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家蚕中肠丝氨酸蛋白酶基因对家蚕微孢子虫入侵的响应模式 总被引：1，自引：0，他引：1
为探究接种家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)24与48 h后,家蚕中肠6种丝氨酸蛋白酶基因(serine protease gene, sps)的表达变化趋势,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)方法对正常组和微孢子虫感染试验组的6个家蚕中肠丝氨酸蛋白酶基因(编号分别为sp1、sp3、sp5、sp8、sp11和sp12)进行定量分析.结果显示,与正常家蚕中肠内丝氨酸蛋白酶基因的转录水平相比, sp1、sp3、sp5和sp12在接种家蚕微孢子虫24与48 h后均上调表达,其中sp5上调最明显,接种家蚕微孢子虫24与48 h的表达量分别是对照的1.9和1.2倍;sp8和sp11在受微孢子虫感染24 h后表达上调,而48 h后表达量下降.结果表明,丝氨酸蛋白酶(serine protease,SP)参与了家蚕中肠对微孢子虫入侵的免疫反应;不同丝氨酸蛋白酶上调倍数不同,说明不同丝氨酸蛋白酶参与家蚕免疫反应的程度不同;家蚕微孢子虫侵染48 h后,sp8和sp11出现了下调,推测微孢子虫的成功入侵抑制了sp8和sp11的表达.家蚕中肠不同丝氨酸蛋白酶在微孢子虫感染的不同时间的表达变化趋势为进一步研究丝氨酸蛋白酶家族在家蚕微孢子虫与宿主家蚕互作中的作用奠定了基础. 相似文献
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【目的】阐明家蚕(Bombyxmori)抗菌肽对球孢白僵菌感染的应答模式,为揭示家蚕及鳞翅目昆虫抗真菌机制提供参考依据。【方法】利用实时荧光定量PCR检测家蚕被球孢白僵菌感染后抗菌肽基因cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme的表达情况,比较4种抗菌肽在家蚕脂肪体、血淋巴、马氏管和中肠中不同时间点的表达差异。【结果】经球孢白僵菌诱导后,cecropinA基因在家蚕脂肪体中的最高上调表达倍数为10.2倍,在血淋巴中的最高上调表达倍数为13.2倍,在马氏管中感染初期显著上调表达(P<0.05,下同),在中肠中感染后期显著上调表达;gloverin2基因在家蚕脂肪体中出现2次上调表达过程,最高上调表达倍数为15.7倍,在血淋巴中感染前期呈上调表达,在马氏管中略呈下调表达,中肠中的gloverin2基因在接种后16~48 h呈显著上调表达,最高上调表达倍数为6.7倍;lebocin1/2基因在家蚕脂肪体和血淋巴中的最高上调表达倍数分别为19.4和22.4倍,在马氏管中仅在接种后16 h呈显著上调表达,在中肠中则是接种后24~48 h呈显著上调表达;lysozyme基因在家蚕脂肪体中显著上调表达,在血淋巴和马氏管中感染初期也呈显著上调表达,但在中肠中的表达无明显规律。【结论】cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme基因在球孢白僵菌侵染家蚕的过程中均不同程度地被诱导上调表达,尤其在家蚕脂肪体和血淋巴中较明显,由此推测这4种抗菌肽在抵御球孢白僵菌的侵染过程中发挥重要作用。 相似文献
3.
【目的】筛选家蚕（Bombyx mori）中肠感染质型多角体病毒的应答基因,为阐明家蚕感染质型多角体病的分子机制奠定基础。【方法】 应用含有约23 000个家蚕基因组寡核苷酸芯片比较分析感染家蚕质型多角体病毒24、48及72 h的中肠试验组与中肠对照组的差异表达基因;结合生物信息学工具对差异表达基因的功能注释、分类及涉及的信号通路等进行分析;应用实时荧光定量PCR验证17个基因的差异表达。【结果】 在感染24、48及72 h后,分别得到了9、51及258个差异表达基因。KEGG通路分析表明,在感染48及72 h后,大多数涉及到代谢通路的基因的表达水平下调,所有涉及到核糖体通路和蛋白酶体通路的基因的表达水平上调。一些免疫相关基因如丝氨酸蛋白酶抑制剂、脂酶、热激蛋白、细胞色素P450、核糖体P0蛋白等基因的表达水平上调。【结论】经荧光定量PCR验证的差异表达基因可能与家蚕感染质型多角体病毒的应答机制相关,研究结果为从分子水平上阐明家蚕感染质型多角体病毒的致病机理提供了新的研究方向。 相似文献
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[目的]探究喂食家蚕核型多角体病毒(BmNPV)后家蚕血淋巴和中肠组织抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)]的活性及其基因表达变化规律,明确BmNPV侵染对家蚕抗氧化系统的影响,为解析BmNPV的致病机理提供理论依据.[方法]以五龄家蚕为研究对象,经口喂食BmNPV,分别于添食后6、12、18、24、30、36、42和48 h采集家蚕的血淋巴和中肠组织,采用实时荧光定量PCR检测两种抗氧化酶基因(Bmsod和Bmcat)的表达水平,同时以抗氧化酶活性测试盒测定SOD和CAT的活性变化情况.[结果]BmNPV侵染五龄家蚕能引起典型的血液型脓病,主要表现为蚕体环节肿胀,狂躁爬行,体壁易破,体液呈乳白色等.家蚕血淋巴和中肠组织中Bmsod和Bmcat基因均在感染BmNPV中期开始上调表达,在感染后期呈下调表达趋势,其相对表达量也呈先增加后急剧减少的变化趋势.添食BmNPV后,家蚕血淋巴和中肠组织的SOD活性在感染18和24 h时极显著高于对照组(添食等量灭菌水)家蚕(P<0.01,下同),但从感染30 h起SOD活性开始急剧下降,至感染48 h时降至最低值.家蚕血淋巴和中肠组织的CAT活性在感染早期(6 h)略有下降,从感染12 h起CAT活性开始呈上升趋势,血淋巴CAT活性在感染18~30 h极显著高于对照组,随后急剧下降且显著低于对照组家蚕(P<0.05,下同);中肠组织CAT活性仅在感染18和24 h时显著或极显著高于对照组家蚕,从感染30 h起开始持续下降,至感染48 h时降至最低值,约为对照组家蚕的18%.[结论]BmNPV侵染能影响家蚕机体相关保护酶活性及其基因转录水平,SOD和CAT活性及其基因表达量在感染中期增加,感染后期则急剧降低,提示抗氧化酶SOD和CAT在家蚕的抗病毒过程中发挥重要作用. 相似文献
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【目的】研究感染绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)后,家蚕中肠和脂肪体中6种抗菌肽基因表达的变化,为家蚕肠道免疫研究提供一定的理论依据。【方法】给家蚕喂食感染绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌,以喂生理盐水为对照,利用半定量RT-PCR方法,检测感染不同时间(1,2,4,8,16,24h)后中肠和脂肪体中6种抗菌肽基因表达的变化。【结果】喂食绿脓杆菌1,2h后,中肠中抗菌肽Gloverin2、Lebocin、CecropinB6、CecropinD和Moricin的相对表达量显著上调;喂食金黄色葡萄球菌1,2,4h后,中肠中6种抗菌肽的相对表达量均显著上调。在脂肪体中,感染两种细菌后,仅抗菌肽CecropinD、Moricin和Attacin2相对表达量的变化较为显著。【结论】家蚕在感染不同细菌后所诱导的免疫机制不同。细菌经由口器进入家蚕肠道,可同时引起上皮免疫反应和体液免疫反应。 相似文献
6.
《江苏农业科学》2017,(19)
为研究家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2的保守性及转录活性,采用生物信息学相关软件对微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶slp2基因共线性、多重序列及系统进化进行比对分析,并通过Western blot分析Nbslp2在家蚕微孢子虫、柞蚕微孢子虫及纳卡变形微孢子虫中的表达特征,以验证其保守性;进一步以感染家蚕微孢子虫不同天数的家蚕中肠组织为材料,利用RT-PCR检测Nbslp2的转录活性。共线性、多重序列比对及系统进化分析发现,Nbslp2在微孢子虫基因组中的位置较保守,Western blot结果显示Nbslp2抗体在柞蚕微孢子虫总蛋白中杂交出2条带,而在纳卡变形微孢子虫没有杂交条带,说明Nbslp2相对保守,并且可将Nbslp2作为区分柞蚕微孢子虫和纳卡变形微孢子虫的靶标;RT-PCR结果显示Nbslp2在感染家蚕微孢子虫后72 h检测到转录活性,进一步推测Nbslp2可能在家蚕微孢子虫感染家蚕早期发挥作用,为分子水平深入研究Nbslp2的功能奠定理论基础。 相似文献
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[目的]从分布、感染性和分类特征三方面调查家蚕病原性微孢子虫多样性,为蚕业生产上有效防控家蚕微粒子病提供参考依据.[方法]跟踪蚕种生产微粒子病检疫数据及抽样检验家蚕受微孢子虫感染的情况,调查家蚕病原性微孢子虫的分布;通过测定微孢子虫对家蚕的半数感染浓度(IC50)和胚种传染率及检验带毒蚕种的微粒子病胚种传染率,调查家蚕病原性微孢子虫的感染性;基于微孢子虫SSU rRNA序列构建家蚕病原性微孢子虫系统发育进化树及进行相似性和遗传距离分析,调查家蚕病原性微孢子虫的分类特征.[结果]不同时间和不同蚕区生产饲养的广西家蚕均存在一定量的微孢子虫感染,蚕种微粒子病发生率(毒率)呈波动起伏态势.GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9、GXM10、GXM11、GXM12和GXM13等11株异型微孢子虫对家蚕均具有较强食下传染力,大部分异型微孢子虫对家蚕的IC50与N.b同一级别;各种微孢子虫对家蚕的胚种传染力存在明显差异,N.b的胚种传染率达51.67%,其他异型微孢子虫均比N.b低,部分异型微孢子虫(GXM6和GXM13)对家蚕无胚种传染力.GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9和GXM11等8株异型微孢子虫均位于Nosema属的类群分支上,除GXM7与GXM9、GXM3与GXM5间存在较低分化度和较高相似度外,其他微孢子虫间的分化度和相似度均存在明显差异.[结论]广西蚕区家蚕病原性微孢子虫分布广泛,种类繁多,且各种微孢子虫的感染力存在明显差异,即广西家蚕病原性微孢子虫存在丰富的种类多样性. 相似文献
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[目的]分析家蚕丝氨酸蛋白酶(SP)基因序列BmSP25及转录情况,明确其表达规律对防御家蚕核型多角体病毒(BmNPV)入侵的免疫应答机制,为揭示BmSPs在家蚕免疫应答方面的功能作用提供理论依据.[方法]克隆BmSP25基因序列,对该基因编码蛋白的氨基酸序列、分子量、结构域等进行生物信息学分析;利用GeneDoc和MEGA 5.0对BmSP25氨基酸序列进行多序列比对及系统发育进化树分析,采用半定量RT-PCR对家蚕不同组织和发育时期的BmSP25基因转录情况进行分析,并以实时荧光定量PCR检测BmSP25基因在BmNPV感染家蚕中肠组织中的转录水平.[结果]BmSP25基因的ORF全长885 bp,编码294个氨基酸,其中第1~17位氨基酸为信号肽,去信号肽的分子量为29.1 kD,理论等电点为7.8.BmSP25蛋白由4个α螺旋、15个β折叠和一些无规则卷曲构成;其氨基酸序列同源性比对分析发现,BmSP25(BGIBMGA008514-PA)与蓓带夜蛾SP序列(GenBank登录号ADM35105)的同源性最高,为62.1%.BmSP25基因在家蚕中肠组织中特异表达,且在整个幼虫时期呈持续性表达.BmSP25基因在家蚕感染BmNPV后发生明显变化,至感染6 h时呈下调趋势,而在感染3、12和24 h时均呈明显上调表达.[结论]BmSP25在防御BmNPV入侵家蚕的免疫应答过程中发挥重要作用.鉴于昆虫SP具有高度保守的底物特异性位点,因此可利用底物类似物、基因定点突变等方式来预防农林害虫. 相似文献
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【目的】分析家蚕(Bombyx mori)丝氨酸蛋白酶基因BmSP141序列信息,明确其时空表达模式,结合饥饿与重新喂食处理对其表达的影响,探究该基因在家蚕中的功能。【方法】对家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmSP141进行T-A克隆,得到其编码区核苷酸序列;应用生物信息学在线网站对该基因编码区推导的氨基酸序列、分子量、结构域等信息进行分析;利用ClustalX1.8和MEGA5.02软件对BmSP141与其他物种的丝氨酸蛋白酶进行多序列比对和系统发生树分析;构建原核表达载体p28-BmSP141,并转化到Rosetta（DE3）菌株中诱导表达,利用镍柱亲和层析纯化重组蛋白。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法对其组织和时期表达特征进行分析;采用蛋白质免疫印迹（Western blot）技术,分别分析BmSP141蛋白在家蚕5龄第3天各组织的表达情况和5龄幼虫中肠的表达变化;通过免疫荧光定位分析BmSP141蛋白在4龄幼虫中肠的分布情况;利用实时荧光定量PCR和Western blot方法对饥饿处理和再喂食后BmSP141的表达情况进行分析。【结果】BmSP141编码含有292个氨基酸的蛋白,其中第1-17位氨基酸为信号肽,其成熟体蛋白预测分子量为25.9 kD,等电点为7.8。同源序列比对表明,BmSP141与烟芽夜蛾丝氨酸蛋白酶和蓓带夜蛾丝氨酸蛋白酶序列同源性较高,分别达到62%和63%。这些同源序列具有保守的催化三联体,与活性相关的基序也很保守,但与胰凝乳蛋白酶保守的底物特异性位点相比,BmSP141的底物特异性位点发生改变。在16和37℃条件下诱导后,重组蛋白均以包涵体形式表达,经镍柱亲和层析纯化后得到了较纯的重组蛋白,并用该蛋白制备了效价较高的多克隆抗体。组织和时期表达特征分析表明,该基因主要在家蚕幼虫的中肠组织特异性表达, 且在幼虫起蚕到食桑期表达逐渐增加,但眠期表达下降,蛹期和成虫期表达水平较低。Western blot分析也表明,BmSP141蛋白仅在家蚕中肠组织表达,且从5龄起蚕到上蔟表达量先增加后降低。免疫荧光定位结果表明,BmSP141定位于中肠上皮细胞的细胞质中,进一步证实BmSP141在中肠特异表达。在转录和翻译水平,BmSP141饥饿处理后表达量显著下调,而重新喂食后其表达量上调,表明BmSP141的表达受到消化道食物的诱导。【结论】家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141在中肠组织表达,在幼虫期食桑期高表达,蛹期和成虫期表达水平较低,受消化道食物的诱导而上调表达,推测该基因可能参与家蚕中肠的消化过程。 相似文献
11.
《西南农业学报》2020,(5)
【目的】探究家蚕感染BmNPV后,不同组织碱性磷酸酶(ALP)及其基因表达变化规律,为阐明BmNPV的侵染机制及培育抗NPV蚕品种的选育提供借鉴和思考。【方法】通过经口添食BmNPV,检测分析家蚕中肠、血淋巴和脂肪体ALP基因的表达水平及其编码的碱性磷酸酶活性变化情况。【结果】家蚕中肠ALP基因在感染BmNPV后6、9和12 h呈现上调表达趋势,其编码的碱性磷酸酶活性显著高于对照组,在感染24 h基因表达被抑制,同时酶活性显著降低。血淋巴碱性磷酸酶及ALP基因对BmNPV的响应略晚于中肠,ALP基因在感染9 h开始上调表达,在12 h表达量最高,在24 h表达量急剧降低。碱性磷酸酶活性在9和12 h极显著高于对照组,而在24 h急剧减弱,显著低于对照组。脂肪体ALP基因表达量及碱性磷酸酶活性仅在感染12 h显著高于对照组。【结论】家蚕感染BmNPV后,中肠、血淋巴和脂肪体ALP基因表达水平及碱性磷酸酶活性变化均是呈现先升高后急剧减弱的趋势。基因的表达情况与酶活性变化规律一致,这与家蚕感染BmNPV后,其自身机体的生理代谢进程存在紧密联系,暗示碱性磷酸酶在家蚕抗病毒过程中发挥了重要作用。 相似文献
12.
【目的】探讨经辛硫磷诱导后,家蚕细胞周期蛋白家族基因(CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE)在5龄幼虫各种组织中的转录活性,为进一步研究有机磷农药对家蚕的损伤机制提供参考。【方法】采用实时荧光定量PCR方法,以饲喂清水浸泡过的桑叶为对照,分析家蚕5龄3d幼虫喂食辛硫磷(4μg/mL)浸泡桑叶24h后,脑、脂肪体、中肠、丝腺、马氏管、精巢及卵巢等7种组织中4种细胞周期蛋白家族基因的转录水平。【结果】与对照组相比,辛硫磷诱导24h后,CyclinA、CyclinB、CyclinB3在各组织中均表达上调,CyclinE在中肠及脂肪体中表达显著下调,在精巢与马氏管中无明显变化,在其他组织中则表达上调。【结论】辛硫磷诱导24h后,家蚕组织中CyclinA、CyclinB及CyclinB3基因表达上调,这可能是家蚕对磷胁迫的响应;CyclinE在中肠及脂肪体中表达显著下调,这与这2种器官是家蚕重要的解毒代谢器官有关。 相似文献
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【目的】探讨家蚕中肠羧酸酯酶活力变化及羧酸酯酶基因表达差异与家蚕抗浓核病毒之间的关系，阐明其抗性的分子机理。【方法】以易感浓核病毒中国株家蚕品系华八和完全抗性品系BC8（华八的近等基因系）为材料，用BIO-TEK SYNERGY测定经口接种病毒(以下简称接种)后12 h、36 h、72 h 2个品系中肠的羧酸酯酶活力，并用实时荧光定量PCR研究接种后12 h、36 h、72 h中肠羧酸酯酶基因的表达差异。【结果】接种后12 h中肠羧酸酯酶活力BC8接种组分别是BC8对照组、华八接种组和华八对照组的3.28倍、2.26倍和3.02倍,差异达到极显著水平（P＜0.01）其它时间段的供试组之间无统计学差异；接种后12 h中肠羧酸酯酶基因的相对表达量BC8接种组分别是华八接种组、华八对照组、BC8对照组的17.714倍、21.76倍和15.09倍,差异达到极显著水平（P＜0.01），其它时间段的供试组之间也无统计学差异。【结论】接种后12 h抗性品系BC8中肠羧酸酯酶活力升高及中肠羧酸酯酶基因表达水平升高可能与家蚕品系是否有抗性基因(nsd/nsd)有关,也与浓核病毒中国株的感染刺激有关；抗性品系BC8中肠羧酸酯酶活力升高的分子基础可能是羧酸酯酶基因表达水平的改变。 相似文献
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【目的】鉴定新的家蚕蛋白酶抑制剂,探讨其在抵御病原微生物入侵方面的功能。【方法】对家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI37进行T-A克隆、多序列比对、系统发育树构建、原核表达、RT-PCR时空表达特征及微生物诱导分析。【结果】克隆、表达了1个新的丝氨酸蛋白酶抑制剂,命名为BmSPI37。时空表达特征分析表明,BmSPI37在家蚕5龄幼虫后期表达量很高,而且在中部丝腺中高量表达;在蛹向蛾的变态发育时期,BmSPI37在雌蚕中的表达量显著高于雄蚕。微生物诱导试验表明,BmSPI37在大肠杆菌、黑胸败血菌、球孢白僵菌感染后,强烈上调表达。【结论】推测BmSPI37与防御病原微生物入侵有关。 相似文献
15.
《西南农业学报》2021,(1)
【目的】了解BmSPH33基因在家蚕免疫应答方面的作用。【方法】BmSPH33基因进行生物信息学分析;利用GeneDoc与MEGA 5.0软件对BmSPH33与其它物种SPH33进行多序列比对和系统进化分析;利用半定量RT-PCR对其组织转录情况进行分析; qRT-PCR检测家蚕添食BmNPV后BmSPH33基因的表达情况。【结果】BmSPH33基因ORF全长840 bp,其氨基酸序列长度为279 aa,软件预测无信号肽序列,分子量大小为22.95 kDa,等电点为5.98。氨基酸序列同源性比较发现,BmSPH33与蓓带夜蛾SPH33含有保守的类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶结构域;组织转录情况表明,该基因在家蚕幼虫的中肠组织特异表达。BmSPH33在家蚕感染BmNPV 4 h时转录水平升高,在8、12、24和48 h时均表现为下调,表明BmSPH33的表达受到BmNPV感染的诱导。【结论】BmSPH33在家蚕感染BmNPV后发生响应,推测该基因参与家蚕免疫应答。 相似文献
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《西南农业学报》2015,(4)
为了调查家蚕幼虫总蛋白酶和胰蛋白酶活性,并探讨与丝氨酸蛋白酶基因表达之间的关系。对家蚕不同组织、不同时期、不同品种来源的样品进行了总蛋白酶和胰蛋白酶活性的检测。在Ysh品种中肠中的总蛋白酶和胰蛋白酶活性都高于丝腺,性别差异不显著,品种中Dazao和Ysh显著高于Y-1和C108;Ysh品种5龄3日中肠中的胰蛋白酶活性显著高于5龄7日,高浓度蜕皮激素(20E)处理后24 h中肠中胰蛋白酶活性下降幅度比较大,保幼激素处理后变化不显著。胰蛋白酶活性测定结果与SPs家族基因特异性的在中肠表达,5龄中期表达高于5龄末期,20 E处理后24 h出现下调表达的结果是一致的;不同品种酶活性的差异可能与生命力差异有关。为家蚕丝物质形成和积累提供了分子调控的参考依据。 相似文献
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【目的】明确家蚕DNA甲基转移酶基因(BmDNMT)生物信息学基本特征及其在家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染前后的表达情况,揭示DNA甲基化在家蚕抗病毒免疫方面的作用机制,为挖掘家蚕抗病毒标志基因和药物靶标蛋白等提供理论依据。【方法】通过OrthoDB、MultiLoc2、SherLoc2、PSORTII、SMART、SWISS-MODEL及Schr?dinger等在线生物信息学分析软件进行BmDNMT蛋白氨基酸同源比对、系统进化分析、亚细胞定位、功能结构域预测、三级结构同源建模及小分子配体对接口袋预测,并采用实时荧光定量PCR分析BmDNMT基因在家蚕感染BmNPV后不同时间不同组织中的时空表达特征。【结果】BmDNMT基因包含BmDNMT1和BmDNMT2,分别位于家蚕8号染色体和11号染色体上,其推导BmDNMT氨基酸序列均与烟草天蛾DNMT氨基酸序列的亲缘关系最近。BmDNMT1蛋白大量存在于细胞核,少量分布在细胞质;而BmDNMT2蛋白大量存在于细胞质,少量分布在细胞核及线粒体。BmDNMT1蛋白的功能结构域多于BmDNMT2蛋白,二者均含有DNA甲基化酶功能结构域,且具有潜在药物结合口袋。BmNPV感染会影响BmDNMT1和BmDNMT2基因在家蚕不同组织中表达差异,BmNPV感染4 h后这2个基因在家蚕中肠的表达差异已非常明显,说明家蚕DNA甲基化可能在病毒感染早期已发生,且中肠可能是最早响应的组织。BmNPV感染后,BmDNMT1和BmDNMT2基因的相对表达量和表达趋势并不一致。【结论】BmDNMT1和BmDNMT2基因的染色体位置、亚细胞定位及功能结构域等存在差异,BmNPV感染后二者在家蚕不同组组织中的相对表达量和表达趋势也不一致,推测BmDNMT1和BmDNMT2基因在家蚕DNA甲基化过程中行使不同的功能。BmDNMT1和BmDNMT2蛋白三维结构具有潜在的药物结合口袋,可能是直接影响DNA甲基化状态的药物靶标。 相似文献
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