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1.
拟构建绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ, ＧＦＰ）基因的真核表达载体 ｐｃＤＮＡ_３ＧＦＰ,并观察其在 ＭＤＣＫ细胞（大肾细胞系）中的表达。以Ｎｏｔ Ⅰ切取ＧＦＰ后插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ_3,以ＢａｍＨⅠ鉴定方向,以ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ将ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ转染至培养的ＭＤＣ Ｋ,经Ｇ４１８筛选ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ阳性克隆,荧光显微镜下观察。结果证实成功构建了含ＧＦＰ ｃＤＮＡ的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ,并成功转染ＭＤＣＫ,在荧光显微镜下阳性克隆细胞呈绿色。 ＧＦＰ基因可在 ＭＤＣＫ细胞中成功表达,并发出绿色荧光,是一良好的报告基因和筛选标记。 相似文献
2.
以质粒ｐＵＣ１８和ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）为载体，克隆了伪狂犬病病毒Ｓ株基因组ＤＮＡ的ＰｓｔⅠ酶切４．３ｋｂ片段，该片段含有完整的ｐｒｖ４３基因和ｇⅢ糖蛋白基因。经酶切分析和对转化菌融合蛋白的免疫反应性及免疫原性分析，鉴定了重组质粒ｐＵＣ４．３和ｐＧｅ４．３，从而证实其插入片段含有完整的ｇⅢ糖蛋白基因。 相似文献
3.
用ＥｏｏＲＩ＋ＨｉｎｄⅢ双酶解含鸡α－珠蛋白基因５′端核基质附着区（ＭＡＲ）、小鼠金属硫蛋白基因启动子（ＭＴ－１）和人胰岛素样生长因子１－（ｈＩＧＦ－１）基因的ｐＭＴＳＭＣＡＧ质粒，０．６％琼脂糖凝胶电泳，玻璃乳回收纯化ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１片段（３．９ｋｂ），用该片段制备转基因兔。利用水平显微注射系统注射１－细胞兔胚胎４６８枚，移植到３６中受体兔，获得８只阳性兔（显示出约６００ｂｐ外源ＤＮＡ 相似文献
4.
将构建的ｐＢＳＴ２～６工程菌质粒用限制性内切酶ＢａｍＨＩ／ＢｇｌⅡ酶切，经琼脂糖凝胶电泳和电洗脱，回收１４７ｂｐ的目的ＳＴ１基因。随之将该基因分别重组到能有效表达Ｋ９９菌毛抗原和ＬａｃＺ酶的ｐＧＫ９９之Ｋ９９基因ＢｇｌⅡ位点和ｐＵＣ１８的ＢａｍＨＩ位点中。通过ＳＴ１基因探针菌落原位杂交、特定酶切分析及ＤＮＡ序列分析，筛选并鉴定出了理想重组子，从而构建出了能分别表达ＳＴ１融合基因产物的工程菌株ｐＳＫ２１９和ｐＸＳＴ１。 相似文献
5.
用ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄⅢ双酶解含鸡α－珠蛋白基因５′端核基质附着区（ＭＡＲ）、小鼠金属硫蛋白基因启动子（ＭＴ－１）和人胰岛素样生长因子－１（ｈＩＧＦ－１）基因的ｐＭＴＳＭＣＡＧ质粒，０．６％琼脂糖凝胶电泳，玻璃乳回收纯化ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１片段（３．９ｋｂ），用该片段制备转基因兔。利用水平显微注射系统注射１－细胞兔胚胎４６８枚，移植到３６只受体兔，有８只妊娠，共产下１９只活仔兔。采仔兔耳样提取基因组ＤＮＡ，应用ＰＣＲ技术分析其外源基因整合情况，获得８只阳性兔（显示出约６００ｂｐ外源ＤＮＡ条带）。再对８只阳性兔的ＰＣＲ产物进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，得到５只整合有ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１外源基因的转基因兔，转基因整合率为２６．３％（５／１９）。用１只阳性转基因公兔（５０２号）繁殖了６窝，共获得４２只仔兔。采仔兔耳样提取基因组ＤＮＡ后，如上用ＰＣＲ分析和做Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，Ｆ１代中有５只整合有ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１融合基因。 相似文献
6.
猪生殖与呼吸综合征病毒ORF6片段的cDNA克隆及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
根据已发表的ＰＲＲＳＶ基因组序列，设计并合成了１对特异扩增ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２株的ＯＲＦ６的基因的引物，以ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２基因组为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出５８６ｂｐ的ｃＤＮＡ产物。将该ｃＤＮＡ片段经Ｔ－Ａ连接插入ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体中，用重组质粒转化大肠埃希氏菌ＪＭ１０９，获得重组质粒转化菌。对重南粒ＤＮＡ进行ＰＣＲ及酶切鉴定，证明插入的ＤＮＡ片段与ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ片段大小相 相似文献
7.
将含大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ（ＳＴⅠ）结构基因的质粒ｐＢＳＴ２－６用限制性内切酶ＢａｍｍＨⅠ和ＢｇｌⅡ消化，经３％琼脂糖凝胶电泳分离、透析袋电洗脱法回收１４７ｂｐＳＴⅠ基因片段，再将含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ｐＵＣ１８用ＢａｍＨⅠ消化、碱性磷酸酶处理，然后将处理的ｐＵＣ１８ＤＮＡ与１４７ｂｐＳＴⅠＤＮＡ通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行粘性末端连接，转化至受体菌ＤＨ５α。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个为ＳＴⅠ基因探针杂交阳性的菌株。杂文阳性的菌株经培养和抽提纯化质粒后，经限制性内切酶分析和ＤＮＡ序列分析，证明重组质粒ｐＸＳＴⅠ含有２个连接在一起的ＳＴⅠ基因片段，其连接方向是正向的，具有正确的阅读框架。又ＤＨ５α（ｐＸＳＴⅠ）菌株能在含Ｘ－Ｇａｌ的ＬＢ平板上呈蓝色菌落．表明该菌株能表达具有β－半乳糖苷酶活性的大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ－β－半乳糖苷酶融合蛋白。 相似文献
8.
新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因的克隆 总被引：2，自引：0，他引：2
以提纯的我国标准ＵＤＶＦ４８Ｅ８强毒株基因组ＲＮＡ为模板、化学合成的融合蛋白（Ｆ）基因特异寡核苷酸为引物，反转录合成Ｆ基因ｃＤＮＡ，并采用同聚物加尾的方法克隆到细菌质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ（－）。经ＡＩＸ平板筛选和酶切分析，并用Ｆ基因片段核酸探针作ｄｏｔ－ｂｌｏｔ检测，共获得插入片段长度在０．６￣２．８ｋｂ之间的阳性克隆３４个，其中插入片段大于１．５ｋｂ的阳性克隆８个。用多种限制性内切酶对阳性克隆ｐＦ７ 相似文献
9.
马立克氏病病毒（MDV）糖蛋白D基因的分离克隆,定序及其在大肠杆… 总被引：1，自引：0，他引：1
用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术，从马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＧＡ株感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出ＭＤＶ糖蛋白（ｇＤ）抗原基因１２０９ｂｐ编码序列。将该ＰＣＲ扩增产物于ＥｃｏＲＩ和ＫｐｎⅠ位点克隆进行ｐＵＣ１８质粒载体中。将ｇＤ重组ｐＵＣ１８质粒ＤＮＡ用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（Ｄｉｇ）标记后，在Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ中，该探针能识别ＭＤＶ基因组ＤＮＡ的Ｂａｍ ＨＩ－Ａ克隆中的Ａ 相似文献
10.
以Ｘｂａ Ｉ和Ｅｃｏ ＲＶ双酶消化ｐＢＴ１获得肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）ｃＤＮＡ基因片段，以Ｘｂａ Ｉ和Ｓｍａ Ｉ酶切点定向克隆入质粒载体ｐＣＭＶ４，构建了人ＴＮＦα重组质粒ｐＣＭＶ－ＴＮＦα。采用ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀法转染ＣＯＳ７和ＮＩＨ３Ｔ３细胞，收集转染后不同时间的细胞培养上清，检测ＴＮＦα的表达水平和生物学活性。ＥＬＩＳＡ检测表明，两种细胞转染后，其培养上清中均有ＴＮＦα抗原存在，而载体等 相似文献
11.
参照布氏锥虫ＨＧＰＲＴ基因的核苷酸序列，设计一对引物，分别以伊氏锥虫ＨＧＰＲＴ缺陷株和自然株的总ＲＮＡ为模板进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，结果自然株出现６３０ｂｐ的ＤＮＡ条带，与设计大小一致，而缺陷株均为阴性，证明缺陷株的ＨＧＰＲＴ基因发生明显突变或缺失。自然株ＨＧＰＲＴ基因经与ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ连接，大肠杆菌转化，获得了阳性克隆。 相似文献
12.
鸡传染性喉气管炎病毒王岗株gC和gD基因的克隆及序列分析 总被引：4，自引：0，他引：4
根据已发表的传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）ＳＡ－２株的核酸序列,设计了１对引物,以ＩＬＴＶ－中国王岗株ＤＮＡ为模板,ＰＣＲ法扩增出１条１．３９ｋｂ的基因片段,将扩增产物插入到真核表达质粒ｐＣＲ＾ＴＭ３－Ｕｎｉ,得到重组质粒ｐＴＡ－ｇＤ,另将克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ质料中的ｇＣ基因酶毁后,插入到ｐＣＲ＾ＴＭ３－Ｕｎｉ载体,得到重组质粒ｐＴＡ－ｇＣ,经电泳分析、酶分、ＰＣＲ鉴定后,进行序列测 相似文献
13.
生长激素释放因子（GRF）的基因改造及化学合成 总被引：5，自引：1，他引：4
为了提高生长激素释放因子（ＧＲＦ）的体内活性,根据猪ＧＲＦ的天然序列,设计了改造后ＧＲＦ（１～３２）的基因序列（含信号肽）,两端加设ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄⅢ的粘性末端,分４段由ＤＮＡ合成仪合成,每段长度分别为９５、９７、８６、１０６ＮＴ,２条链间有１５个碱基的粘端。用尿素变性ＰＡＧＥ纯化合成片段,用Ｔ４多核苷酸激酶对合成ＤＮＡ磷酸化,混合４个片段复性,然后用Ｔ４连接酶连接。提取ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ质粒,用ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ在Ｍｕｌｔｉｃｏｒｅｂｕｆｅｒ中酶切完全后,琼脂糖电泳,由ＧｅｎｅＥｌｕｔｅＡｇｒｏｓｅＳｐｉｎＣｏｌｕｍｓ回收酶切大片段。将该酶切片段与上述合成的ＧＲＦ基因由Ｔ４连接酶连接,并转化至氯化钙致敏的ＤＨ５α。选取重组菌落,提取质粒,用ＰＣＲ及双酶切鉴定阳性克隆。用Ｍｉｎｉｐｒｅｐ提取重组质粒,ＡＢＩ３７３自动测序仪测序。测序结果表明已克隆到合成的ＧＲＦ基因。 相似文献
14.
IBDV VP2/VP243基因DNA疫苗表达质粒的构建与表达 总被引：2，自引：0，他引：2
将传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）ＶＰ２／ＶＰ２４３插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ中,置于ＣＭＶ启动子的调控之下,构建成ＤＮＡ疫苗表达质粒ｐｃＤＮＡ ＶＰ２和ｐｃＤＮＡ ＶＰ０。分别转染ＣＥＦ细胞后,于２４、４８、７２ｈ取细胞裂解液进行ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测,ｐｃＤＮＡ ＶＰ２于转染后２４ｈ呈阳性反应,４８ｈ表达量高于２４ｈ;ｐｃＤＮＡ ＶＰ０于转染后４８ｈ呈阳性反应 相似文献
15.
参考禽副粘病毒的融合蛋白基因（Ｆ基因）ｃＤＮＡ序列，设计并合成了１对引物，以他离到对鹅有致病力的Ⅰ型禽副粘病毒ＧＰＭＶ／ＱＹ９７－１株的核酸（ＲＮＡ）为模板，用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）对其融合蛋白基因３＇端进行扩增，获得了预计的８８４ｂｐ左右的片段。将该片段克隆进ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ质粒载体，获得重组质料Ｔ－ＧＰＭＶＦ３＇，采用限制性内切酶和ＰＣＲ方法对该重组质粒进行鉴定，证明所克隆的 相似文献
16.
采用蛋白酶Ｋ法从母牛肝中提取染色体ＤＮＡ,将其纯化后作为ＰＣＲ扩增模板。以引物设计软件从牛β－酪蛋白基因上游６００ｂｐ至第１个外显子设计引物,引物长度１９ｎｔ,跨度６３７ｂｐ。扩增产物电泳结果显示,在分子量Ｍａｒｋｅｒ６５７ｂｐ带附近,出现一明显亮带,这一结果与设计产物大小基本一致。用低温冷冻法纯化ＰＣＲ产物,煮沸裂解法提取载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫｓ＋质粒,ＥｃｏＲＶ酶切质粒ＤＮＡ,Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接ＰＣＲ扩增片段和质粒ＤＮＡ。将重组质粒ＤＮＡ转化到ＪＭ１０１大肠杆菌中,经筛选、酶切、测序鉴定,结果表明所克隆的片段为牛β－酪蛋白基因上游调控序列。 相似文献
17.
PRV特异性糖蛋白gp50基因片段的克隆探针制备 总被引：1，自引：0，他引：1
在ＢＨＫ２１细胞中增殖伪狂犬病病毒（ＰＲＶ），提纯ＰＲＶＤＮＡ，选编码特异性糖蛋白ｇｐ５０基因中的２６２ｂｐ片段进行ＰＣＲ扩增。扩增产物经ＫｐｎⅠ和ＳａｌⅠ双酶切后，将２２２ｂｐ片段与质粒ｐＵＣ１９连接构成重组子ｐＵＰ。通过转化大肠杆菌ＪＭ８３、Ａｍｐｒ和α互补效应筛选后，扩增、提纯重组子ｐＵＰ，用ＫｐｎⅠ和ＳａｌⅠ酶切，电泳回收克隆的２２２ｂｐ片段。用光敏生物素标记２２２ｂｐ片段和重组子ｐＵＰ制备的探针，分别检出４６．８ｐｇ和９３．６ｐｇ的ＰＲＶＤＮＡ，且ｐＵＰ探针只与ＰＲＶ呈杂交阳性反应，与ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２及ＣＭＶ呈阴性反应。 相似文献
18.
将禽流感病毒Ｈ９Ｎ２ 亚型毒株核蛋白（ＮＰ）基因３′端较为保守的、约３５０ｂｐ 的编码序列通过限制性内切酶ＨａｅⅢ切割、分离后,用随机引物法制备Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ１１ｄＵＴＰ标记探针。测定该探针的浓度为１００μｇ／ｍ ｌ。特异性试验发现该探针只能与实验室构建的、含有ＮＰ基因的重组载体ｐＧＥＭＴＥＮＰ和ｐＢａｃＰＡＫＮＰ以及Ａ 型流感病毒Ｈ９Ｎ２亚型、Ｈ３Ｎ２ 亚型以及Ｈ９Ｎ３ 亚型毒株基因组ＲＮＡ 结合出现特异性的颜色反应,而与实验室常用的载体ｐＧＥＭＴ ｅａｓｙ、ｐＢａｃＰＡＫＨｉｓ ３、ｐＴＡＲＧＥＴ 和ｐＧＥＭＥＸ２ 以及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒基因组不发生反应。应用该探针检测含ＮＰ基因的重组载体和重组病毒证明该探针是有效的,可用于含禽流感病毒样品或材料的检测。 相似文献
19.
番鸭细小病毒M91G27株病毒结构蛋白VP3编码基因的克隆与鉴定 总被引：5，自引：0，他引：5
纯化番鸭细小病毒Ｍ９１Ｇ２７毒株鹅胚尿囊液,通过ＰＣＲ技术,从病毒ＤＮＡ中扩增出病毒结构多肽ＶＰ３完整编码基因。将该ＰＣＲ扩增片在ＨｉｎｃⅡ和ＳａｃⅡ位点克隆进ｐＵＣ１８质料载体,酶切分析筛选到含１．６ｋｂ基因片段的重组质粒ＭＰ１３,进一步对该片段进行序列及用ＣＬＯＮＥ软件分析该序列。结果结盟,其与国外已报道毒株核苷酸序列有９８．８％的同源性,氨基酸序列有９８．１％的同源性,证明该重组质粒是ＶＰ３编码基因的克隆。 相似文献
20.
组织型纤溶酶原激活剂基因在小鼠体内的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
将组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）基因ｃＤＮＡ经多次亚克隆插入到真核表达载体ｐＳＶＬ的ＳＶ４０启动子和ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游,构建了重组质粒ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ。分别将这２种重组质粒直接注射于小鼠骨骼肌,观察了ｔ－ＰＡ基因在小鼠体内的表达情况。体外凝血试验结果显示,注射重组质粒ＤＮＡ后,第５天凝血时间有所延长,第１５～２０天达到高峰,小鼠体外凝血时间平均延长７ｍｉｎ左右,延长时间与基因注射量呈明显的正相关。 相似文献