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1.
旨在探究山羊DCT基因启动子活性区及相关转录因子对该基因的调控作用,为山羊DCT基因的表达调控提供理论依据。通过对山羊DCT基因5′侧翼区序列及第一外显子区序列进行生物信息学分析,并与人和小鼠DCT基因启动子序列进行比对,同时结合在线启动子预测结果,采用快速克隆的方法构建5个5′系列缺失序列的启动子报告基因载体,以此为基础构建3′缺失序列的6个报告基因载体,并构建SOX10、MITF和OTX2转录因子结合位点点突变的6个报告基因载体,以瞬时转染的方法转染A375细胞,双荧光素酶检测试剂盒检测缺失片段和点突变片段的启动子活性。结果表明,成功构建了山羊DCT基因11个不同长度的启动子报告基因载体,-990~+232bp的P3片段荧光素酶活性极显著高于其他片段(P0.01),基于P3构建的3′系列缺失片段中-881~-154bp的P8片段荧光素酶活性极显著高于其他片段(P0.01)。转录因子SOX10结合位点突变的载体荧光素酶活性极显著降低(P0.01),MITF和OTX2结合位点突变的载体荧光素酶活性极显著增强(P0.01)。山羊DCT基因启动子核心调控区位于-881~-154bp区域,转录因子SOX10对山羊DCT基因发挥正调控作用,而转录因子MITF和OTX2对山羊DCT基因的调控作用尚需深入研究。 相似文献
3.
《畜牧兽医学报》2017,(5)
旨在筛选调控山羊毛色基因PMEL的启动子活性区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为彩色山羊的育种和改良提供思路。以山羊基因组DNA为模板,PCR扩增PMEL基因不同长度的启动子缺失片段,定向克隆至pGL3-basic载体,将重组质粒转染到293T和A375细胞,通过双荧光素酶检测系统测定相对荧光素酶活性值;利用生物信息学方法对PMEL基因核心启动子区的转录因子结合位点进行预测,随后利用重叠延伸PCR分别对pGL3-327质粒上预测的转录因子结合位点进行点突变并构建突变载体,利用双荧光素酶检测系统进行活性验证。结果显示,本研究成功构建了7个不同长度的启动子片段,其中6个片段具有明显的启动子活性。经过双荧光素酶活性检测发现山羊PMEL基因-251/+76区域为核心启动子区域。通过不同长度的启动子片段的活性比较发现,-251/-62区域的缺失造成启动子活性从最高到消失,表明该区域对山羊PMEL基因转录调控有重要影响,生物信息学分析发现该区域存在5个转录因子结合位点,利用点突变构建了5个突变载体,经过双荧光素酶检测发现5个突变载体的活性均显著下降。提示这5个转录因子是山羊PMEL基因转录的正调控元件。本研究确定了山羊PMEL基因启动子核心区域为-251/+76,NF-1(-206/-197)、Sp1(-186/-174)、Sp1(-151/-139)、CREB(-91/-82)和Sp1(-82/-71)结合位点为山羊PMEL基因转录的正调控元件。 相似文献
4.
《畜牧兽医学报》2016,(4)
旨在克隆测定牛肌原调节蛋白2基因(Myozenin2,MYOZ2)启动子的全长序列,进行活性区域分析,为牛MYOZ2基因功能和表达调控机理研究提供理论依据。通过5′RACE方法确定牛MYOZ2基因转录起始位点;采用PCR技术,以牛基因组为模板克隆MYOZ2基因启动子序列。利用在线软件分析启动子区域中可能包含的转录因子结合位点。依据分析结果重新设计引物,构建7个包含不同缺失片段的双荧光素酶报告基因载体,转染C2C12细胞系,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性。结果表明,克隆得到牛MYOZ2基因启动子序列2 065bp,确定MYOZ2基因的转录起始位点;MYOZ2基因片段-84/+125荧光素酶相对活性极显著高于空载体pGL3-Basic(P0.01),MYOZ2基因片段-683/+125荧光素酶相对活性极显著高于基因片段-263/+125(P0.01)。MYOZ2基因启动子核心区域位于-84/+125bp,而且MEF2,SRF,MyoD,YY1等转录因子可能参与MYOZ2基因的转录调控。 相似文献
5.
《畜牧兽医学报》2017,(6)
旨在初步探索DKK1基因转录调控机制,本研究利用启动子在线预测软件分析了该基因启动子区序列特征,根据Ensembl数据库已公布的猪DKK1基因的5′侧翼区序列,设计特异性PCR引物进行扩增、测序,进而构建启动子区不同缺失片段的pGL3-DKK1双荧光素酶表达载体,分别转染293T细胞和Hela细胞,并进行双荧光素酶报告基因检测。结果显示,DKK1基因启动子中含有1个TATA-box、多种转录因子和1个CpG岛;DKK1基因启动子对239T细胞具有偏好性,其中p-1 679/+292bp启动子片段活性最高,且显著高于其他缺失片段(P0.01)。-953~-1 679bp为核心启动子区域,-586~-953bp区域可能存在负调控元件,在-953~-1 679bp区域可能存在正调控元件。本试验通过对DKK1基因进行生物信息学分析并结合不同长度启动子片段双报告基因活性检测,证实了DKK1基因的5′侧翼区序列具有启动子转录活性,并初步确定了该基因的启动子区域,找到了启动子的核心区域和主要调控区域,为进一步研究DKK1基因转录调控机制奠定基础。 相似文献
6.
心脏型脂肪酸结合蛋白（FABP3）是一种15 kDa的蛋白，涉及信号转导途径，参与长链脂肪酸的摄取及利用。本研究采用PCR技术扩增FABP3启动子序列，通过缺失分析构建了5个不同缺失片段荧光素酶报告基因载体，并转染奶山羊乳腺上皮细胞，通过双荧光素酶报告基因系统检测FABP3缺失片段启动子活性。结果表明：从奶山羊基因组中克隆得到2109 bp FABP3基因启动子序列（包括转录起始位点上游1985 bp），与牛（KJ649748.1）、猪（HM591296.1）和人（NG047049.1）的基因组序列同源性分别为90%、80%、75.08%。经转录因子在线软件预测分析发现，该启动子含有潜在的TATA框（TATA-box）、过氧化物酶增殖物激活受体反应元件（PPRE）、肝X受体反应元件（LXRE）、雌激素受体（ER）及两个环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）的结合位点，分别位于-1632 bp和-189 bp。缺失突变研究发现，启动子片段-1801 ～ +124活性最高，同时这一片段含有两个CREB结合位点，而当缺失至-80位点时，活性显著下降（P ＜ 0.05），且这一片段不包含CREB结合位点。表明CREB可能参与调控FABP3基因启动子的活性，为FABP3基因的转录调控研究提供理论依据。
[关键词] 心脏型脂肪酸结合蛋白（FABP3）|启动子|基因克隆|西农萨能奶山羊 相似文献
7.
为了找到水貂多巴色素异构酶(DCT)基因启动子活性区域及转录因子结合位点,试验采用PCR扩增与克隆,构建双荧光素酶报告基因重组质粒,分别转染到293T细胞和A375细胞,测定其活性,并利用在线软件对序列进行生物信息学分析,预测水貂DCT基因核心启动子区域的转录因子结合位点。结果表明:得到的6个不同长度的启动子片段均具有明显的启动子活性,且-1 292～+113 bp区域活性最高,提示其为水貂DCT基因核心启动子区域;成功筛选出337 bp水貂DCT基因活性较高的启动子片段,发现转录因子特异性蛋白1(Sp1)可能是调控启动子活性的重要转录因子。 相似文献
8.
《中国兽医学报》2018,(12)
通过分析调控北极狐毛色基因TYRP1启动子核心区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为狐狸毛皮品质分子育种和彩色毛皮新材料的创制提供思路。通过基因组测序技术获得了北极狐TYRP1基因启动子序列,并利用生物信息学方法对北极狐TYRP1基因核心启动子区域和转录因子结合位点进行预测;以北极狐基因组DNA为模板,PCR扩增北极狐TYRP1基因不同长度的启动子缺失片段克隆至pGL3-Basic载体,将重组质粒瞬时转染到A375和293T细胞,利用双荧光素酶基因检测仪进行活性验证。结果表明,成功构建了9个含有不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶活性检测发现北极狐TYRP1基因-699/+35区域为核心启动子区域,-699/-93区域存在着TYRP1基因正调控元件。生物信息学预测分析发现该区域存在4个转录因子结合位点;利用重叠延伸PCR技术成功构建了4个突变载体,经双荧光素酶活性检测发现4个突变载体活性均显著下降(P0.05),表明这4个转录因子是北极狐TYRP1基因转录调控的正调控元件。本研究确定了北极狐TYRP1基因启动子核心区域-699/+35,Sp1(-656/-646)、CREB(-598/-589)、Sp1(-539/-530)和Sp1(-163/-154)为北极狐TYRP1基因转录的正调控元件。 相似文献
9.
旨在分析鹅MyoG基因启动子活性区域和转录因子,探究该基因的转录调控机制。本研究首先通过PCR扩增泰州鹅MyoG基因5'侧翼区序列1 245 bp并对其进行测序和生物信息学分析,其次,构建4个不同缺失片段的双荧光素酶报告载体,转染C2C12细胞系。进一步利用在线软件预测核心启动子区关键转录因子,对转录因子结合位点HNF4（-521～-503 bp）、USF （-379～-370 bp）和E2（-296～-281 bp）进行定点突变并构建突变报告基因载体,在C2C12细胞系内初步鉴定MyoG基因核心转录调控因子。最后,采集70日龄泰州鹅胸肌、腿肌、心、肝、脾、肺、肾和下丘脑组织样,利用荧光定量PCR检测MyoG基因和核心转录调控因子的组织表达谱。结果表明,扩增得到的鹅MyoG基因5'侧翼区序列包含启动子元件;利用双荧光素酶报告载体检测到鹅MyoG基因启动子区-624～-154 bp区域存在关键顺式调控元件;结合定点突变技术初步鉴定USF是鹅MyoG基因核心转录调控元件。组织表达谱研究进一步表明,MyoG和USF基因在鹅8个不同组织中均有表达,且在胸肌、腿肌和心组织中共同高表达（P<0.01）。鹅MyoG基因5'侧翼区具有启动子转录活性,-624～＋37 bp是核心启动子区,USF是MyoG核心转录调控因子。试验结果为探究MyoG基因在鹅肌肉发育过程的调控机制提供理论依据。 相似文献
10.
《中国兽医学报》2020,(10)
为了探究MITF-M基因对狐狸毛色的遗传调控机制,利用PCR扩增技术对北极狐MITF-M基因启动子区6个缺失片段(2 279,1 738,1 313,1 040,524和236 bp)进行扩增,利用双荧光素酶报告基因检测技术对该基因启动子表达载体转染细胞(A375和293T)的相对活性进行检测,通过在线软件对核心启动子区转录因子结合位点进行预测,利用重叠延伸PCR和双荧光素酶报告系统检测技术对预测出来的转录因子结合位点进行点突变活性分析。结果表明,北极狐MITF-M基因启动子区524 bp(-510 bp/+13 bp)处活性最高,预测发现-510 bp/-222 bp区域存在CREB(-312 bp/-319 bp)、Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)转录因子结合位点,这3个转录因子结合位点突变后能使北极狐MITF-M基因的启动子活性上升。综上,北极狐MITF-M基因核心启动子区在-510 bp/-222 bp区域,转录因子结合位点CREB(-312 bp/-319 bp)、Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)对北极狐MITF-M基因的转录激活起到一定的调控作用。 相似文献
11.
为探讨催乳激素对体外培养的山羊乳腺上皮细胞脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FASN）基因转录活性的调控作用，试验分别用不同浓度的胰岛素（insulin，INS）、雌激素（estradiol，E2）、催乳素（prolactin，PRL）及不同激素组合（INS+PRL、E2+INS+PRL）处理山羊乳腺上皮细胞24 h，提取细胞总RNA，采用实时荧光定量PCR检测催乳激素对FASN基因mRNA表达水平的影响。细胞转染山羊FASN基因启动子报告基因载体，同样用不同浓度的胰岛素、雌激素、催乳素及激素组合处理24 h，利用双荧光素酶报告基因系统检测催乳激素对FASN基因启动子活性的影响。结果发现，用雌激素、催乳素处理山羊乳腺上皮细胞后，FASN基因启动子活性及mRNA水平极显著或显著上调（P<0.01；P<0.05），雌激素浓度为10、100 μmol/L和催乳素浓度为0.1和1 μg/mL时效果最为明显，而胰岛素对FASN基因的启动子活性及mRNA水平没有显著影响（P>0.05）。用不同激素组合（INS+PRL、E2+INS+PRL）处理细胞均能显著上调FASN基因启动子活性及mRNA表达水平（P<0.05）。结果表明，雌激素和催乳素能够调控FASN基因的转录活性，为进一步研究泌乳过程中FASN基因的分子调控机制提供理论依据。 相似文献
12.
试验旨在了解角蛋白5(keratin 5, K5)可能的调控序列。本研究根据UCSC公布的牛K5基因5'侧翼区设计PCR引物,扩增了内蒙古绒山羊K5基因部分启动子序列。通过产物纯化、连接、转化,并对测序结果进行了生物信息学分析。结果扩增得到内蒙古绒山羊K5基因启动子序列长度为1452 bp(GenBank登录号为:JQ277735),与牛和人相应序列的相似性分别为91.5%和74%。转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游－101 bp位置;含有两个TATA 盒,分别位于翻译起始位点上游－129—－124 bp(ATAAAA)和－178—－174 bp(TTAAT)位置;通过在线分析软件预测发现(按5'→3')SRY,MZF1,v-Myb,SRY,AP-1,CDP CR,HNF-4,AML-1a,HSF2,AP-4,AP2,AP2,Sp1,Nkx-2,Sp1和GATA-1转录因子结合位点。其中,转录因子SRY(TGTGTTT),和CDP CR(GATTGATGGC)是绒山羊特有的;转录因子HNF-4,AML-1a,HSF2,AP-4,AP2,Sp1,Nkx-2和GATA-1(AGCCATCATG)在绒山羊、牛和人K5启动子上的结合位点高度保守。两个最小增强子分别位于翻译起始位点ATG上游－140—－91 bp和－114—－67 bp位置,含有24 bp(GCGGCTCCCAGGTAACAGAGCCGC)重叠区,预测其与绒山羊K5基因的转录调控有关。试验确定了内蒙古绒山羊K5基因启动子的转录起始位置、转录因子结合位点及最小增强子序列,为进一步研究绒山羊K5基因的表达调控机制奠定了理论基础。 相似文献
13.
甘露聚糖结合凝集素C(mannose binding lectin C,MBL-C)是C型(Ca2+依赖型)凝集素超家族的成员,其作为一种急性期蛋白,具有抗细菌感染的功能,参与机体的天然免疫反应。为鉴定出结合在MBL2基因启动子区(1 009 bp)的重要转录因子,探寻该基因的转录调控机制,本研究选取海南黑山羊MBL2基因的启动子序列1 009 bp,采用DNA重组技术克隆6个转录起始位点上游1 009 bp的启动子5'端侧翼缺失序列,克隆片段经双酶切后连接至pGL3-Basic载体。重组质粒转染至293T细胞中,结合双荧光素酶活性检测系统筛选MBL2基因的核心启动子区域。通过在线生物信息学软件预测山羊MBL2基因的核心启动子区域的转录因子结合位点,利用点突变技术构建转录因子结合位点缺失的载体,转染293T细胞后结合双荧光素酶活性检测系统分析其转录活性。结果表明,海南黑山羊MBL2基因的核心启动子区域位于转录起始位点上游-304~-45 bp范围内,在线软件分析该区域存在RELA、NF-κB2、MZF1等3种转录因子结合位点。双荧光素酶报告分析结果表明,RELA和NF-κB2的结合位点缺失后均使山羊MBL2基因的转录活性极显著下降(P < 0.01)。结果提示,RELA和NF-κB2对山羊MBL2基因的转录活性可能具有重要的正调控作用。该研究为进一步探寻海南黑山羊MBL2基因的功能提供理论依据。 相似文献
14.
山羊MyoG基因启动子区序列分析与结构预测 总被引：2，自引：0，他引：2
为探明山羊MyoG基因的启动子序列与结构及转录调控机制,本研究设计了1对引物,采用PCR扩增、测序以及序列比对分析,从波尔山羊基因组中扩增出一段长度为969bp的山羊MyoG基因的5′侧翼序列,其GC含量为50.6%。经过生物信息学分析,确定了其转录起始位点及活性区域;发现在转录起始位点上游-24bp处存在1个TATA-box,另外还发现了1个GC-box、2个CAAT-box、2个E-box和1个富含A-T碱基的模体结构;该序列还包含HSF、ADR1和cap等转录因子结合位点。通过比对分析,所得山羊MyoG基因5′侧翼序列与牛、马鹿、人、小鼠和鸡同源序列的相似性在37.22%～96.85%之间,说明不同物种间该序列具有一定的保守性。本研究为进一步探讨山羊MyoG基因的表达和调控机制奠定了理论基础。 相似文献
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本研究旨在对猪SEPW1基因的潜在启动子区进行克隆及转录活性分析，获得其核心启动子区域，并进一步分析转录因子SP1对SEPW1基因转录活性的影响，为探索SEPW1基因在猪肉质性状方面的功能奠定基础。利用实时荧光定量PCR检测SEPW1基因在大白猪各组织中的表达量，构建空间表达谱；通过PCR技术克隆得到6个逐级缺失的SEPW1基因启动子片段，构建6个双荧光素酶报告载体，通过检测各载体的双荧光素酶活性获得SEPW1基因的核心启动子区域；对核心启动子区进行生物信息学分析，发现潜在的SP1转录因子结合位点；通过过表达、抑制表达、定点突变及凝胶迁移试验（EMSA）确认SP1转录因子结合位点的存在及其对SEPW1基因转录活性的影响。结果显示，SEPW1基因在所检测的4月龄大白猪12个组织中均有表达，其中在腓肠肌及心脏中的表达量较高。双荧光素酶活性显示，猪SEPW1基因5'侧翼区-443~-231 bp为其核心启动子区，且-378~-306 bp存在1个潜在的SP1结合位点。过表达和抑制表达SP1基因结果显示，转录因子SP1能够促进SEPW1基因的转录；定点突变及EMSA试验确认，转录因子SP1可直接与SEPW1基因启动子区的SP1结合位点（-348~-339 bp）相结合。综合以上结果表明，转录因子SP1可直接靶向SEPW1基因的启动子区并促进SEPW1基因的转录。 相似文献
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【目的】 鉴定绵羊趋化因子C-C基序配体19(C-C motif chemokine ligand 19,CCL19)基因启动子的核心启动子区域和关键转录因子,探究该基因在转录调控方面的作用机制。【方法】 选取绵羊CCL19基因5'-侧翼序列1 000 bp,PCR扩增启动子的7个不同长度的截短片段,并连接至pGL3-Basic质粒;将重组质粒与pRL-TK质粒共转染到293T细胞中,结合双荧光素酶报告基因检测系统分析不同截短片段的相对荧光活性。利用在线预测软件分析和筛选CCL19基因核心启动子区域内的转录因子结合位点。采用定点突变技术构建转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体,与pRL-TK质粒共转染到293T细胞,分析转录因子结合位点缺失质粒的相对荧光活性。【结果】 成功构建了7个不同长度(pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6)的CCL19基因启动子片段的荧光素酶报告载体;采用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定出转录起始位点上游－256/－186 bp为CCL19基因启动子核心启动子区域,表明该区域对CCL19基因转录调控有重要作用。生物信息学分析预测到该区域存在POU5F1(-201/-189 bp)、ZBTB26(-228/-217 bp)、FOXI1(-239/-228 bp)、GLI2(-255/-243 bp)和SP2(-219/-211 bp) 5个转录因子的结合位点,并成功构建了转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告基因检测系统分析显示,POU5F1转录因子的结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性极显著降低(P<0.01),FOXI1、ZBTB26、SP2转录因子结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性均极显著升高(P<0.01)。【结论】 试验成功构建CCL19基因启动子荧光素酶报告载体,确定CCL19基因启动子的核心启动子区域为转录起始位点上游－256/－186 bp,并鉴定出转录因子POU5F1结合位点可能是CCL19基因转录的重要调控位点,为下一步研究绵羊CCL19基因在先天性免疫、适应性免疫和淋巴细胞迁移等方面的功能提供理论基础。 相似文献
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试验旨在对广西本地水牛FSHR基因5'侧翼序列进行克隆、生物信息学分析及其转录活性检测。根据GenBank已公布的黄牛FSHR 5'侧翼序列,本试验设计引物,以广西本地水牛血液基因组为模板扩增FSHR基因5'侧翼序列并进行生物信息学分析。结果显示本试验成功克隆了广西本地沼泽型水牛FSHR 5'侧翼序列及部分CDS区序列,共2979 bp,同源性比对分析结果表明其与河流型水牛、黄牛、绵羊、山羊、猪和人的同源性分别为100%、99%、93%、92%、91%和75%。对其5'侧翼2000 bp序列进行启动子预测及转录因子结合位点预测,结果显示在其翻译起始位点上游-147 bp附近存在TATA box,启动子区存在GATAs、FOXO1、FOXO3、Nobox、STAT1、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6和YY1等反式作用元件结合位点,其中GATAs家族基因在FSHR启动子区存在多个结合位点,且同一位点又存在多个GATAs家族基因结合的情况。水牛FSHR启动子能启动EGFP在HEK-293T细胞系中的表达,但表达非常微弱;也能启动EGFP在CHO细胞系中表达,且与CMV启动EGFP在CHO细胞系中的强度相似,结果表明水牛FSHR是个强启动子。总之,本研究成功克隆了沼泽型水牛FSHR基因启动子,分析了其启动子序列特征并成功验证其组织特异性的转录活性,为后期水牛繁殖性能分子机理阐明及基于卵巢特异性表达外源基因的转基因水牛奠定了基础。 相似文献
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猪SP-A基因启动子区的克隆与序列分析 总被引：1，自引：1，他引：0
为了探明猪SP-A基因的启动子及其转录调控机制,设计6条特异性引物,采用染色体步移、克隆测序以及序列比对分析,从大白猪基因组中扩增出一段长度为1 033 bp的猪SP-A基因的上游序列(DQ985806),其GC含量约为55%.经过生物信息学分析,确定了其转录起始位点及活性区域;发现在转录起始位点上游-33 bp处存在1个TATA-box,另外还发现了GC-box、CAAT-box、GT-box以及转录起始子;该序列还包含Spl、TF和NF-κB等转录因子结合位点以及1个特殊重复序列5'-CATCACTGT-3'.上述试验结果表明,所克隆的1 033 bp的DNA序列是大白猪SP-A基因的启动子区序列. 相似文献