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I类乙醇脱氢酶（ADH）在乙醇的肝代谢中发挥重要作用，由ADHl，ADH2和ADH3组成。根据序列数据设计一对引物，利用RT—PCR同时克隆乙醇脱氢酶I类基因全长eDNA。测序后的eDNA被克隆在表达载体pTYBll上并在大肠杆菌中稳定表达。纯化获得的酶通过其在340nm处吸光值的变化进行酶活性测定。经检测重组ADHl，ADH2和ADH3的酶活力分别为2．0±0．3，0．8±0．2，1．5±0．2U·mg^-1。 相似文献
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采用垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,分析了中国鲎6种组织器官（肝胰腺、心脏、肠、鳃、肌肉和黄色结缔组织）的乙醇脱氢酶（ADH）、山梨醇脱氢酶（SDH）、酯酶（EST）、过氧化氢酶（CAT）、天冬氨酸转化酶（AAT）、苹果酸脱氢酶（MDH）和苹果酸酶（ME）等7种同工酶的活性和分布,并对其酶谱的表型进行了分析.结果表明,中国鲎的同工酶系统存在不同程度的组织特异性.乙醇脱氢酶在鳃和黄色结缔组织中不表达;山梨醇脱氢酶在鳃中不表达;酯酶、过氧化氢酶和苹果酸脱氢酶在6种组织器官中均有表达,但表达活性存在差异;而天冬氨酸转化酶Aat-1位点在鳃中不表达. 相似文献
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一氧化氮处理对冬枣贮藏期间乙醇代谢及相关品质的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】研究NO处理对冬枣贮藏期间乙醇代谢及相关品质的影响，探讨NO对冬枣褐变软化的作用机理,为NO应用于冬枣的贮藏保鲜提供理论依据。【方法】用0、10、20、30 µl•L-1 NO气体熏蒸4 h白熟期冬枣，研究了冬枣室温[（22±1）℃]贮藏和冷藏[（4±1）℃]期间外观品质变化的相关参数，丙酮酸、乙醇、乙醛等含量以及乙醇脱氢酶（ADH）和乳酸脱氢酶（LDH）活性的变化。【结果】20 µl•L-1 NO处理明显地减少了果实中乙醇、乙醛和丙酮酸的含量，且延缓了丙酮酸含量高峰的出现；显著抑制了乙醇脱氢酶（ADH）和乳酸脱氢酶（LDH）活性。30 µl•L-1 NO处理促进了冬枣果实在室温或冷藏期间的酒化软化。【结论】20 µl•L-1 NO处理可以减少乙醇积累对冬枣的毒害，有效抑制了冬枣果实贮藏期间的褐变软化。 相似文献
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为构建番鸭源禽1型副黏病毒HN主要抗原结构域(HNd)和V基因融合表达载体,经PCR及融合PCR分别从重组质粒pMDHN和pMDP中扩增HN基因主要结构域和V基因cDNA.将HNd经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切、V基因用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,分别定向插入真核载体pcDNA3的多克隆位点相应的酶切位点中,对2个单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV进行酶切和测序鉴定.利用融合PCR技术扩增出HNd-V基因,定向克隆至pcDNA3的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切酶切位点之间,转化感受态细胞后,经PCR反应初筛后,对阳性克隆进行酶切分析及测序鉴定.对单表达重组质粒进行酶切分析及测序鉴定,结果表明:HNd和V基因已被正确定向克隆至真核表达载体peDNA3,成功构建了2个基因的单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV;对融合重组质粒酶切分析和测序鉴定表明,HNd-V融合基因正确克隆进真核表达质粒pcDNA3中,成功构建了融合表达载体pcDNAHNd-V. 相似文献
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【目的】克隆分析家蚕Bmugt 3基因cDNA序列,并对其在家蚕不同组织中的表达进行检测。【方法】以家蚕ak1和873为供试材料,采用生物信息学方法和RT-PCR技术,对家蚕Bmugt3基因cDNA序列进行克隆和组织表达谱研究,并通过XbaⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒,将Bmugt 3亚克隆至具有2个反向T7启动子,用于体外诱导合成双链RNA(dsRNA)的L4440载体。【结果】克隆得到了家蚕Bmugt 3基因1675bp的cDNA序列,编码462个氨基酸,编码蛋白的分子质量为52.3ku,等电点6.5;多序列比对显示,Bmugt 3基因缺失了C末端的跨膜结构域;聚类分析结果显示,其与家蚕phenol-UGT基因聚合在同一分支上。Bmugt 3基因主要在家蚕丝腺中表达。【结论】Bmugt 3基因是组织特异性表达基因,可能在家蚕类黄酮素的代谢中起作用。 相似文献
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腰带长体茧蜂cDNA文库的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
从寄生在亚洲玉米螟 (Ostriniafurnacalis)幼虫体内 6d的腰带长体茧蜂 (Macrocentruscingulum)胚胎中提取总RNA和mRNA ,用分离到的微量mRNA合成cDNA第 1链。通过长距离PCR扩增得到足够量的双链cDNA。将SfiⅠ酶切后并纯化的cDNA片段连接到经SfiⅠ酶切的噬菌体λTripIEX2上 ,并对噬菌体进行包装 ,建成cDNA的全长库。经大肠杆菌XL1 Blue平板检测 ,未扩增文库的滴度为 0 75× 10 6pfu·mL-1,克隆重组百分率为 96 77% ,扩增后文库的滴度为 0 5×10 10 pfu·mL-1。 相似文献
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【目的】克隆、序列分析和原核表达编码斜纹夜蛾（Spodoptera litura）GOBPⅠ（SlGOBPⅠ）的cDNA。【方法】采用同源克隆结合RACE的方法克隆SlGOBPⅠ基因的cDNA序列,并在 pET-32a/BL21（DE3）系统中进行原核表达。【结果】从斜纹夜蛾触角中克隆了GOBPⅠ的cDNA序列（GenBank登录号为EU086372）,序列分析表明,SlGOBPⅠ开放阅读框序列为495 bp,编码164个氨基酸,分子量为19.3 kD,等电点为5.54。SlGOBPⅠ具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即氨基酸序列中具有 6个半胱氨酸残基,呈酸性。SlGOBPⅠ氨基酸序列与鳞翅目昆虫的气味结合蛋白氨基酸序列具有较高的相似性,表明SlGOBPⅠ属于GOBP家族。将SlGOBPⅠ编码序列,克隆到表达载体pET-32 a上,构建原核表达载体pET-SlGOBPⅠ,在表达宿主菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导成功表达了相对分子质量为32.0 kD的可溶性融合蛋白,利用Ni2+-NTA亲和柱一步纯化了SlGOBPⅠ融合蛋白,以此融合蛋白免疫新西兰大白兔制备了SlGOBPⅠ的抗血清,ELISA滴度为1﹕5 000,Western印迹检测结果显示,SlGOBPⅠ抗血清与表达的融合蛋白质呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白保持原有的免疫原性。【结论】克隆、分析和表达了编码斜纹夜蛾气味结合蛋白GOBPⅠcDNA 序列,为今后深入研究斜纹夜蛾GOBPⅠ基因的结构和功能奠定了基础。 相似文献
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盐胁迫对水稻幼根乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶基因表达的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
以水稻(Oryza sativa)南粳44号为材料,研究不同浓度NaCl胁迫对水稻幼根中乙醇脱氢酶(ADH3)和乙醛脱氢酶(ALDH)基因表达的影响.结果表明,NaCl浓度和胁迫时间都对ADH3和ALDH的表达有影响.与对照相比,100 mmol/L NaCl胁迫后ADH3和ALDH的相对表达量下降或没有显著变化;而300、400 mmol/L NaCl胁迫12、192 h时ADH3和ALDH的相对表达量极显著高于对照,胁迫48 h时这两个基因的相对表达量则显著或极显著低于对照. 相似文献
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淹水胁迫下不同耐渍性玉米自交系根系中的酶学研究 总被引：7，自引：0，他引：7
以4种耐溃性存在差异的玉米自交系为材料，对淹水前后玉米根系中乙醇脱氢酶(ADH)、NAD^ -苹果酸酶(ME)、谷氨酸脱氢酶(GDH)和过氧化物酶(POD)的表达量及其同工酶的变化进行研究，结果表明：淹水3d后的各个自交系根系中，ADH的活性都明显增加，Adh2位点被诱导表达；耐渍性较差的NC286和黄早四根系中ME活性分别增加170％和130％以上，耐渍性较好的自交系ME活性则变化不明显；除NC286外，GDH活性在淹水前后变化不明显，但淹水处理后有一同工酶位点Gdb4被诱导表达；淹水后，凤可1根系POD活性略有上升，其他材料POD活性均有不同程度下降。作者认为，玉米根系在缺氧条件下快速进入乙醇发酵途径和氮代谢等途径，提供生存所需能量和减少代谢有毒中间产物积累，是玉米耐渍性的基本特征。 相似文献
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为了解团头鲂MHCⅠ类基因的结构,采用cDNA末端快速扩增（Rapid-amplification of cDNA ends,RACE）技术,首次成功克隆了团头鲂“浦江I号” F0基础群体及选育F8世代的MHCⅠ类基因,共获得3条cDNA全长序列。序列全长为2 040～2 079 bp,含有87~102 bp的5′-UTR,1 035～1 044 bp的编码区（包括信号肽,alpha 1、alpha 2和alpha 3三个结构域,跨膜区和胞质区）及911~946 bp的3′-UTR区,分别编码347、344个氨基酸。F8世代序列的核苷酸/氨基酸的同源性很高,为89.0%/93.0%,而与F0世代的同源性较低（75.3%~77.0 % 和71.1%~71.4%）,呈现出明显的分子多态性。分析表明,团头鲂具有经典的MHCⅠ类分子的空间结构,与人类HLA-A2的抗原肽结合区的晶体结构相比,二者的差异主要集中在5个(I~V)区上。在Neighbor-joining(NJ)法构建的分子进化树中,团头鲂与草鱼的亲缘关系最近,与鲑鳟鱼类、爬行类、鸟类、哺乳类及人类的亲缘关系则渐远。RT-PCR组织表达分析表明,团头鲂MHCⅠ类基因在所检测的的8个组织中均表达,在鳃、头肾和血液中有较强的转录本,中等强度表达于肝脏和脾脏,在后肾、肠和肌肉中表达较弱。 相似文献
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乙醇酸氧化酶是光呼吸代谢的关键酶.以水稻Oryza sativa叶片cDNA为模板,利用RT-PCR扩增水稻乙醇酸氧化酶基因(OsGLO1),并构建了该基因的原核表达载体pET23d-OsGLO1,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白.以纯化的OsGLO1融合蛋白为抗原免疫新西兰白兔,制备兔抗OsGLO1的多克隆抗体.Western-blot分析表明,制备的多克隆抗体能有效地检测水稻、菜心Brassica campestris、拟南芥Arabidopsis thaliana和菠菜Spinacia oleracea中乙醇酸氧化酶的表达,为进一步深入研究乙醇酸氧化酶在调控光呼吸及抗逆性等方面的作用奠定了基础. 相似文献
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小麦A GPase4个亚基的克隆及其组织特异性表达 总被引：3，自引：1，他引：2
采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号发育籽粒中克隆出小麦淀粉合成关键酶-AGPase的胞质型小亚基(cytosolic small subunit,SSU Ⅰ)、质体型小亚基(plastidial small subunit,SSU Ⅱ)、胞质型大亚基(cy-tosolic large subunit,LSU Ⅰ)和质体型大亚基(plastidial large subunit,LSU Ⅱ)的cDNA序列.所克隆的基因cDNA序列长度分别为1 465、1 631、1 941和535 bp.序列比对结果显示SSU Ⅰ、LSU Ⅰ和LSU Ⅱ与已往报道的大麦、小麦、玉米、水稻等相关基因的同源性较高,而SSU Ⅱ的cDNA序列为首次克隆,与大麦SSU Ⅱ相比,5'端缺失编码转移肽的一段序列,表明其可能对质体AGPase活性产生一定影响.通过半定量PCR法发现SSU Ⅰ与LSU Ⅰ在籽粒中表达量较高,而SSU Ⅱ和LSU Ⅱ在叶片中丰富表达. 相似文献
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[目的]克隆了脯氨酸脱氢酶ProDH基因的全长cDNA,构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体,并转化到农杆菌.[方法]以“耐运2000番茄”幼苗为试材,根据GenBan中公布的番茄脯氨酸脱氢酶ProDH基因的序列信息设计了一对特异性引物,克隆了该基因的全长cDNA,分析基因序列选择正反向片段并扩增,并通过酶切、连接的方法构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体PBI121-PDHi利用冻融法将表达载体转化到农杆菌EHA105中.[结果]所克隆到的ProDH基因片段长2 001 bp,其中CDS为1 491 bp,编码380个氨基酸.测序结果与公布序列同源性100％,因此可以用来构建干扰载体;通过酶切与测序鉴定,证明表达载体构建成功.[结论]经特异性引物扩增检测,证明表达载体已转入农杆菌,为进一步的研究该基因奠定了基础. 相似文献
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棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的克隆及特征分析 总被引：5，自引：0，他引：5
【目的】克隆棉花木质素合成关键酶基因GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3全长cDNA序列,分析其在不同组织部位的表达情况并进行原核表达研究。【方法】根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的EST序列设计引物,采用RT-PCR技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定的氨基酸序列进行分析。采用半定量RT-PCR方法研究GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3在不同组织中的表达。构建了基因的原核表达载体,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。【结果】从发育的棉花纤维中克隆了3个COMT基因cDNAs,GhCOMT1(GenBank登录号为FJ479708)、GhCOMT2(GenBank登录号为FJ479709)和GhCOMT3(GenBank登录号为FJ848869)分别具有1101bp、1098bp、1071bp的开放阅读框,各自编码366、365和356个氨基酸。GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3在棉花各个组织中都有表达,GhCOMT1和GhCOMT2在根部的表达量最高,GhCOMT3在茎中表达量最高。SDS-PAGE电泳分析表明,3个蛋白的最佳诱导表达条件均为0.2mmol·L-1IPTG在37℃下诱导6h。【结论】从棉花中克隆了3个木质素合成关键酶基因GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3,为进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。 相似文献
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根据已发表的猪Sarlb基因序列设计合成1对带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,用RT-PCR方法从猪肝脏组织总RNA中扩增出Sarlb基因cDNA序列,纯化后,经BamHⅠ／XhoⅠ双酶切,克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）,获得pcDNA3,1（＋）一Sarlb重组载体。通过茵液PCR、双酶切及DNA直接测序分析,证实重组表达载体pcDNA3,1（＋）-Sarlb构建成功。 相似文献
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淹涝和低温胁迫对小麦幼根ADH与BADH表达的影响 总被引：2，自引：0，他引：2
测定淹涝和低温胁迫下小麦幼根中乙醇脱氢酶(ADH)和甜菜碱醛脱氢酶(BADH)表达变化.扬麦13号种子,种植于花盆土壤中,待幼苗生长至1 cm左右时,随机分为对照组、淹涝胁迫组和低温胁迫组,对照组和淹涝胁迫组均置25℃植物培养箱中,其中淹涝组淹没于水中;低温组置5℃植物培养箱中,光照/黑暗12 h交替,每日适量浇水.各组分别在0h、12 h、1d、2d、4d和8d时取根,剪取根尖处1 cm组织,提取总RNA,逆转录,荧光定量PCR法测定ADH2a和BADH表达.结果显示:低温和淹涝对ADH表达均具有极为显著的刺激作用,且淹涝胁迫的作用又远大于低温胁迫;低温对BADH表达的刺激作用主要表现在1d时,淹涝对BADH表达在2d和4d时表现出较为显著的抑制作用;小麦ADH和BADH在低温和淹涝胁迫下表达变化可能与抗逆性有关. 相似文献
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目的：构建小鼠蛋白激酶CK2β亚基cDNA重组表达质粒，以便深入进行CK2结构与功能的研究。方法：通过反转录PCR从NIH3T3小鼠成纤维细胞中获得小鼠蛋白激酶CK2β亚基编码区cDNA，PCR扩增酶为高保真DNA聚合酶。将NdeⅠ/HindⅢ彻底双酶切PCR产物定向连接到牛小肠碱性磷酸酶去5′端磷酸的同样彻底NdeⅠ/HindⅢ双酶切的表达载体pT7—7中，转化感受态大肠杆菌DH5α获得转化子，用0．8％琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化予，将阳性克隆进行单和双酶切分析鉴定。随机挑选两个阳性克隆进行DNA测序。结果：转化子的阳性筛选率为100％，限制性酶切分析结果表明插入片段和重组质拉的大小与理论推测值相符。DNA测序结果表明：两个重组小鼠CK2β亚基克隆中的插入片段序列均与两种已报道的小鼠CK2β亚基cDNA编码区序列分别存在一个碱基差异，但我们报道的这2个差异碱基与大鼠、兔、猪和人CK2β亚基cDNA的编码区相应碱基序列一致。结论：本实验克隆的小鼠蛋白温酶CK2β亚基cDNA编码区序列可能是正确的序列。 相似文献