDEXX PRRSV抗体检测试剂盒检测结果的符合率达到91.5%。 相似文献