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小鼠Nanog基因原核表达载体的构建及表达 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达，以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据GeneBank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物，以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板，经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接，转化TGⅠ大肠杆菌，筛选阳性克隆，其扩增片段测序结果与原序列一致，表明原核表达载体pGEX-KG-Nanog已构建成功。提取pGEX-KG-Nanog质粒转化到BL21（DE3）表达菌株中，经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定，并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得Nanog基因融合表达，主要以包涵体形式存在；融合蛋白的分子量为63 kD；以IPTG终浓度为0.8 mmol•L-1，诱导5 h后融合蛋白产量最高。【结论】小鼠Nanog基因在大肠杆菌中获得了高效表达，为今后Nanog蛋白的多克隆抗体制备奠定基础。 相似文献
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【目的】在大肠杆菌中过表达、纯化水稻冷胁迫响应蛋白OsCML16,同时制备OsCML16蛋白抗体提供抗原,为采用该抗体研究水稻OsCML16蛋白的生物学功能提供参考依据。【方法】采用TMHMM 2.0在线分析软件对目的蛋白OsCML16进行跨膜区分析,利用高保真PCR扩增目的基因片段,以基因重组方法构建原核表达载体pET30a-OsCML16,并将重组质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中;通过IPTG诱导OsCML16蛋白表达,然后采用亲和层析方法纯化获得目的蛋白,最后运用质谱验证法分析验证蛋白序列的真实性。【结果】通过对OsCML16蛋白跨膜区分析,发现该蛋白不包含跨膜结构,适合外源表达全长蛋白。将OsCML16基因链接至pET30a载体能成功构建原核表达载体pET30a-OsCML16,目的基因序列无突变位点,可用于表达目标蛋白。外源表达的OsCML16蛋白经过SDS-PAGE电泳分析,结果表明,OsCML16蛋白在28℃下可诱导表达,采用亲和层析方法纯化融合蛋白His6-OsCML16-His6,能成功获得分子量约30 kD的目... 相似文献
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【目的】克隆盐芥谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs)基因ThGPX8,对其进行序列分析,构建原核表达载体,为进一步研究ThGPX8的结构和功能奠定基础。【方法】以盐芥为材料,利用RT-PCR技术获得其ThGPX8基因的全长cDNA序列;应用生物信息学手段对该基因编码的蛋白结构和系统进化关系进行分析;构建原核表达载体pET-ThGPX8,转化E.coli BL21(DE3),进行IPTG诱导表达、SDS-PAGE检测和Western blotting鉴定。【结果】获得的ThGPX8基因序列的开放阅读框(ORF)为504bp,编码167个氨基酸,具有GPXs的特征结构域,不是跨膜蛋白;其二级结构主要由无规则卷曲组成,三级结构为二聚体。进化树分析表明,盐芥ThGPX8与拟南芥AlyGPX8、AtGPX8和油菜BnGPX8具有较高的同源性。盐芥ThGPX8与ThGPX6的理化性质存在差异,但具有相似的二级结构和三级结构。将ThGPX8转入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达得到了分子质量约23ku的蛋白,该蛋白在37℃下诱导5h可获得较高的表达量。【结论】获得的ThGPX8基因cDNA序列所编码的蛋白属于植物GPXs家族成员,利用构建的原核表达载体pET-ThGPX8转化E.coli BL21(DE3)获得了融合表达蛋白。 相似文献
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【目的】构建新疆多浪羊IL-1β基因编码区的原核表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达,为进一步研究IL-1β蛋白的结构功能奠定基础。【方法】从含质粒pMD-18T-IL-1β的大肠杆菌DH5α中获取IL-1β基因,与pET-28b质粒DNA连接,构建原核表达载体pET-28b-IL-1β。先将其转化到克隆载体E.coli DH5α感受态细胞中大量拷贝,经菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定后,提取pET-28b-IL-1β质粒转化到表达载体E.coli BL21(DE3)中,再次进行菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。将阳性单克隆接种于LB液体培养基,以终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导,用SDS-PAGE电泳检测IL-1β蛋白的表达及存在形式,通过Western blotting验证表达产物是否为目的蛋白。【结果】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,该载体经诱导后表达出融合蛋白,分子质量为32.4ku,主要以包涵体的形式表达;经Western blotting检测,带有6×His标签的融合蛋白有很好的反应原性。【结论】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,其在大肠杆菌BL21(DE3)中经诱导后表达出分子质量约为32.4ku的IL-1β融合蛋白。 相似文献
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【目的】克隆猪胸腺活化调节趋化因子CCL17基因,研究其在原核及真核系统中的表达。【方法】提取仔猪脾脏组织总RNA,利用RT-PCR技术扩增CCL17,并将其与已知序列的CCL17进行同源性比较;CCL17基因经测序验证后,将其分别克隆入表达载体pET-32a和pEGFP-C1,构建该基因的重组原核表达载体pET-CCL17和真核表达载体pEGFP-CCL17,分别进行双酶切和测序鉴定;前者在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,后者以脂质体介导法转染至猪血管内皮细胞(SUVECs),通过绿色荧光标记和Western blot检测细胞中CCL17基因的表达水平。【结果】PCR扩增得到CCL17309bp的DNA片段;重组表达质粒pET-CCL17和pEGFP-CCL17经双酶切鉴定和测序分析证明,载体构建成功。pET-CCL17经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析表明,目的蛋白在宿主大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达CCL17融合蛋白,分子质量约32ku,与其理论分子质量基本相符;pEGFP-CCL17转染SUVECs,经Westernblot检测,证实导入的CCL17基因得到了表达。【结论】克隆了猪的CCL17基因,利用大肠杆菌成功表达了CCL17重组蛋白,真核重组质粒在SUVECs中也得到了表达。 相似文献
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【目的】构建重组兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)VPg(Viral Protein Ge-nome-Linked,VPg)蛋白基因的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达和纯化VPg蛋白,制备多克隆抗体,并检测抗体的基本特性。【方法】用PCR方法扩增RHDVVPg基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导,使之重组表达VPg蛋白,并用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。PCR扩增获得了345bp的VPg基因,用纯化的重组VPg蛋白免疫试验兔,制备抗VPg的多克隆抗体,用Western blot检测其特异性。【结果】构建了pET-30a/VPg原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株后,成功表达了VPg蛋白。用该蛋白免疫试验兔后,制备的多克隆抗体能与VPg蛋白特异性反应。【结论】成功表达了RHDV VPg蛋白,并制备了特异性良好的多克隆抗体。 相似文献
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【目的】克隆青稞核糖体蛋白基因HbRPL19,分析其序列特征并在大肠杆菌中诱导目的蛋白,为后续的研究奠定基础。【方法】根据鉴定得到的青稞HbRPL19的序列设计了引物,从青稞叶片的c DNA中扩增得到目的片段,并对目的基因序列进行了测序鉴定和序列分析,同时构建了原核表达载体p ET28a-RPL19,转化入大肠杆菌BL21(DE3)后利用IPTG诱导外源蛋白质表达并检测。【结果】成功扩增出了青稞核糖体蛋白基因HbRPL19的CDS全长序列,大小为654 bp。根据生物信息学分析的结果,HbRPL19编码的蛋白质含有217个氨基酸,相对分子质量为24.47 KD,理论等电点(p I)为10.42,总平均亲水性(GRAVY)为-0.353,不稳定系数为53.46,存在典型的SH3-like结构域和核糖体蛋白L19结构域。系统进化分析表明,HbRPL19与小麦和山羊草的RPL19具有较近的亲缘关系。蛋白表达结果显示,重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。【结论】获得了青稞抗寒相关基因HbRPL19的序列和蛋白。 相似文献
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目的:构建人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,tPA)原核表达载体,检测其在大肠杆菌Escherichia coli中的初步表达.方法:以含有人tPA基因的质粒为模板,设计引物扩增出含有RGDS-tPA基因并构建到原核表达载体pET28a中,测序证实为正确的rtPA序列,并将pET28a-tPA转化至菌株E.coli BL21(DE3).用IPTG诱导rtPA在E.coli中表达,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行验证.结果:琼脂糖凝胶电泳获得目的基因片段tPA的条带约在1 700bp处,鉴定为阳性重组体;聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定获得目的蛋白片段rtPA的条带约53KDa,为非活性的包涵体.结论:人组织型纤溶酶原激活剂原核表达载体构建成功,可在大肠杆菌中有效表达. 相似文献
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【目的】阐明蜡样芽孢杆菌NJSZ-13中杀线蛋白酶ATP-α与ClpX的杀线分子机制,构建杀线蛋白酶ATP-α与ClpX的原核表达载体。【方法】克隆杀线蛋白酶编码基因atpA与clpX,利用基因工程手段对杀线蛋白酶编码基因进行PCR扩增,并与载体pET-21b连接构建重组载体,提取重组质粒转入蛋白表达载体大肠杆菌BL21(DE3)。利用菌落PCR和测序验证转化效果。加入IPTG诱导蛋白表达,使用Ni-NTA柱进行重组蛋白的纯化,利用SDS-PAGE与Western blot验证ATP-α与ClpX纯化效果并进行杀线活性测定。【结果】菌落PCR验证和测序表明,重组载体中含有蛋白酶编码基因atpA与clpX,且基因序列与参考序列一致,证明目的基因已经成功插入BL21(DE3)表达载体中。SDSPAGE与Western blot验证表明,重组蛋白得到正确诱导与纯化,成功构建杀线蛋白酶ATP-α与ClpX的原核表达载体。杀线活性测定结果表明ATP-α与ClpX均具有较强的杀线效果。ATP-α在72 h达到66.75%的杀线率,ClpX在72 h达到75.46%的杀线率。同时,两个蛋白酶共同作用... 相似文献
10.
对东方粘虫[Mythimna separata(Walker)]中肠V-ATPase a亚基(MS-VATPa)cDNA全长序列进行克隆、原核表达及纯化研究。采用RT-PCR和RACE技术克隆MS-VATPa基因,再亚克隆于原核表达载体pET-22b(+)以构建重组载体pET22b-MS-VATPa,将鉴定正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,采用Ni-NTA柱亲和层析法纯化目标蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot验证。结果表明:成功克隆东方粘虫中肠MS-VATPa基因的cDNA全长序列,并实现MS-VATPa基因在大肠杆菌原核表达系统中的可溶性表达。 相似文献