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阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种由脑内淀粉样蛋白（A(）聚集引起的,以老年人记忆和认知功能丧失为临床表征的神经退行性疾病。研究表明,A(寡聚体是AD发生发展的主要因素。应用自行筛选出的能够特异识别淀粉样蛋白寡聚体的单链抗体W20基因,构建了以绿色荧光蛋白为报告基因的真核表达载体pSNAV2.0-W20-EGFP,并应用流式细胞分选、蛋白免疫印迹以及荧光显微镜等技术对该单链抗体融合蛋白在真核细胞中的表达进行了初步研究,为针对AD的抗体基因治疗奠定了基础。 相似文献
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[目的]优化基因工程菌的诱导表达条件,以提高抗呋喃它酮代谢物衍生物单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量.[方法]采用液体发酵法培养抗AMOZ衍生物单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的基因工程菌,分别研究不同宿主菌、培养基、初始pH、诱导时期、诱导时间和蛋白诱导表达剂异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactopyranoside,IPTG)对融合蛋白表达量的影响,并通过蛋白质印迹法和直接竞争酶联免疫分析法对其活性进行鉴定.[结果]以E.coli BL21(DE3)作为宿主菌,在以初始pH为7.0的SB液体培养基作为发酵培养基,将含有目的蛋白的基因工程菌培养至OD600为0.6时,用浓度为0.6 mmol/L的诱导表达剂IPTG诱导表达9 h的条件下,抗AMOZ衍生物单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的表达量由最初的7.94％增加到了11.45％,总体增加了约3.51％,且融合蛋白具有良好的生物活性.[结论]成功提高了抗AMOZ衍生物单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达量,为后期大规模生产抗AMOZ衍生物单链抗体奠定了一定的基础. 相似文献
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研究β淀粉样蛋白(25-35)对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)大鼠海马自噬相关蛋白Beclin-1的表达和学习记忆功能的影响。通过行为学以及免疫组织化学检测,观察模型大鼠学习记忆功能以及海马Beclin-1表达的变化。行为学检测表明:模型组的学习记忆功能明显低于正常组,模型组Beclin-1表达明显降低(P<0.01)。海马CA1区注射β淀粉样蛋白(25-35)大鼠学习记忆力下降,Beclin-1表达下调,提示Beclin-1蛋白的表达降低很可能是β淀粉样蛋白(25-35)致神经元可塑性降低的关键环节。 相似文献
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利用沙门菌膜插入和分泌蛋白(MisL)能展示外源蛋白于细菌表面的能力,构建血管内皮生长因子受体单链抗体(scFv-KDR)的原核表达载体(pYA3332-misL-scFv-KDR),将scFv-KDR展示于减毒沙门菌表面,获得的KDR沙门菌(KDR-X4450)有助于沙门菌靶向肿瘤和肿瘤血管细胞;利用环氧合酶(COX-2)具有高度的肿瘤组织特异性,构建COX-2启动子介导的GFP真核表达载体(pGL3-basic-hCOX2-GFP)。将真核载体转化展示有scFv-KDR的KDR-X4550得到KDR-GFP沙门菌(KDR-GFP-X4550), KDR-GFP-X4550感染肿瘤细胞, COX-2启动子启动外源基因GFP的表达; SDS-PAGE检测scFv-KDR在沙门菌的表达,细菌计数KDR-X4550进入肿瘤细胞的数量;荧光显微镜观察COX-2启动子启动外源基因表达及KDR-GFP-X4550靶向递呈外源蛋白的能力。结果表明:scFv-KDR能展示在沙门菌表面,展示有KDR单链抗体的沙门菌比野生菌更容易进入肿瘤细胞;与正常细胞相比, COX-2启动子能在肿瘤细胞内启动GFP表达, KDR-GFP-X4550具有靶向递呈GFP的能力。这一研究为重组沙门菌进一步应用研究奠定了基础。 相似文献
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阿尔茨海默症（alzheimer’s disease, AD）的“微生物感染假说”表明,AD的发生发展与脑部真菌感染密切相关。β淀粉样蛋白（β-amyloid, Aβ）作为一种“抗菌肽”已被证明能够对多种病原微生物产生抗菌活性,然而其在抗真菌方面的机制仍不明确。本文主要从AD的“微生物感染假说”入手,探究几丁质等细胞壁多糖在Aβ的抗真菌活性中所发挥的作用。Aβ的聚集状态与其抗菌活性存在相关性,为探究不同聚集状态的Aβ与其抗菌活性的关系并尝试解析Aβ抗真菌的具体作用机制和靶点,选择病原真菌白色念珠菌作为研究对象,证实了Aβ中更容易发生淀粉样变性的具有42个氨基酸的Aβ42对白色念珠菌浮游菌和生物膜的代谢活力具有抑制作用,并且其抑菌效果与Aβ42浓度呈现明显的正相关。通过特异性标记真菌细胞壁的钙荧光白（calcofluor white,CFW）染色法验证了Aβ42对白色念珠菌菌丝生成具有抑制作用。体外制备获得了Aβ42的寡聚体及纤维状聚体,并通过透射电镜进行了形态验证,随后将不同聚集状态的Aβ42作用白色念珠菌。结果表明：不同聚集状态的Aβ42其抗真菌活性存在差异,当Aβ42寡聚体转变为纤... 相似文献
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本研究旨在探讨黄精水煎剂(PCD)对β-淀粉样蛋白(Aβ)致阿尔茨海默病(AD)模型大鼠的保护作用及可能机制。通过Aβ25-35微量注射至大鼠双侧海马CA1区建立AD模型,同时用PCD干预,研究PCD对AD模型大鼠学习记忆能力、海马组织损伤和CA1区神经元中过度磷酸化tau蛋白(p-tau)表达的影响。结果表明,PCD可明显缩短模型大鼠逃避潜伏期,对模型大鼠学习记忆能力损伤有保护作用;能改善大鼠海马神经元损伤,减少CA1区在thr231位点tau蛋白的过度磷酸化。这些结果提示,PCD对学习记忆能力有显著的保护作用,这可能与其减少海马内p-tau-thr231水平和消除组织氧化逆境有关。 相似文献
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为提高抗呋喃唑酮代谢物衍生物单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。采用液体培养基发酵培养能表达出目的蛋白的基因工程菌,对诱导表达得到的目标融合蛋白进行鉴定,探讨5种培养基、6种诱导时间和4种诱导剂-异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度对融合蛋白表达的影响,再通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧基琼脂糖凝胶柱和直接竞争酶联免疫分析法进行纯化并对其活性进行鉴定。结果表明,最适宜条件为SB培养基,诱导剂IPTG浓度为0.6 mmol/L,培养9 h,该条件下抗呋喃唑酮代谢物衍生物单链抗体-AP融合蛋白的表达效果较好,表达量从2.89%增加到5.75%,总体增加了约2.86百分点,通过NHS活化羧基琼脂糖凝胶柱纯化后融合蛋白的浓度为1.973 mg/mL,IC50值为56.923 1 ng/mL。本试验单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达量得到了很好的提高,并获得生物活性较好的融合蛋白,为后续呋喃唑酮代谢物免疫检测分析方法的建立奠定了一定基础。 相似文献
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《江苏农业学报》2017,(3)
本研究旨在利用原核大肠杆菌系统表达1株猪圆环2型病毒(Porcine circovirus type 2,PCV2)小分子荧光抗体,以及该荧光抗体用于PCV2病毒直接免疫荧光(Direct immunofluorescence assay,DIF)检测。选取1株筛选到的PCV2特异性纳米抗体基因V22,按照E.coli原核表达系统进行密码子优化重新合成,与荧光蛋白基因融合后插入p ET28(a)中,20℃条件下诱导表达16 h,利用SDS-PAGE、Western-blot技术鉴定蛋白是否表达及其可溶性,并对可溶荧光抗体蛋白进行镍柱亲和层析纯化,纯化蛋白用于建立PCV2特异性DIF检测方法,同时对其工作条件、工作浓度、特异性以及稳定性进行验证,并与PCV2经典间接免疫荧光检测方法进行比较,验证其灵敏度。结果表明,PCV2荧光抗体基因在E.coli原核表达系统中表达,可溶蛋白占目的蛋白的60%左右;纯化后荧光抗体蛋白呈现明显绿色,具有良好的荧光活性,不同批次表达及纯化的荧光抗体效果一致,-20℃保存6个月后抗体效价不变;PCV2特异性DIF试验结果表明该荧光抗体只对PCV2病毒感染细胞具有良好的反应原性,利用该抗体建立的直接免疫荧光法能够用于PCV2病毒滴度的测定,滴度测定结果与间接免疫荧光法检测结果一致。说明,在原核系统中成功表达PCV2的小分子荧光抗体,该荧光抗体蛋白具有良好的特异性、灵敏度及稳定性,用该抗体建立的PCV2特异性DIF操作简单,且具有较好的特异性和敏感性,对PCV2的检测有潜在应用价值。 相似文献
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PCV2感染仔猪急性期蛋白的变化 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】探讨实验性感染PCV2仔猪血清中急性期蛋白浓度和肝脏急性期蛋白表达的变化,为PCV2的致病机制和诊断提供有价值的资料。【方法】19头ELISA检测PCV2抗体阴性的5周龄健康断奶仔猪,随机分为对照组和攻毒组,在攻毒后不同时间采集血液和肝脏。用ELISA方法检测血清中APPs的动态变化,荧光定量RT-PCR测定肝脏中APPsmRNA表达,同时观察肝脏的组织病理学变化。【结果】仔猪接种PCV2后,肝脏出现实质细胞变性,结缔组织增生和嗜酸性粒细胞浸润为特征的病理学损伤;血清中,猪主要急性期蛋白(Pig-MAP)在攻毒后7d达到峰值,在7和10d显著高于对照组(P0.05);血清淀粉样蛋白A(SAA)在攻毒后7d和21d显著高于对照组(P0.05);血清载脂蛋白AⅠ(Apo-AⅠ)攻毒后21d显著高于对照组(P0.05),其余时间差异均不显著;PCV2感染后21d仔猪肝脏中结合珠蛋白(HP)、C-反应蛋白(CRP)、α1-酸性糖蛋白(AGP)和SAAmRNA的表达呈现升高的趋势。【结论】PCV2感染可引起仔猪肝脏出现以实质细胞变性坏死和结缔组织增生为特征的病理学变化,血清APPs浓度和肝脏APPsmRNA表达呈现不同的变化,其中Pig-MAP可以作为病程发展的重要检测指标,对监测PCV2感染、疾病的预后起重要作用。 相似文献
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目的 探讨在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)病理早期采用回神颗粒对转基因AD小鼠的治疗作用。方法 采用聚合酶链式反应（PCR）法鉴定淀粉样前体蛋白/早老素1(APP/PS1)双转基因AD小鼠的基因表型后,选取3月龄雄性转基因阳性PAD小鼠和同龄、同背景的C57BL/6J野生型雌性小鼠作为实验对象。应用Morris水迷宫中逃避潜伏期、穿越平台的次数来评价小鼠的学习记忆能力,苏木精-伊红(HE)染色法观察小鼠脑组织形态学的改变,免疫组化法检测小鼠海马区β淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)1-42的表达水平。结果 回神颗粒治疗组小鼠学习记忆能力提高,与模型组比较,小鼠逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增多(P＜0.05);穿越平台次数与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗组大脑海马区Aβ1-42表达阳性面积明显减少(P＜0.05)。与正常组相比,模型组AD小鼠大脑海马区Aβ1-42表达阳性面积明显增高(P<0.05)。结论 回神颗粒可显著改善APP/PS1转基因AD小鼠的学习记忆能力,抑制Aβ1-42的过度表达、聚集。 相似文献
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为筛选牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)gP48蛋白的单链抗体,本研究利用噬菌体展示技术构建了gP48蛋白单链抗体克隆文库,通过微孔筛选法对抗体库进行3轮富集淘筛,利用ELISA技术测定单链抗体的亲和力,对亲和力较高的克隆进行基因测序分析和结合活性测定,旨在获得gP48蛋白的单链抗体。结果表明:1)成功构建了库容量为4.3×107的噬菌体单链抗体库,其重组率为83.3%,经三轮筛选对噬菌体抗体库进行富集,富集倍数为1.43×104;2)优化了间接ELISA方法,筛选到3株与BVDV gP48蛋白具有高亲和力的单链抗体以及其基因序列,通过IgBLAST分析显示,3株单链抗体均为鼠源IgG。综上,从gP48蛋白的单链抗体库中筛选获得3个具有高亲和力的单链抗体,可用于后续BVDV检测方法的建立。 相似文献
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根据大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,GSIV)主要衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)基因设计引物,PCR扩增得到MCP基因编码框全长序列1 392 bp,将其克隆到原核表达载体p ET-32a中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-MCP,并在大肠杆菌BL21中得到了表达,融合表达的重组蛋白分子量约为70 ku,与预期大小一致,主要以包涵体的形式存在。对IPTG浓度,诱导温度等诱导表达条件进行优化,确定0.5 mmol/L的IPTG于37℃的条件下诱导6 h重组蛋白的表达量最佳。纯化GSIVMCP重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备了GSIV-MCP多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000。Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接荧光免疫结果表明,该多克隆抗体可与由GSIV感染引起细胞病变的EPC细胞(GICB)发生特异性的结合。研究为建立GSIV免疫诊断方法以及为研究GSIV MCP基因编码蛋白的功能奠定了前期基础。 相似文献
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【目的】合成、克隆HIV单克降抗体VRC01的单链抗体基因,在大肠杆菌中诱导表达并进行纯化。【方法】根据GenBank上公布的VRC01抗体可变区的氨基酸序列合成引物,运用基因从头合成和重叠延伸PCR方法,克隆抗体VRC01的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因;用15肽Linker(Gly4Ser)3将VH和VL基因相连,得到单链抗体基因scFv-VH-Linker-VL和scFv-VL-Linker-VH,并分别将两者克隆到原核表达载体pET28a中,构建重组质粒后转入大肠杆菌BL21(DE3+)中诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析;将重组蛋白进行变性处理后,利用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达产物进行初步纯化。【结果】得到了VRC01的2种单链抗体的基因scFv-VH-Linker-VL和scFv-VL-Linker-VH,其大小分别为770和768bp。SDS-PAGE电泳结果显示,scFv-VH-Linker-VL在大肠杆菌中不表达或表达量极低;而scFv-VL-Linker-VH表达量较高,蛋白质分子质量约为29ku,且主要以包涵体形式存在。Western blot检测结果证实,scFv-VL-Linker-VH可与His-Tag融合表达,并通过亲和层析法成功纯化获得了该单链抗体。【结论】成功构建、表达并纯化出了VRC01单链抗体,为进一步研究VRC01单链抗体的生物学特性奠定了基础。 相似文献
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本研究构建了鲫鱼卵母细胞特异表达的新型SNRPC基因的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体,并检测抗体特异性,为进一步研究新型SNRPC基因的功能奠定基础。首先设计引物,应用RT-PCR从鲫鱼成熟卵母细胞中获得含该基因片段,重组入原核表达载体PinPoint T中,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,应用亲和层析法获得纯度较高的原核表达蛋白并免疫家兔制备多克隆抗体,用Western blot方法检测此抗体特异性。成功构建了新型SNRPC基因重组表达载体,表达的蛋白经纯化后免疫家兔得到了特异的多克隆抗体。鲫鱼卵母细胞的新型SNRPC基因的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化及抗体的制备为后续的研究提供了理论基础。 相似文献
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[目的]单链DNA结合蛋白Whirly(WHY)是植物体内广泛存在的一类转录因子,在植物叶片衰老等方面具有重要作用。本文旨在克隆黄瓜单链DNA结合蛋白基因CsWHY1,初步分析其表达特征,为黄瓜叶片衰老的功能研究提供参考。[方法]以华北型黄瓜‘9930’‘长春密刺’和‘新泰密刺’为试验材料,克隆CsWHY1的c DNA全长,应用生物信息学方法对该基因进行生物信息学分析,并利用洋葱表皮细胞瞬时表达系统对CsWHY1蛋白进行亚细胞定位,同时通过RT-qPCR技术分析CsWHY1基因在3个黄瓜品种不同组织中的表达模式。[结果]CsWHY1基因包含1个长度为831 bp的开放阅读框(ORF),共编码276个氨基酸,蛋白理论相对分子质量为30.729×10~3,理论等电点(p I)为9.00,属于亲水蛋白。氨基酸序列分析表明,CsWHY1蛋白具有保守的Whirly结构域,在双子叶植物和单子叶植物中高度同源,且与甜瓜亲缘关系最近。亚细胞定位发现CsWHY1蛋白在洋葱表皮的质体上表达。荧光定量PCR分析其表达模式,发现CsWHY1在不同黄瓜品种不同组织中均有表达,叶片中表达量最高,根和茎中表达量较低,其中衰老叶片中的表达量显著高于成熟叶片。[结论]CsWHY1基因的表达具有组织特异性,在衰老叶片高表达,参与了黄瓜叶片衰老进程。 相似文献
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根据抗玉米赤霉烯酮毒素单链抗体的氨基酸序列及大肠杆菌偏爱密码子,用重叠延伸PCR法合成了单链抗体的重链和轻链,经（Gly4Ser）2Linker连接,获得完整的单链抗体基因ZEN2 scFv。将ZEN2 scFv与碱性磷酸酶（AP）编码序列连接形成融合蛋白基因ZEN2 scFv-AP,构建到pET载体,转化大肠杆菌菌株BL21（DE3）,经IPTG诱导表达及亲和层析纯化,在SDS-PAGE和Western blot分析中均检测到1条分子质量为75 ku的可溶性蛋白条带,ELISA分析证实,细菌表达的ZEN2 scFv-AP融合蛋白具有碱性磷酸酶活性。这一研究结果为建立快速、灵敏、经济的玉米赤霉烯酮毒素的ELISA检测奠定了基础。 相似文献
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太湖蓝藻藻蓝蛋白的提取及纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
为利用太湖打捞蓝藻的蛋白质资源,采用冻融破壁、絮凝、盐析、透析、双水相萃取等方法制备荧光试剂级藻蓝蛋白。研究结果表明,以水为介质冻融2次破壁,将冻融藻浆中蓝藻干物质调节为0.95%,用浓度为7.5g/L的聚合氯化铝絮凝初分离,所得藻蓝蛋白纯度(A6 20/A280)为0.31;采用20%、50%饱和度的硫酸铵两步盐析可将其纯度(A620/A280)提高至2.29;盐析后藻蓝蛋白经100 000的透析袋透析,再以140 g/L的聚乙二醇(分子量2 000)和140 g/L的磷酸钾盐萃取纯化,最终纯度(A620/A280)高达4.60,达到荧光试剂级要求。 相似文献
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Alzheimer病(AD)是一种神经退行性病变,由于大脑皮质及海马的神经细胞(NC)死亡脱落,引起脑萎缩,记忆和学习能力障碍,出现痴呆症状.AD发生机制复杂,至今仍不十分清楚.从家族性AD(FAD)家系发现的3个致病基因,为突变的β-淀粉样蛋白(Aβ)前体(APP)、早老素1(PS-1)、早老素2(PS-2).在体外细胞系,这些致病基因可诱导或加重细胞死亡.本文以AD致病基因和Aβ引起细胞死亡为中心,简述与AD相关的NC死亡的分子机制研究进展. 相似文献
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双抗夹心荧光免疫吸附测定法(sFLISA)定量检测转基因玉米中Bt蛋白 总被引：1，自引：0，他引：1
将量子点(Quantum Dots,QDs)应用于标记羊抗兔多克隆抗体,并利用Bt杀虫晶体蛋白作为标准蛋白和免疫抗原,通过抗体-抗原-抗体-量子点标记抗体反应,建立了双抗夹心荧光免疫吸附测定法(sFLISA),以定量检测转基因玉米中的Bt表达蛋白.研究结果表明,该方法的最低检测限为3 pg/mL,线性检测范围为6～200 pg/mL,回收率在90.0%～105.9%,变异系数在3.0%～12.6%. 相似文献