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1.
采用RT-PCR方法克隆了编码禾谷镰刀菌单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶Tri101基因的cDNA序列,并连接到原核表达载体pGEX-4T2上,将获得的重组载体pGEX-4T2/Tri101转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,经IPTG诱导后,Tri101基因在大肠杆菌BL21中获得了高效表达,融合蛋白GST-Tri101分子量为75.45 kDa。将该融合蛋白切胶纯化后免疫家兔,制备兔抗GST-Tri101多克隆抗体。经ELISA法测定抗体效价大于1∶256 000。Western blot分析表明制备的抗体与原核细胞体外表达的Tri101蛋白可以特异性结合,表明该抗体的特异性良好。应用该抗体验证了感赤霉病小麦中Tri101基因的表达。兔抗GST-Tri101抗体的成功制备,为进一步研究Tri101的生物学功能、细胞定位以及在其它植物中的表达等奠定了基础。 相似文献
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甘蔗花叶病毒HC-Pro基因原核表达及表达产物抗血清制备 总被引：3，自引：2，他引：3
采用RT-PCR方法自甘蔗花叶病毒北京玉米分离物（SCMV-BJ）的基因组中分离出其HC-Pro基因，通过T4DNA聚合酶连接到原核表达载体pET-22b（＋）上，获得的重组子pETHC转化大肠杆菌B121（DE3），用IPTG在37℃进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明，HC-Pro基因在大肠杆菌中获得了高效表达，产生分子量约为52kDa的融合蛋白。将融合蛋白纯化后免疫兔子，获得了特异性的抗血清并提取了抗体IgG。ACP-ELISA测定抗血清的效价为1／8192。结果表明，该血清可用于SCMV-BJ的检测，并为进一步分析HC-Pro的功能奠定基础。 相似文献
3.
通过PCR的方法,从番茄黄化曲叶病毒江苏分离物DNA中扩增到V2基因,并克隆到pMD18-T载体,序列测定结果显示其与报道的XH2分离物序列完全一致,核苷酸序列全长351 bp,编码115个氨基酸,推测分子量约13 kD。将该V2基因亚克隆到原核表达载体PET32a中获得重组表达载体PET32a-V2,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG可诱导1个分子量约为32 kDa的融合蛋白（含His标签）表达,经Ni+ NTA亲和柱纯化,获得纯化的重组蛋白,免疫家兔制备TYLCV-V2蛋白的多克隆抗体Anti-V2,间接ELISA测定Anti-V2的效价达1∶655 360,Western blot及DIBA分析结果表明Anti-V2可与V2蛋白发生特异血清反应,可为进一步研究V2蛋白的功能提供参考。 相似文献
4.
为了分析草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus,SVBV）ORF Ⅵ基因的功能,采用原核表达技术获得该基因表达的重组蛋白并制备其抗血清。利用PCR技术扩增得到SVBV中国分离物的ORF Ⅵ基因,将此基因克隆到原核表达载体pET-SUMO上,获得重组质粒pET-SUMO-ORF Ⅵ。转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经IPTG诱导与Ni2+-NTA亲和柱纯化,获得分子质量约为90 kD的重组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清,采用间接ELISA和Western blot方法测定抗血清的效价、反应灵敏度以及ORF Ⅵ基因在本氏烟中的瞬时表达。结果显示,间接ELISA法测定抗血清对重组蛋白的效价达1：256 000,Western blot法能够检测到稀释64 000倍的重组蛋白。利用稀释2 000倍的抗血清,仍能够检测出SVBV中国分离物和美国分离物ORF Ⅵ基因在本氏烟中瞬时表达的蛋白。 相似文献
5.
本研究通过RT-PCR技术获得了包含李属坏死环斑病毒怀柔分离物CP蛋白基因的DNA片段,构建了针对pET29a载体的两种表达质粒;〖JP2〗转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导表达了带不同融合肽段的PNRSV1（25 ku）〖JP〗和PNRSV2（29 ku）融合蛋白。经过Ni NTA亲和柱与SDS PAGE分离纯化,获得大量表达融合蛋白,并免疫家兔制备了融合表达蛋白的特异性抗体。间接ELISA测定其效价分别为8×103和3.2×104。 相似文献
6.
为实现对玉米黄花叶病毒（maize yellow mosaic virus,MaYMV）的血清学检测,丰富该病毒的检测方法,将编码MaYMV运动蛋白（movement protein,MP）的基因连接到原核表达载体pDBHis-MBP上,将构建成功的原核表达质粒转化到大肠杆菌Escherichia coli中诱导表达融合蛋白,将纯化后的融合蛋白对新西兰大白兔Oryctolagus cuniculus进行免疫并制备MaYMV MP多克隆抗血清,并采用Western blot对抗血清的效价、灵敏度和特异性进行检测。结果显示,利用成功构建的原核表达载体经诱导表达获得分子量大小约为62 kD的融合蛋白,纯化后对新西兰大白兔进行免疫获得MaYMV MP抗血清,该抗血清的效价为1∶128 000,灵敏度为1∶32,且该抗血清能够特异性地检测到本氏烟Nicotiana benthamiana中瞬时表达的MaYMV MP,而不与马铃薯卷叶病毒属Polerovirus及黄症病毒属Luteovirus的其他病毒发生血清学交叉反应,证明该抗血清具有良好的特异性。表明本研究制备的MaYMV MP抗血清能特异性... 相似文献
7.
为检测几丁质酶的表达,制备稻瘟病菌的一假定几丁质酶多克隆抗体,探索其可能运用。将稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae) 几丁质酶基因克隆入融合表达载体pET\|32a,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行诱导表达。表达菌株经0.5 mmol/L IPTG诱导4～6 h后,用Ni2+\|NTA亲和柱纯化蛋白,得到可溶的几丁质酶\|His融合蛋白。以该融合蛋白免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体。ELISA分析表明该抗体效价达1∶204 800,特异性良好。用该抗体ELISA检测了稻瘟病菌4个不同田间菌株中,不同的菌株表达量不同。对稻瘟病菌侵染水稻3、5和7d后的病叶进行抗原Western验证,结果表明,稻瘟病菌不同的侵染时间其几丁质酶表达量有明显差异。 几丁质酶表达的差异是否与菌株间致病型等生物学和生理学差异有关,目前正在进一步研究。 相似文献
8.
以柑橘溃疡病菌DNA为模板,对抗铜相关基因copA和copB进行了PCR扩增和克隆,获得了大小分别为1 782 bp 和1 095 bp的目标片段。构建了这2个基因的原核表达载体 (pET-copA和pET-copB),并在大肠杆菌 [Escherichia coli BL21(DE3)] 中成功诱导表达。利用原核表达的融合蛋白免疫大耳白兔,制备了抗copA和copB原核表达蛋白的多克隆抗体。用间接ELISA法测定了所制备的多克隆抗体的效价均为1∶6 400。用所制备的抗体分别对copA和copB的原核表达产物进行Western blot分析的结果显示,在相应位置产生了较强的免疫反应条带,表明所制备抗体能特异性地与相应的抗原发生免疫反应。 相似文献
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灰飞虱Laodelphax striatellus的囊泡相关膜蛋白相关蛋白B(VAP-B)是内质网膜蛋白家族的蛋白,其主要参与调节囊泡运输、脂类的转运代谢以及未折叠蛋白应答等。本研究克隆了灰飞虱VAP-B基因,构建了pCold-SUMO-VAP-B原核表达载体,再将其转化大肠杆菌感受态细胞Rosetta(DE3),经过IPTG低温诱导表达得到了含有HIS和SUMO标签的VAP-B可溶性蛋白,经过Ni2+-NTA亲和层析柱纯化后的蛋白再利用rTEV酶去除SUMO标签,得到无标签的VAP-B蛋白。通过免疫新西兰雄兔制备了VAP-B的多克隆抗体。Western blot检测结果表明该抗体可以特异性检测到灰飞虱的VAP-B蛋白;同时利用该抗体进行免疫荧光标记,发现其能特异性定位灰飞虱唾液腺内的VAP-B蛋白。研究结果表明制备的VAP-B抗体能够成功用于该蛋白的体内外检测,为阐明VAP-B在灰飞虱体内的关键作用奠定了基础。 相似文献
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李属坏死环斑病毒CP基因在大肠杆菌中的表达及其抗血清制备 总被引：2，自引：0，他引：2
本实验用RT—PCR的方法获得李属坏死环斑病毒的印基因，并将其连接到表达载体pET-22b（＋）上，得到重组质粒pET—PNRSVCP，转化大肠杆菌BL21（DE3）后，用IPTG进行诱导表达。SDSPAGE和Westernblot分析结果表明，印基因在大肠杆菌中获得了高效表达，获得的融合蛋白分子量约为29．0kDa。将该融合蛋白免疫兔子，获得PNRSV特异性抗血清。酶联法（ELISA）测定的效价为1／1024。为用血清学方法检测该病毒提供了基础条件。 相似文献
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热激蛋白（Heat Shock Proteins,HSPs）是一类广泛存在于细菌、真菌和动植物中的热应激蛋白质。本研究从松材线虫基因组中获取了23个与秀丽线虫HSPs基因家族同源的Bx-HSPs家族基因。随后对这些基因所编码的蛋白质二级结构、疏水性、蛋白质序列基序和三级结构等生物学特性进行了预测。结果表明了Bx-HSPs家族成员的分子伴侣特性。本研究为松材线虫应激生理学及研究松材线虫适生范围和风险分析提供了分子生物学理论基础。 相似文献
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根据全省松材线虫病发生危害现状、传播规律和枯死松树分布等,按照合理区划、分类施策的原则,将全省松材线虫病防控区域划分为发生除治区、重点防控区和一般预防区,并针对各防控类型区提出相应的防控对策与措施。 相似文献
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苏云金芽孢杆菌对松材线虫的杀线活性 总被引：1，自引：0，他引：1
在室内条件下,测定了17株苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis伴孢晶体蛋白对松材线虫Bursaphelenchus xylophilus的杀线活性。通过初筛,发现菌株020、RBT-200701的伴孢晶体蛋白对松材线虫有明显毒杀作用。在测试的浓度范围内（菌株020为6.37-203.9μg/ml;RBT-200701为13.7-438.8μg/ml）,菌株对松材线虫的校正死亡率随其浓度增大而提高;随时间延长杀虫效果提高。020菌株晶体蛋白24h、48h时对松材线虫的LC50、LC95分别为183.20、408.20μg/ml和80.132、25.29μg/ml;RBT-200701菌株伴孢晶体蛋白24、48h时对松材线虫的LC50、LC95分别为368.00、868.00μg/ml和82.73、382.73μg/ml。SDS-PAGE分析发现这2个菌株晶体蛋白的蛋白图谱不同。 相似文献
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Muhammad M. Mackeen Abdul M. Ali Mohd A. Abdullah Rozita M. Nasir Nashriyah B. Mat Abdul R. Razak Kazuyoshi Kawazu 《Pest management science》1997,51(2):165-170
Methanolic extracts of 79 Malaysian plants representing 42 families were assessed for antinematodal activity against Bursaphelenchus xylophilus using a fungal-feeding assay. Extracts of 27 plants from 19 families showed antinematodal activity, while 52 species were inactive. Five extracts (Sauropus androgynus, Eugenia polyantha, Areca catechu, Piper betle and Piper nigrum) exhibited very strong activity against Bursaphelenchus xylophilus at a minimum effective dose (MED) of 0·625 mg per ball. Strong antinematodal activity (MED: 1·25–2·5 mg per ball) was shown by the extracts of Spondias cyntherea, Codiageum variegatum, Euodia glabra and Cicca acida. Eleven extracts (Carica papaya, Ipomoea aquatica, Ocimum basilicum, Leea gigantea, Pithecellobium jiringa, Crypteronia paniculata, Myristica fragrans, Murraya koenigii, Leucaena leucocephala, Melastoma malabathricum and Morinda citrifolia) demonstrated moderate activity between MED of 5 and 10 mg per ball, and weak activity was observed in seven extracts (Ipomoea batatas, Cymbopogon citratus, Garcinia atroviridis, Psophocarpus tetragonolobus, Tamarindus indica, Allium odorum and Stenochalaena palustris). © 1997 SCI 相似文献
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松材线虫自然侵染后对不同松树组织结构的影响 总被引：2，自引：0，他引：2
利用滑走切片技术从显微水平研究松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）在自然状态下入侵,对马尾松（Pinus massoniana）和黑松（Pinus thunbergii）显微结构的影响。结果表明,马尾松和黑松的组织结构在感病初期即表现出病变特征,并随感病时间推移病变加剧。马尾松在感病初期皮层薄壁细胞开始木质化,伴有细胞破裂并融合成空腔;至感病中期周皮的栓内层细胞、皮层薄壁细胞以及韧皮部薄壁细胞均发生木质化,细胞内含物增多,甚至形成层细胞也发生一定程度的木质化现象,树脂道因周围细胞破裂而变形;至感病晚期,木材以外所有部分完全被木质化、大量细胞破裂。黑松发病症状与马尾松大致相同但发病时间稍晚,发病程度也较轻,这可能是因为两者对松材线虫病的抗性强弱有差异。同一时期的组织病理学特征在空间上也存有差异,这与松材线虫入侵的位置及其在树体内的分布有关。 相似文献
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松材线虫病组织病理学研究 总被引：16，自引：1，他引：16
利用马尾松水培离体松枝作接种试验材料,对松材线虫侵染早期寄主细胞和组织所发生的一系列病理变化作了观察。切片结果表明,接种枝树脂道的细胞最先受到线虫侵袭的破坏。由核变形、胞质凝聚标志的轴向和射线薄壁细胞的死亡,是寄主对线虫侵染的第一个明显的组织病理学反应。这一反应随线虫侵入时间而日益显著,死亡薄壁细胞数量和程度上的逐步增加,反映了病害的发展进程。 相似文献
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牡丹皮、黄连、大黄提取物对松材线虫生理代谢的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
对3种中草药黄连、牡丹皮、大黄的乙醇提取物毒杀松材线虫作用机制进行了初步研究。测定了其对线虫体内总糖和蛋白含量的影响, 处理前后线虫体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和乙酰胆碱酯酶（AChE）酶活性变化和丙二醛（MDA）含量变化, 处理前后SOD、CAT、GSH-Px和AChE表达量变化; 并用松枝水培试验测定3种提取物对松材线虫病害的防控效果。结果表明, 提取物处理后线虫体内总糖及蛋白含量显著下降, 线虫体内糖及蛋白质的代谢受到干扰; 线虫体内SOD、CAT、GSH-Px酶活性提高, POD活性显著下降, MDA含量升高, 表明线虫体内氧化与抗氧化作用失衡, 细胞功能受到极大影响; AChE活性被抑制, 表明线虫的神经系统受到破坏, SOD、CAT、GSH-Px和POD表达量与酶活性变化基本一致。松枝水培试验表明中药提取物能够有效控制松材线虫病害发生。综上, 3种提取物引起的松材线虫体内众多生理指标的改变是造成线虫死亡的主要原因。 相似文献