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1.
选取含有氯嘧磺隆抗性标记的ILV1基因和报告基因GFP二元载体的农杆菌AGL-1,采用单因子和双因子方法研究根癌农杆菌AGL-1介导柱花草炭疽菌CH008转化过程中各主要因素对转化率的影响,优化构建ATMT转化柱花草胶孢炭疽菌体系条件,使转化效率达到300 ～400个转化子/106个炭疽孢子,即根癌农杆菌AGL-1浓度OD600=0.8,炭疽菌分生孢子浓度为1x106个/mL,AS浓度为100 μmol/L,诱导时间为6h,共培养温度和时间分别为25 ℃和4d.经PCR检测都有GFP片段,并能够表达绿色荧光蛋白.这为进一步开展炭疽菌对柱花草的致病机理研究提供了依据,优化转化体系有利于后续突变体库的扩大、筛选突变体和致病功能基因的研究. 相似文献
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为优化建立农杆菌介导的油菜黑胫病菌遗传转化技术体系，以携带潮霉素磷酸转移酶基因的pCH-sGFP
为载体，农杆菌LBA4404为介体，对油菜黑胫病菌的分生孢子进行转化。油菜黑胫病菌的最佳转化体系为:分生孢
子浓度106个/mL，农杆菌OD600值0.6，乙酰丁香酮浓度200 μmol/mL，pH 5.8，25℃，共培养4 d，获得120～161个转化
子。随机选取26个转化子连续培养5代能够稳定遗传，绿色荧光蛋白基因gfp 表达的菌丝和孢子可见绿色荧光。
PCR鉴定发现T-DNA 已整合进油菜黑胫病菌基因组中，Southern blot鉴定发现T-DNA以单拷贝的形式插入黑胫病
菌中,转化子均能够稳定遗传。建立油菜黑胫病菌遗传转化体系为该病菌的致病机制研究和功能基因分析奠定了
基础。 相似文献
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芒果炭疽病是世界性的主要病害之一,引起芒果炭疽病的病原菌有胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌2种。通过溶壁酶酶解菌丝体成功制备尖孢炭疽菌原生质体,用抗潮霉素基因作为选择标记,采用PEG介导的原生质体转化法,用绿色荧光蛋白表达载体(pCT74-sGFP)转化原生质体,获得表达GFP尖孢炭疽菌的转化子菌株;转化子菌株在含潮霉素平板上经多次单孢纯化后,在无选择压下连续继代培养仍能发出稳定而强烈的绿色荧光,用GFP特异性引物PCR扩增转化子菌株基因组DNA获得预期大小片段,表明gfp基因已成功导入芒果炭疽病病原菌基因组中,且稳定遗传;GFP标记菌株生长正常,致病性和野生型菌株无明显差别,这为进一步研究该病菌在自然界的生物学及侵染方式奠定了基础。 相似文献
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由多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)侵染引起的巴西橡胶树棒孢霉落叶病是影响橡胶树产胶量的主要病害之一。为了开展该病原菌在活体叶片中的病理学研究,本实验将绿色荧光蛋白gfp基因表达盒插入了多主棒孢菌经定点突变后的ITS序列中,构建了重组质粒p ITGH,并经PEG介导转化了原生质体,获得了GFP标记的多主棒孢菌转化子,所获得的转化子经过连续7次转接培养后仍能在分生孢子、分生孢子梗、芽管和菌丝中稳定地发出强烈的绿色荧光,其生长特性和致病性与野生菌株无明显差异。 相似文献
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油菜黑胫病是由Leptosphaeria biglobosa引起的一种真菌病害。这种病害在我国油菜产区广泛发生,并造成一定的经济损失。为通过获取突变体来研究L. biglobosa的生态适应性机制及致病机制,本文优化了影响农杆菌介导转化（ATMT）油菜黑胫病菌L. biglobosa菌株Lb731的因素,评估转化子质量,并筛选相关突变体。结果明确了农杆菌介导转化菌株Lb731的最佳因素：潮霉素B浓度为50 μg/mL,转化受体（分生孢子）培养时间为15 d (20℃),浓度为2 × 107~8孢子/mL,农杆菌-受体共培养温度为25℃,共培养时间为72 h。在最适条件下的转化效率达到80个转化子/百万分生孢子。T-DNA插入基因组的频率为100%,单拷贝插入频率为72.7%,转化子抗潮霉素性状能稳定遗传。从2136个转化子中获得了11个菌丝生长减缓突变体,7个色素产生缺陷突变体和14个分生孢子产生缺陷突变体,并从这些突变体中鉴定出7个致病力丧失突变体。采用hiTAIL-PCR技术,从3个突变体中获得了T-DNA插入位点侧翼序列。上述结果为深入研究L. biglobosa的生态适应性机制及致病机制提供了材料和线索。 相似文献
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为研究西瓜枯萎病菌的致病分子机理,开展了病原菌的转化子库构建工作。采用携带潮霉素抗性p TFCM双元载体的农杆菌AGL-1介导的ATMT转化方法 ,获得菌株FON-01的转化子,通过表型观察筛选突变体。结果表明:当乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol/L、农杆菌OD600为0.4、分生孢子浓度为1×106个/m L时,于28℃共培养48 h转化效率高达(663.33±24.95)个/106个孢子。构建了总数为3 832个的转化子库并对其进行了质量评价,从2 201个转化子中筛选出菌落形态、生长速度及产孢量等方面有所变异的突变体73个。病原菌转化子库的构建为进一步开展致病分子机理及相关基因克隆等方面研究奠定基础。 相似文献
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本研究建立了一种橡胶树叶片中胶孢炭疽菌的染色方法,通过显微观察明确胶孢炭疽菌在橡胶树叶片中的侵染结构,为橡胶树炭疽病的预测预报提供理论依据。在脱色剂（0.15%三氯乙酸乙醇溶液∶氯仿=5∶1）处理12 h,1%刚果红染色剂抽滤染色3 h的条件下,能清晰观察到胶孢炭疽菌在橡胶树叶片上的发育进程和侵染结构。结果表明,在28 ℃、100%相对湿度培养条件下,接种橡胶树淡绿期叶片2~6 h为分生孢子萌发高峰期,12 h后分生孢子萌发率大于85%;8~12 h为附着胞形成高峰期,接种12 h约75%的芽管顶端产生附着胞,少数附着胞中央部位开始形成侵染钉;24 h为侵染钉形成高峰期,同时分生孢子萌发形成多个芽管;36 h时附着胞顶端再次萌发产生次级附着胞,从而进一步侵染周围细胞,叶片出现零星病斑;48 h时芽管不断分支异化成菌丝并产生次级分生孢子,叶片出现大量典型的炭疽病病斑;72 h后菌丝在叶片表面纵横扩展,随机分支,逐步形成网状分布。随着菌丝的扩展,叶片组织发生一系列的病理变化,侵染部位组织出现褐色坏死病斑。本研究建立了一种着色效果好,简便易行,经济有效的橡胶树叶片中胶孢炭疽菌的染色方法,进一步明确了胶孢炭疽菌的侵染结构。 相似文献
9.
根据鳄梨胶孢炭疽菌Cap20基因序列设计引物,利用同源基因克隆法获得橡胶树胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌Cap20基因,同时进行核苷酸序列、氨基酸序列及聚类分析。结果表明:2种橡胶树炭疽菌的Cap20基因均含2个外显子和1个内含子,编码183个氨基酸;橡胶树胶孢炭疽菌与鳄梨胶孢炭疽菌同源性最高,其核苷酸序列同源性达90.3%,氨基酸序列同源性达98.9%;来自橡胶树的2种炭疽菌Cap20基因序列存在较大差异,其核苷酸水平同源性仅为73.8%,氨基酸水平同源性为79.8%;炭疽菌CAP20和绿僵菌MPL1蛋白结构具有42%的同源性,所含蛋白结构域相似,推测炭疽菌Cap20基因可能与绿僵菌Mpl1基因功能具有相似性。 相似文献
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中国橡胶树苗圃2种炭疽病菌分子鉴定及分布分析 总被引：1，自引：0，他引：1
根据胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌特异引物对,对采自中国云南、海南、广东和广西植胶区的138株炭疽病菌进行分子鉴定。结果显示:138株炭疽菌中鉴定为胶孢炭疽菌的有100株,占总测定株数的72.46%,尖孢炭疽菌的有38株,占总测定株数的27.54%。其中海南、云南和广东橡胶苗圃中胶孢炭疽菌占所分析菌株总数比例分别为81.82%(54/66)、60.0%(15/25)和77.27%(17/22),而广西3个橡胶苗圃中的2个苗圃地尖孢炭疽和胶孢炭疽病菌各占一半。总体来看,国内橡胶树苗圃地炭疽病病原菌仍以胶孢炭疽菌为主,部分苗圃同时存在胶孢和尖孢炭疽菌的危害。 相似文献
11.
To construct the T-DNA insertional mutagenesis transformation system for rice sheath blight pathogen Rhizoctonia solani AG-1 IA,the virulent isolate GD118 of this pathogen was selected as an initial isolate for transformation.The conditions for transformation of isolate GD118 were optimized in five aspects,i.e.pre-induction time,co-culture time,acetosyringone(AS) concentration at the co-culture phase,co-culture temperature and pH value of induction solid medium(ISM) at the co-culture phase.Finally,a system ... 相似文献
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胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的构建及其分子分析 总被引：2，自引：2，他引：0
利用根癌农杆菌介导的T-DNA插入遗传转化体系转化杞果炭疽菌SC2菌株,共获得抗潮霉素B突变体4 680个,平均每转化1.0×106个炭疽菌分生孢子可得到300～980个突变体,且潮霉素抗性在多次传代实验中得到稳定遗传.随机挑取38个突变体进行PCR检测,均可扩增出1条约1.2 kb的目标谱带,说明突变体为T-DNA插入引起:进一步的Southern blot杂交分析结果表明,在随机挑选的20个突变体中,有1个(5%)为三拷贝T-DNA插入,4个(20%)为双拷贝插入,剩余的15个(75%)为单拷贝插入. 相似文献
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根癌农杆菌介导的水稻纹枯病菌转化系统的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立水稻纹枯病菌的T-DNA插入诱变转化系统,以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1ⅠA)强致病力菌株GD118为转化的初始菌株,从预诱导时间、共培养时间、共培养时乙酰丁香酮的浓度、共培养温度和共培养时固体诱导培养基(SIM)的pH值等5个方面对转化条件进行了优化,成功地建立了适合于水稻纹枯病菌根癌农杆菌介导转化(ATMT)的优化系统。这个优化系统的转化条件如下:以30μg/mL的潮霉素B作为转化子的筛选浓度,预诱导8h,共培养20h,共培养时固体诱导培养基上的乙酰丁香酮浓度为200μmol/L,共培养温度25℃,共培养时固体诱导培养基pH5.6～5.8。采用这个系统筛选到的转化子继代培养5代后,在含30μg/mL潮霉素B的PDA平板上仍表现明显的抗性。从得到的转化子中随机抽取10个,利用根据抗潮霉素hph基因设计的特异性引物进行PCR扩增,转化子均能扩增出500bp左右的预期条带;与此同时,以4个根癌农杆菌作为阳性对照,用根癌农杆菌Vir基因特异引物对转化子进行PCR扩增,以排除转化子受农杆菌污染所致的假阳性,结果表明:4个根癌农杆菌均能扩增出Vir基因条带(730bp),而10个转化子均未能扩增出相应条带。以上两个PCR扩增的实验结果清楚地表明,T-DNA已经插入到目标菌株GD118中。 相似文献
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10种无机盐对橡胶树多主棒孢病菌的抑菌作用及对粗毒素的钝化 总被引：1，自引：0，他引：1
以橡胶树棒孢霉落叶病病原菌及其产生的粗毒素为供试材料,研究了10种无机盐对多主棒孢菌株菌丝生长、分生孢子萌发的抑制作用和对其粗毒素的钝化作用。结果表明:CuSO4.5H2O、FeCl3和FeSO4.6H2O在2～5mg/mL浓度范围内对多主棒孢病菌菌丝生长及其孢子萌发都有很强抑制作用,菌丝生长抑制率为100%,孢子萌发率为0。KMnO4在0.5～5 mg/mL浓度范围内能够完全抑制孢子的萌发,而1～5 mg/mL浓度范围内却促进菌丝的生长。KMnO4和FeCl3在浓度为0.5 mg/mL时对该毒素均有很强的钝化作用,萎蔫指数分别为2.04%和3.97%。 相似文献
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利用SMART技术构建荔枝果皮cDNA文库 总被引：3，自引：1，他引：2
以新采收荔枝果实的果皮为材料,利用SMART技术构建荔枝果皮cDNA文库。结果表明,初级噬菌体文库滴度为1.1×10^6pfu/mL,重组率为88.1%,文库的插入片段平均长度约为850bp;扩增文库滴度为2.6×10^9pfu/mL。对2444个克隆进行了测序,获得表达序列标签（EST）2136条,平均测序长度562bp。这些EST拼接成为836个簇,含单一序列549条,重叠群287个。初级文库的冗余度为60.8%。 相似文献
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茶尺蠖核型多角体病毒(Ectropis obliqua nuclear polyhedrosis virus,简称 EONPV)的两种制剂 EONPV 2H_2 的 Lc_(50)为2.5×10~4 PIB/m1、EONPV 2H_4的Lc_(50)为2×10~4 PIB/ml,以1×10~7 PIB/ml的 EONPV 2H_2感染寄主3龄虫的 Lt_(50)为5.5天,EONPV 2H_4 的 Lt_(50)为5.7天。两制剂均有一定的防紫外光能力,对寄主的致病性强,室内试验校正死亡率都在96%以上, 相似文献