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1.
本试验的目的是对青藏高原地区牦牛进行牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)的分子流行病学调查,并分离牦牛源BCoV。采用RT-PCR方法检测西藏、青海、四川、云南的犊牦牛腹泻粪便中BCoV,并扩增其S、HE及N基因片段;选取阳性样本进行BCoV分离。结果显示:从336份犊牦牛腹泻粪便中检出232份BCoV阳性,检出率为69.05%。序列分析和系统发育分析显示,本试验克隆的32个BCoV阳性样本中的S1亚基序列、HE基因片段和N基因片段均有独特的遗传进化趋势;首次成功分离到1株牦牛源BCoV,蚀斑纯化后病毒TCID50为10-7.17·0.1mL-1,鉴定结果显示该毒株S基因发生了重组事件。本试验结果表明青藏高原牦牛源BCoV感染率很高,且有独特的遗传进化趋势。 相似文献
2.
2022年2月,川西北某地牦牛暴发以呼吸道症状为突出特征的传染病。为确定病因,对发病牦牛进行了相关病原的病原学诊断。共采集13头发病牦牛的20份病料,采用PCR方法对牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛副流感病毒3型（BPIV-3）、牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、牛冠状病毒（BCoV）、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）、牛腺病毒3型（BAdV-3）以及多杀性巴氏杆菌（P. multocida,Pm）、溶血性曼氏杆菌（M. haemolytica,Mh）和牛支原体（M. bovis,Mb）等9种牛呼吸道病原进行检测。结果显示：在20份样本中共检测出IBRV、BAdV-3和Pm 3种病原,且存在混合感染,其他病原未检出;4份全血样本中检测出3份IBRV、1份BAdV-3阳性,1份胎盘组织样本中检出IBRV阳性,8份鼻拭子样本中检出3份IBRV、5份BAdV-3阳性,2份流产中阴道拭子中检出2份BAdV-3阳性,5份肺脏组织样本中检出4份Pm阳性;进一步对IBRV和Pm进行分型鉴定,确定该地牦牛感染的为1.2型IBRV和A型Pm。结果表明,引发该地牦牛呼吸道疫病的是1.2型IBRV、BAdV-... 相似文献
3.
《中国预防兽医学报》2020,(9)
为建立特异灵敏的检测牛冠状病毒(BCoV)的Taq Man荧光定量RT-PCR方法,并对犊牛腹泻粪便样品进行检测。本实验根据牛冠状病毒(BCoV)聚合酶基因nsp10核苷酸序列分别设计了1对引物和探针,通过反应体系和条件的优化,建立了检测BCoV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法在3.36×10~1拷贝/μL～3.36×10~9拷贝/μL,质粒标准品与Ct值呈现良好的线性关系,相关系数R~2=0.9996,扩增效率E=109%;该方法只特异性检出BCoV,而不能检出其它常见腹泻病原,特异性较强;对质粒标准品的检测下限为33.6拷贝/μL,与所比较方法的敏感性数量级相同,敏感性较高;批内与批间重复性试验的变异系数均小于5%,重复性较好。该方法对腹泻粪便样品中BCoV检出率高于国外文献报道的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。利用该方法对采集自新疆和辽宁的16个养殖场153份犊牛腹泻粪便样品进行了BCoV的检测,BCoV阳性率为71.24%,场阳性率为100%,表明犊牛感染BCoV的现象普遍。本实验首次建立了靶向BCoV聚合酶基因的荧光定量RT-PCR检测方法,其特异性和稳定性好,灵敏度较高,为BCoV的快速检测和流行病学调查提供了有力的手段。 相似文献
4.
《中国兽医杂志》2016,(6)
针对牛冠状病毒(BCoV)N基因保守序列设计合成了1对特异性引物,以体外转录法制备的cDNA标准品为模板,建立了检测BCoV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。在1个反应体系中模板最低检测限为7.8 copies/μL,比普通RT-PCR更加灵敏;与牛主要消化道和呼吸道病毒病病原均无交叉反应;批内、批间重复变异系数均低于1.5%;应用定量PCR检测了39份疑似临床病料,阳性检出率为51.28%(20/39),普通RT-PCR为41.03%(16/39)。结果表明,该方法特异性强、稳定性好、准确率高,本方法将为BCoV的临床诊断和流行病学调查提供技术保障。 相似文献
5.
《畜牧兽医学报》2017,(6)
轮状病毒(rotavirus,RV)是犊牛腹泻的重要病因,笔者旨在建立基于恒温隔绝PCR(insulated isothermal PCR,iiPCR)技术现场检测牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV)的方法。根据BRV和牦牛RVVP6基因序列,设计合成引物和探针,通过优化反应体系,配合商品化PetNAD核酸萃取试剂盒,建立了检测BRV和牦牛RV的iiPCR方法。结果显示该方法只能检出BRV和牦牛RV,不能检出牛冠状病毒、牛星状病毒、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒、牛大肠杆菌、牛沙门菌、牛艾美尔球虫、牛瑞氏隐孢子虫等无关病原;检测下限为96.6copies·μL-1,重复性好;对30份牛腹泻样本和30份牦牛腹泻样本的检测结果表明,本方法对BRV的检出率是33.33%,对牦牛RV的检出率为73.33%,与文献报道的检测BRV和牦牛RV的方法的符合率分别为100%;对2016年四川阿坝藏羌自治州14个牧场的88份犊牦牛腹泻样本RV的检测结果显示RV核酸阳性检出率为98.86%。本研究建立的BRV iiPCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,既可用于BRV检测,又可用于牦牛RV的检测;从核酸提取到报告检测结果仅需1h,操作方便,可现场使用,为BRV的现场快速诊断提供有力的工具。 相似文献
6.
《畜牧兽医学报》2016,(6)
近期作者实验室从腹泻牦牛粪便样本中鉴定出一种新型星状病毒(AstV)——牦牛AstV,本研究旨在建立检测牦牛AstV的RT-PCR方法。首先设计引物扩增牦牛AstV 630bp的ORF2基因片段,进行序列分析;在此基础上设计检测引物,建立检测牦牛AstV的RT-PCR方法。结果显示,从20份牦牛腹泻粪便中扩增出13个牦牛AstVORF2基因片段,核苷酸相似性为99.3%~100%,而与牛肠源星状病毒(BAstV)ORF2基因的相似性仅为59.5%~80.8%;所建立的RT-PCR方法只扩增牦牛AstV的特异片段,对BAstV和其他无关病原无扩增;对病毒核酸的最低检测限为57.3fg·μL~(-1);比较试验表明,所建立的RT-PCR方法对牦牛AstV的检出率明显优于现有检测BAstV的RT-PCR方法。其对牦牛腹泻与健康粪便样本中牦牛AstV的检出率分别为55.5%(76/137)和7.7%(2/26)(P0.01)。试验结果表明,扩增的ORF2基因片段的核苷酸序列在牦牛AstV毒株间高度保守,但相对于BAstV变异大;基于该序列建立的检测牦牛AstV的RT-PCR方法特异性好,灵敏度高,稳定性好,为牦牛AstV的检测和流行病学调查提供了有力工具;同时,本试验结果也提示牦牛AstV与犊牦牛腹泻有联系。 相似文献
7.
《畜牧兽医学报》2016,(7)
轮状病毒(rotavirus,RV)VP6基因是RV的主要分子检测靶点,但该基因的点突变会影响RV的分子检测。本试验的目的是在研究牦牛RVVP6基因遗传变异的基础上,建立检测牦牛RV的RT-PCR方法并应用于临床样本检测。采用Prime 5.0设计引物,从30个牦牛腹泻样本中扩增得到14个位于931—1 338bp牦牛RVVP6基因片段。序列分析结果发现,与牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV)相比,牦牛RVVP6基因在931—1 110bp间出现多处点突变,而在1 100—1 338bp之间序列高度保守。据此设计检测引物,成功建立了检测牦牛RV的RTPCR方法,具有良好的特异性和稳定性,只扩增出牦牛RV及BRV的特异片段,对其他无关病原无扩增;检测下限为0.45pg·μL~(-1),灵敏性较好。所建立方法对牦牛RV的检出率明显优于现有检测BRV的RT-PCR方法,为牦牛RV病的诊断和流行病学调查提供了可靠的方法;对BRV的检出也与其他方法具有很好的符合率,也可以用于BRV的检测。对234份犊牦牛腹泻粪便样本的RV检出率:西藏为60.00%(36/60)、青海为95.00%(57/60);四川为85.19%(46/54);云南为90.00%(54/60),证明牦牛RV感染是当前导致犊牦牛腹泻的重要原因。 相似文献
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9.
四川省某肉牛场新引进的犊牛出现发热、咳嗽、呼吸困难、流鼻涕等呼吸道症状,为了解该病的病因,本试验采集了10份病牛深部鼻腔棉拭子样本,采用PCR方法检测了牛冠状病毒（BCoV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、牛腺病毒3型（BAV-3）、牛支原体（M.Bovis）、多杀性巴氏杆菌（P.multocida）、溶血性曼氏杆菌（M.haemolytica）及睡眠嗜组织菌（H.somni）等8种常见呼吸道病原。结果显示：BCoV检出率为70%,BVDV检出率为30%,其余病原均未检出,表明该肉牛场犊牛的呼吸道疾病是由BCoV和BVDV混合感染引起的。 相似文献
10.
旨在调查川西北牦牛哺乳动物正呼肠孤病毒（MRV）的感染情况并分离病毒。采用RT-PCR方法，对采自川西北15个牧场的72份牦牛腹泻粪便样本和其中5个牧场的15份腹泻牦牛血清样本进行MRV检测，阳性样本进一步用分型PCR确定其血清型。结果显示，粪便样本中MRV检出率为20.83%（15/72），血清2型的比例为60%（9/15）；血清样本中MRV检出率为40%（6/15），血清2型的比例为83.33%（5/6）；未检测到其他血清型。成功地从腹泻粪便中分离到1株MRV血清2型毒株（TCID50为4×10-8.56·mL-1），并获得长度为23 587 bp的分离株全基因组，该分离株与中国猪源毒株的遗传关系最近；与GenBank中所有的MRV S1基因相比，该分离株有4个独特的氨基酸突变。本研究从牦牛中检测到MRV，并分离到1株牛源MRV血清2型毒株，为进一步研究MRV血清2型生物学特性奠定了基础。 相似文献
11.
《动物医学进展》2015,(10)
为了解四川地区猪环曲病毒(PToV)的发病状况,针对PToV的保守区域S基因设计了一对特异性引物,建立检测PToV的RT-PCR方法,并对其敏感性、特异性和重复性进行了检测。结果显示,仅猪环曲病毒阳性模板可扩增得到约569bp大小的目的条带。敏感性试验显示,该方法能检测到的最低核酸含量为15pg。对采集于12个猪场27个腹泻样本和29个临床健康的样品进行了检测。结果显示,腹泻样本中检出率为33.3%(9/27),而在健康样本中检出率为6.9%(2/29)。以上结果表明本研究成功建立了一种敏感度高、特异性强、重复性良好的用于PToV的RT-PCR方法。 相似文献
12.
《畜牧兽医学报》2020,(4)
牛库布病毒(bovine kobuvirus,BKoV)可能是一个腹泻相关病原,目前还没有检测该病毒的实时荧光定量RT-PCR方法的报道。依据BKoV 3D核苷酸序列,采用Primer 6.0设计了一对引物,通过优化反应条件和反应体系,成功建立了检测BKoV的TB Green染料法实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示此方法在4.86×10~8～4.86×10~2 copies·μL~(-1)病毒浓度之间具有良好的线性关系,相关系数为0.999 5,扩增效率为92.75%;此方法只特异性检测BKoV,而与其他常见的腹泻病原没有交叉反应;组内及组间的变异系数均小于2%;最低检测下限为4.86×10~2 copies·μL~(-1)。本研究所建的实时荧光定量RT-PCR方法对奶牛和牦牛腹泻粪便样本中BKoV的检出率明显高于已报道的3篇有关RT-PCR方法。对2018年5月—2019年5月采集自青藏高原地区(青海、西藏和四川藏区)的131份牦牛腹泻粪便样本进行检测,结果显示BKoV检出率为31.30%。首次成功建立了检测BKoV的实时荧光定量RT-PCR方法,具有良好的特异性和稳定性,且灵敏度高,为BKoV的检测及流行病学调查提供了一种新的技术手段;并且首次证实BKoV在牦牛中的流行,为牦牛腹泻的防控问题提供了参考。 相似文献
13.
实时荧光定量RT-PCR检测牛库布病毒 总被引：1，自引：1，他引：0
牛库布病毒（bovine kobuvirus，BKoV）可能是一个腹泻相关病原，目前还没有检测该病毒的实时荧光定量RT-PCR方法的报道。依据BKoV 3D核苷酸序列，采用Primer 6.0设计了一对引物，通过优化反应条件和反应体系，成功建立了检测BKoV的TB Green染料法实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示此方法在4.86×108~4.86×102 copies·μL-1病毒浓度之间具有良好的线性关系，相关系数为0.999 5，扩增效率为92.75%；此方法只特异性检测BKoV，而与其他常见的腹泻病原没有交叉反应；组内及组间的变异系数均小于2%；最低检测下限为4.86×102 copies·μL-1。本研究所建的实时荧光定量RT-PCR方法对奶牛和牦牛腹泻粪便样本中BKoV的检出率明显高于已报道的3篇有关RT-PCR方法。对2018年5月-2019年5月采集自青藏高原地区（青海、西藏和四川藏区）的131份牦牛腹泻粪便样本进行检测，结果显示BKoV检出率为31.30%。首次成功建立了检测BKoV的实时荧光定量RT-PCR方法，具有良好的特异性和稳定性，且灵敏度高，为BKoV的检测及流行病学调查提供了一种新的技术手段；并且首次证实BKoV在牦牛中的流行，为牦牛腹泻的防控问题提供了参考。 相似文献
14.
为了解四川省主要养牛地区腹泻牛群中牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)感染情况,采集眉山、南充、达州、巴中、雅安、甘孜等6个市州53个场户的牛腹泻粪便样品共387份,采用荧光RT-PCR方法进行BCoV检测。结果显示:53个场点中,检出阳性场点11个,群体阳性检出率为20.8%;387份样品中,检出阳性样品65份,个体阳性检出率为16.8%。从群间分布看,规模场群体阳性检出率(72.7%)与个体阳性检出率(21.4%)均高于散养户(7.1%和3.1%),差异均极显著(P 0.01);牦牛个体阳性检出率为28.8%,高于黄牛(14.1%)和奶牛(11.1%),差异均有统计学意义,分别为P 0.01和P 0.05。结果表明,BCoV在四川省已形成一定的污染面,是造成牛腹泻的重要病原之一,需要加强对其流行的综合防控。 相似文献
15.
鹅星状病毒RT-PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
《现代畜牧兽医》2021,(4)
为建立一种鉴定鹅星状病毒(GAstV)的RT-PCR方法,试验根据GenBank中GAstV ORF1b基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD18-T-GAstV,以其作为标准品建立GAstV的RT-PCR检测方法。通过对GAstV及其他4种病毒进行检测,优化其反应条件并进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。结果显示,除GAstV外,鹅细小病毒(GPV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、鸡病毒性关节炎(AVAV)、坦布苏病毒(TmuV)等常见禽病病原利用该方法检测均呈阴性,表明其特异性良好;建立的RT-PCR检测方法的最低检出限可达5.5×10~3,敏感性较高;重复性试验显示其重复性良好。利用该方法对10份人工模拟病料进行检测限LOD分析,阳性样品10倍系列稀释浓度。结果表明,最低检出限可达1.21×10~3copies/μL。研究表明,成功建立了一种鉴定GAstV的RT-PCR方法,且该方法具有快速、廉价、特异性强、敏感性高和重复性好的优点,可用于GAstV的临床诊断。 相似文献
16.
辽宁省某奶牛养殖场10～30日龄犊牛发生腹泻,为查明病因,我们对送检的18份犊牛腹泻样本分别进行牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、沙门氏菌(Salmonella)和安氏隐孢子虫(C. andersoni)的PCR检测。结果显示:18份犊牛腹泻样本中,BRV、BCoV、BVDV的检出率分别为83.3%(15/18)、88.9%(16/18)、61.1%(11/18),这3种病原的混合感染率较高,其他病原均未检出,说明该奶牛场的犊牛腹泻主要由BRV、BCoV、BVDV混合感染引起。 相似文献
17.
《中国预防兽医学报》2021,(4)
为建立检测牛轮状病毒(BRV)快速特异的荧光定量RT-PCR方法,本研究针对BRV NSP5基因设计了一对特异性引物经PCR扩增目的片段,并克隆于pCI载体作为重组质粒标准品(pCI-NSP5),经优化反应条件,建立了基于NSP5基因的BRV荧光定量RT-PCR方法,并对其进行了特异性、敏感性及重复性试验。结果显示,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法最佳引物浓度为10μmol/L,模板为2μL,退火温度为58℃;特异性试验结果显示,该方法除对BRV的检测结果为阳性外,对牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛副流感3型病毒、牛呼吸道合胞体病毒的检测结果均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对重组质粒标准品的最低检测限为12拷贝/μL,对BRV的最低检测限为1×10~2TCID50/反应;批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。利用该方法检测30份BRV接种犊牛的粪便样品,结果 25份呈阳性,而利用VP7基因的常规RT-PCR和病毒分离方法检出的阳性样品分别为20份和25份,表明本研究建立的检测方法的敏感性高于VP7基因的常规RT-PCR方法,而与病毒分离方法的符合率为100%。以上结果表明,本研究建立的BRV NSP5基因荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可以用于BRV的快速检测、病原流行病学调查以及疫苗免疫攻毒试验的病毒载量定量等研究。 相似文献
18.
《中国预防兽医学报》2018,(12)
为建立一种快速检测猪非典型性瘟病毒(APPV)的方法,本实验建立了APPV SYBR Green Ⅱ荧光定量RT-PCR检测方法。该方法特异性试验结果显示,除APPV外,猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒等常见猪病病原检测均为阴性,表明其特异性良好;该方法最低检测限为2.8×10~3拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验的组内、组间变异系数均小于1%。利用该方法对临床56份来自四川各地的临床病料样品进行检测,检出5份阳性样品,且与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。本研究建立的APPV荧光定量RT-PCR检测方法为APPV临床检出以及后期并发症的研究奠定了基础。 相似文献
19.
《青海畜牧兽医杂志》2019,(6)
2018年7月,青海省玉树地区一牦牛养殖户2～3月龄的犊牦牛爆发以腹泻为主要症状的疾病。本实验的目的是调查腹泻的病因并了解病原的分子特征。无菌采集9份犊牦牛腹泻粪便样本,采用PCR检测方法对牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、沙门氏菌、产肠毒素大肠杆菌、安氏隐孢子虫等6种常见致腹泻病原进行了检测。结果显示,9份样本中有6份为牛冠状病毒阳性,其它5种病原均未检出。对6份阳性样品进行冠状病毒S1亚基基因扩增,序列分析显示,6份样品中冠状病毒S1亚基有7个共同的氨基酸变异,区别于GenBank登录的冠状病毒该段氨基酸序列。系统发育显示6株冠状病毒的S1亚基基因有独特的遗传进化趋势。本实验结果为当地牦牛腹泻的防控提供了参考。 相似文献
20.
鸽A群轮状病毒(group A rotavirus,RVA)是影响养鸽业健康发展的主要病原之一。为实现鸽RVA的高通量快速检测，根据目前国内外流行的鸽RVA VP6基因保守区域设计特异性引物与探针，建立了一种可以特异性检测鸽RVA的实时荧光RT-PCR方法，并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行了评估。结果显示，该方法灵敏度高，最低检测限为7.22×102 copies/μL；特异性强，与鸽群其他常见病毒无交叉反应；重复性好，组内与组间重复变异系数均小于1.5%。利用该方法和普通RT-PCR方法对200份临床样品进行检测，发现荧光RT-PCR方法的病毒阳性检出率高于普通RT-PCR方法，二者符合率为94.00%。结果表明，本研究建立的实时荧光RT-PCR方法敏感、特异、准确，重复性好，可为开展鸽RVA的临床检测及流行病学调查提供技术支持。 相似文献