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应用纳米磁珠实时荧光PCR检测非洲木薯花叶病毒 总被引：1，自引：1，他引：0
建立非洲木薯花叶病毒(African cassava mosaic virus, ACMV)灵敏快速的纳米磁珠实时荧光PCR检测技术,防止其传入中国。采用TaqMan探针结合纳米磁珠(magnetic nanoparticles, MNPs)技术,以外壳蛋白基因为目标基因,通过特异性及灵敏度试验建立MNP荧光PCR检测方法。成功建立了非洲木薯花叶病毒(ACMV)的MNP荧光PCR检测方法;该方法检测阈值约为13 pg DNA,比普通PCR及ELISA方法灵敏度高25倍;该方法具有良好的特异性,能够有效区分双生病毒属的ACMV、棉花曲叶病毒(CLCuV)、番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)及番茄严重曲叶病毒(ToSLCV)。MNP荧光PCR方法能够快速灵敏的检测茎叶样品中的ACMV,无需任何PCR后处理,交叉污染风险小,适于口岸检验检疫。 相似文献
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《分子植物育种》2017,(10)
本研究根据辣椒轻斑驳病毒(PMMo V)、烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白(CP)编码序列设计了3对PCR检测引物,并初步建立了同步检测以上3种辣椒病毒的多重RT-PCR方法。以被感染了3种病毒的叶片的总RNA作为模板,可同时扩增到324 bp(TMV)、220 bp(PMMo V)和112 bp(CMV)的3个目标条带,在电泳图上清晰可辨。测序结果表明所扩增产物确为待检病毒靶序列。除阳性对照外,该多重RT-PCR体系不对ORSV、PVX和PVY等同属或不同属的其它病毒发生反应;该体系可检测到104倍稀释的病毒c DNA模板。同时,以建立的三重RT-PCR法对10份田间辣椒病样进行检测,其结果与单重RT-PCR结果一致,说明该法检测结果可靠,可用于PMMo V、TMV和CMV 3种辣椒病毒的同步检测。 相似文献
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<正>日前,国家知识产权局公开一件由云南省烟草农业科学研究院和云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所共同申请的发明专利:一种烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法。该发明公开了一种烟草花叶型病株中烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草脉带花叶病毒3种病毒的检测方法。通过 相似文献
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猪伪狂犬病毒Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法的建立及应用 总被引：3，自引：1，他引：2
本研究根据猪伪狂犬病病毒gE基因序列,设计一对特异引物和探针,通过优化反应条件,建立了可区分猪伪狂犬野毒株及基因缺失疫苗株的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。结果表明：TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法灵敏度可达2.23×101拷贝/μL,比常规PCR检测方法高100倍;同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒（PPV）、均为阴性,无交叉反应;对30份疑似病料的TaqMan荧光定量PCR和普通PCR检测阳性率分别为40%和33%,两者符合率90%。表明该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测大量样品,可适合于PRV的临床诊断和流行病学调查。 相似文献
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黄瓜绿斑驳花叶病毒的鉴定及分子检测 总被引：5，自引：1，他引：4
【研究目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）的快速鉴定检测是控制该潜在危险性有害生物蔓延的有效途径。【方法】通过汁液摩擦接种、透射电镜观察、双抗夹心酶联免疫吸附测定法（DAS-ELISA）和RT-PCR方法对该病毒进行鉴定;同时对RT-PCR反应体系及扩增程序进行优化,建立CGMMV免疫捕获RT-PCR（IC-RT-PCR）检测方法。【结果】血清学、生物学、电镜观察和分子生物学方法证明供试样本为黄瓜绿斑驳花叶病毒引致。IC-RT-PCR方法可以简化RNA的提取,降低对试验材料要求。【结论】IC-RT-PCR的建立为CGMMV的检测提供了操作更为简便、特异性更强的快速、准确的检测方法。 相似文献
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强筋小麦分子标记多重PCR体系的构建与应用 总被引：1，自引：0，他引：1
面筋强度与小麦高低分子量谷蛋白亚基种类(组合)密切相关。以12个已知亚基基因组成的品种为对照,选用基因(位点)Axnull、Bx7OE、Dx5、Glu-A3d、Glu-B3i和Glu-B3的标记,构建多重PCR体系。以该体系检测对照的结果与已知基因型完全一致,一次PCR可同时间接检测7个与强筋有关基因(位点)Ax1/Ax2*、Bx7OE、Dx5、Glu-A3d、Glu-B3i和Glu-B3。对62个陕西小麦品种的检测结果表明,优质强筋亚基基因(位点)Ax1/Ax2*、Dx5、Glu-A3d、Glu-B3i和Glu-B3的比例依次为56.5%、9.6%、33.9%、1.6%和64.4%,所有品种均不含Bx7OE,携带0、1、2和3个及以上基因(位点)的品种分别占6.5%、33.9%、48.3%和11.3%。说明聚合多个强筋亚基基因(位点)的品种频率较低,通过优质亚基基因的聚合育种,可望改善陕西小麦品种的面筋品质。本研究所构建的强筋小麦分子标记检测的多重PCR体系检测结果稳定且可靠,可用于小麦种质资源的快速评价和强筋小麦分子辅助选育。 相似文献
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应用RNA沉默技术获取抗黄瓜花叶病毒(CMV)和烟草花叶病毒(TMV)转基因烟草 总被引：1，自引：0，他引：1
RNA沉默是迄今最为有效的抗病毒策略,利用该策略不但能获得免疫转基因植株,且所得植株不易与其他病毒基因重组或异源包壳、生物安全性较高。将本实验室已构建的携带有烟草花叶病毒(TMV)部分移动蛋白基因(ΔMP)和黄瓜花叶病毒(CMV)部分复制酶基因(ΔRep)反向重复结构的植物表达载体pBIN438-MP-Rep(i/r),用农杆菌浸润法转化普通烟草品种K326,共得196株转化植株,经卡那霉素筛选和PCR检测发现128株为阳性转基因株;PCR-Southern和RT-PCR分析表明外源基因已整合到烟草基因组并在转录水平上得到表达;ELISA结果显示20.3%的转基因植株对CMV和TMV复合侵染表现免疫性。本结果为利用RNA沉默技术进行植物抗多种病毒育种提供重要数据,为防治其他多种病毒复合侵染提供借鉴。 相似文献
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本研究旨在针对甜瓜种子中携带的黄瓜花叶病毒(CMV)和小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV),建立可视化环介导等温扩增检测方法。根据CMV和ZYMV外壳蛋白(CP)基因的保守序列,分别设计并筛选出2套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,通过对反应体系中主要影响因素的优化,建立适用于快速检测CMV和ZYMV的RT-LAMP检测方法。对优化后的2种LAMP检测方法进行特异性和灵敏度验证。结果表明,建立的2种LAMP检测方法分别能够特异性地检测出CMV和ZYMV,检测灵敏度较常规RT-PCR分别高出10倍和100倍,并且可通过肉眼观察直接对反应结果进行判定。该方法的建立为基层及现场快速检测甜瓜种子的带毒情况提供了新方法。 相似文献
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抗除草剂棉花LLCOTTON25的多重PCR检测方法 总被引：3，自引：1，他引：2
为了建立1种抗除草剂棉花LLCOTTON25多重PCR检测方法,根据抗除草剂棉花LLCOTTON25分子特征,同时选择棉花内源参照基因(SADI)、花椰菜花叶病毒启动子(P-Ca MV 35S)、根癌农杆菌终止子(T-NOS)和目的基因(bar)4个基因作为多重PCR(Polymerase chain reaction)检测基因,参照国家相关标准中的特异性引物序列,通过对反应条件的优化以及方法特异性和灵敏度测试,建立了可同时检测除内源基因外的3种外源目的基因的多重PCR检测体系。利用已知样品对本体系验证,抗除草剂棉花LLCOTTON25能被同时检出SADI、P-Ca MV 35S、T-NOS、bar等4个基因,而其他样品均不能被同时检出这4个基因。结果表明此体系可运用于抗除草剂棉花LLCOTTON25检测。 相似文献
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水仙花叶病毒RT-PCR检测方法的建立及应用 总被引：3，自引：1，他引：2
旨在建立水仙花叶病毒(Narcissus mosaic virus,NMV)的分子快速检测方法。根据已公布的NMV基因序列,设计一对特异性引物,以提取的水仙样品总RNA为模板进行RT-PCR,并对该方法的特异性、灵敏度、重复性及实际检测效果进行测定。从感染NMV的水仙样品中成功扩增出预期大小（约483 kb）的特异性目的片段,而健康水仙上未扩增到相应的片段。特异性、灵敏度及重复性测定结果表明,本研究建立的RT-PCR方法特异性强、灵敏高、重复性好。应用该方法成功检测了一批口岸送检的水仙样品。本研究建立的RT-PCR方法可为水仙上NMV的检测提供可靠的技术支持。 相似文献
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建立高效的目的基因检测方法是保障生物育种研发和产业化进程的重要技术支撑。应用常规PCR法、TaqMan探针实时荧光PCR法及叶片直接PCR法对转基因玉米叶片进行CaMV35S启动子和NOS终止子2个转基因元件的检测。结果表明,叶片直接PCR法分别较常规PCR方法和TaqMan探针实时荧光PCR法节约62%、48%的时间和25%、43%的成本,而且扩增出的目的条带清晰可见,符合目的片段大小,结果真实可靠,适用于大量转基因玉米植株叶片的快速筛选和鉴定。 相似文献
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根据犬瘟热病毒核蛋白基因的保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针建立荧光定量PCR。构建FQ-PCR绝对定量的标准品,并对反应体系进行优化, 建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验方法的灵敏度并与普通RT-PCR法进行比较;特异性检验后进行临床标本的检验。结果显示：实验成功构建了绝对定量的参照质粒,标准曲线相关系数为0.994。犬瘟热病毒FQ-PCR检测反应的灵敏度为10 TCID50;5种非犬瘟热病毒病原体检测均为阴性;说明本实验建立的FQ-PCR具有快速、灵敏和稳定的特点,适用于临床样品的检验。 相似文献
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根据肉毒梭菌神经毒素基因设计的引物和探针,建立了肉毒梭菌荧光定量PCR快速检测方法。肉毒梭菌产生了典型的"S"型曲线,其他干扰菌都无扩增,说明引物特异性较好,检测灵敏度为1×103 cfu/mL。该方法能够实现肉毒梭菌的快速检测,具有灵敏度高、特异性好的特点。 相似文献
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为了快速进行甘薯病毒田间检测和脱毒苗诊断,该研究建立了一个能够同时检测SPCSV、SPLV和SPFMV这3种病毒的多重RT-PCR检测方法。根据GenBank公示的甘薯病毒基因序列来设计3种甘薯病毒的引物,分别对模板浓度、退火温度、Mg2+浓度和循环次数进行优化,同时对模板浓度进行10倍梯度稀释,检测多重RT-PCR灵敏度。结果显示,模板浓度为19 ng/μL、退火温度为52℃、Mg2+浓度为0 mmol/L、循环次数为40次时,可以同时扩增出大小为276 bp、570 bp、425 bp三种病毒的基因片段,多重RT-PCR检测灵敏度为10-4,单一RT-PCR检测灵敏度为10-3,多重RT-PCR检测灵敏度是单一RT-PCR的10倍。该研究使用优化的多重RT-PCR检测技术可获得稳定、灵敏、准确、高效地和同时地检测田间复合侵染的3种甘薯病毒。 相似文献
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该研究旨在建立一种快速检测猪多杀性巴氏杆菌的LAMP方法。根据GenBank中猪多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因(ompH)序列,在其保守区域设计了多套LAMP引物,通过LAMP反应,评价其特异性和敏感性,并加入SYBR Green Ⅰ,对其进行肉眼判定。结果显示：建立的LAMP方法在56℃水浴中1 h可对猪多杀性巴氏杆菌核酸进行高效扩增,在反应结束后加入SYBR Green Ⅰ可肉眼进行判断;该方法具有很强的特异性,对其它相关猪病病原菌检测结果均为阴性;其DNA核酸的检测量为0.05pg,是PCR的100倍,显示出很高的敏感性;用建立的LAMP方法对5株猪多杀性巴氏杆菌阳性样品进行检测,结果表明LAMP法与PCR检测的结果是一致的。结果表明该研究建立了一种操作简便、快速、敏感、特异的可对猪多杀性巴氏杆菌进行快速检测并可肉眼判定结果的可视化LAMP方法,适合在基层使用。 相似文献