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1.
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的表达和重组蛋白的纯化及免疫学活性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]在基因工程菌中实现猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF7基因的高效表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并探讨其免疫学活性及应用价值。[方法]将已构建好的重组表达载体pET-ORF7转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG在最适条件下诱导表达,其表达产物用SDS-PAGE和Western Blot进行检测。应用Ni-NTAHis.Bind Resin层析柱在变性条件下纯化表达产物,通过梯度透析进行复性。采用Western Blot及间接ELISA法检测复性后重组蛋白的免疫学活性。[结果]重组质粒pET-ORF7在大肠杆菌中以融合形式成功表达,融合表达产物主要以包涵体形式存在。SDS-PAGE检测所表达的重组蛋白分子量为33 kD左右,与预期大小相符。Band-scan软件对表达蛋白分析发现,表达产物约占菌体蛋白的50%。Western Blot及间接ELISA法显示复性后的重组蛋白与PRRSV阳性血清有特异性结合反应,表明其具有良好的免疫学活性。[结论]该试验将为进一步研制PRRSV单克隆抗体及诊断试剂盒奠定基础。 相似文献
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为获得具有活性的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白1α(nsp1α),以BJ-4PRRSV nsp1α真核表达质粒pc DNA3.1-nsp1α为模板扩增nsp1α,克隆到原核表达载体p ET-28a,1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)。SDS–PAGE结果显示,nsp1α以包涵体形式高效表达,重组蛋白大小约为20 ku;Western blot结果显示,表达的重组蛋白能与小鼠抗His标签单克隆抗体反应;包涵体蛋白复性后,ELISA方法检测结果显示,重组蛋白能与1∶6 400稀释的PRRSV阳性血清反应。表明成功表达了nsp1α蛋白,且表达的重组蛋白具有较好的免疫学活性。 相似文献
3.
为获得非洲马瘟病毒VP7蛋白,以用于制备AHS血清学诊断试剂并为AHS新型疫苗的构建奠定基础,笔者采用原核表达系统表达VP7蛋白。在GeneBank中查找非洲马瘟病毒VP7基因序列,人工合成VP7基因,将VP7基因片段克隆插入pBAD/Thio-TOPO表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌TOP10。经测序鉴定,筛选获得VP7基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,经L-Arabinose诱导表达VP7融合蛋白抗原。SDS-PAGE分析表明以终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖进行诱导,4h后表达可达到高峰,融合蛋白质量约54.72kDa。Westernblotting检测和间接ELISA表明诱导表达的融合蛋白能与非洲马瘟病毒VP7单克隆抗体发生特异性反应,说明蛋白有特异的免疫学活性。 相似文献
4.
以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳蛋白(rN蛋白)为抗原,初步建立了检测PRRSV抗体的rN-ELISA方法。根据GenBank公布的PRRSV VR2332株编码核衣壳蛋白的ORF7基因序列设计合成了一对引物,成功扩增出ORF7基因。将其克隆到PET-30a构成原核表达载体,转化宿主菌BL21(DE3)并获得表达。通过SDS-PAGE和Western blot检测证实rN蛋白获得了高效表达,且具有良好的免疫学活性。以纯化的重组蛋白为抗原建立检测PRRSV抗体的间接ELISA法。试验证明,该方法与IDEXX公司生产的PRRSV抗体检测ELISA试剂盒对同批临床血清样本的检测结果完全相符,且对其他常见的6种猪疫病阳性血清检测均为阴性,无交叉反应。本研究建立的rN-ELISA方法敏感性高、特异性强,可用于猪繁殖与呼吸综合征常规诊断及流行病学的调查研究。 相似文献
5.
利用可溶性重组PCV2-Cap蛋白肽段为抗原,建立PCV2血清抗体间接ELISA诊断方法(rhcap-ELISA)。将PCV2cap基因中含主要表位的片段克隆到表达载体pGEX-6p-1上,转化E.coli,降低诱导温度至18℃诱导,获得大小为34 ku的可溶性融合蛋白。Western blotting试验证实该融合蛋白具有很强的免疫学活性,通过亲和层析柱对可溶性蛋白进行纯化。用融合表达的可溶性蛋白肽段作为抗原,建立猪圆环病毒(PCV2)血清抗体间接ELISA诊断方法。该方法的交叉反应结果表明,重组抗原与PRRSV、CSF、PPV和PRV阳性血清之间不存在交叉反应;用rhcap-ELISA和商品化的同类试剂盒(PCV2-Ab-Kit)检测137送检血清样品,2种试剂盒的阳性检测率分别为79.56%和83.21%。因此,rhcap-ELISA猪圆环病毒抗体检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性,适合于在大规模的PCV2血清抗体的检测工作中使用。 相似文献
6.
以真核质粒pcDNA3.1-flag-nsp1α为模板,利用PCR扩增出nsp1α基因片段,构建原核重组载体pET32a-nsp1α,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态,1 mmol/L IPTG在37℃诱导表达6 h,成功获得以包涵体形式存在的重组蛋白,能够与小鼠抗His标签单克隆抗体反应;包涵体复性后作为抗原免疫新西兰大白兔,3次免疫后20 d获得兔多抗血清。通过间接ELISA、Western blot、间接免疫荧光、免疫组化等试验获得了高效价的兔多抗血清,该血清能够特异性地识别真核质粒表达的nsp1α以及PRRSV BJ4株。该试验成功表达了pET32a-nsp1α重组蛋白,并制备了高效价、高特异性的兔抗nsp1α多克隆抗体。 相似文献
7.
编码SARS冠状病毒S蛋白(Spike protein)的C端序列S2较为保守,可作为SARS病毒疫苗研究的候选抗原基因.该研究拟构建基于SARS病毒S2蛋白的重组腺病毒疫苗并对其进行免疫学初步分析.首先通过非对称PCR方法,将人工合成的S2蛋白基因的两个片段f3和f4进行拼接得到完整的S2片段,利用Ad5腺病毒系统构建S2蛋白基因的重组腺病毒并在AD293细胞中包装成病毒颗粒,采用间接免疫荧光和蛋白免疫印迹法对S2蛋白基因的表达进行鉴定,然后用此重组腺病毒免疫小鼠对其抗体生长情况进行分析.免疫荧光和蛋白印迹分析结果显示,携带SARS病毒S2蛋白基因的重组腺病毒rAd-S2能在细胞中成功表达,表达的S2蛋白能被马抗SARS血清所识别.ELISA分析结果表明,用表达SARS病毒S2蛋白的重组腺病毒rAd-S2免疫小鼠,能有效刺激小鼠机体产生抗体,重组腺病毒免疫小鼠后所产生的抗体水平最高能达到104以上.可见通过对SARS病毒S2蛋白基因重组腺病毒的成功构建与免疫学初步分析,能为SARS疫苗研究奠定基础. 相似文献
8.
为了制备新城疫病毒(NDV)HN蛋白并研究其免疫原性,将优化的HN基因胞外区插入毕赤酵母表达载体pPICZαA中,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-HN,并将其电转入毕赤酵母X-33感受态中,经PCR鉴定得到阳性转化子,甲醇诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blot鉴定筛选出目的蛋白表达菌株;通过对诱导剂含量、诱导时间、培养基初始pH值和诱导温度进行优化,研究最佳表达条件;采用镍柱亲和层析对目的蛋白进行纯化,并用SDS-PAGE、Western blot和间接ELISA对目的蛋白进行鉴定;利用去糖基化酶PNGase F对目的蛋白进行处理,验证其糖基化修饰程度。结果显示,HN重组蛋白在毕赤酵母中成功表达,且在28℃条件下,培养基初始pH值为7.0,用0.5%甲醇诱导5 d,蛋白质表达量最高;通过镍柱亲和层析可获得纯度高于90%的重组蛋白;间接ELISA结果表明,重组蛋白活性良好;去糖基化试验验证了重组蛋白存在糖基化修饰。综上,利用毕赤酵母X-33成功表达了HN蛋白,且纯化产物纯度较高、活性良好,具有糖基化修饰。 相似文献
9.
为了建立一种鸡传染性支气管炎抗体检测的ELISA方法,本研究根据GenBank中的传染性支气管炎病毒(IBV)山东分离株LC2的N基因序列,设计一对引物,扩增N基因,将目的基因与载体pET-32a(+)连接,构建重组表达质粒pET-32a-N,转化E. coli BL21(DE3),诱导表达融合蛋白pET-32a-N,纯化目的蛋白,以纯化的重组蛋白为抗原建立鸡传染性支气管炎抗体检测的间接ELISA方法,并利用所建立的ELISA方法对临床血清样本进行检测。结果表明,IBV N基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达。Western-blot检测表明,表达的重组蛋白能与鸡传染性支气管炎阳性血清发生特异性反应。确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为2 μg·孔-1,血清最佳稀释度为1:200,临界值为D450值≥0.297,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。该方法与进口IDEXX试剂盒的符合率为96.25%,初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸡传染性支气管炎母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测。综上所述,本研究所建立的N-ELISA方法是一种有效的鸡传染性支气管炎病血清学诊断的方法,并为进一步研究IBV N蛋白的免疫原性和抗感染保护作用奠定了基础。 相似文献
10.
《福建农业学报》2015,(11)
对禽坦布苏病毒非结构蛋白NS1基因进行原核表达,并进行生物学活性鉴定。将表达成功具有生物学活性的重组蛋白经纯化后,作为抗原包被ELISA平板,通过条件优化,建立检测禽坦布苏病毒血清学检测方法。结果表明,表达的NS1重组蛋白大小约为60kd,该蛋白经Western blot检测具有良好的生物学活性。将该重组蛋白纯化后包被ELISA板建立检测禽坦布苏病毒血清学间接ELISA方法,该方法优化后的参数为2.5μg·mL~(-1)包被ELISA板;一抗(鸭血清)血清稀释度为1∶100;酶标二抗为1∶3 000。本研究建立的方法特异性强,批内和批间重复性较好。用建立的间接ELISA方法对坦布苏病毒灭活苗免疫鸭血清和自然感染鸭血清进行检测,结果表明,本研究建立的NS1-ELISA不能用于区分禽坦布苏自然感染和疫苗免疫血清的鉴别诊断。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的表达和重组蛋白的纯化及免疫学活性分析 总被引：9，自引：1，他引：8
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为不分节段、聚腺苷酸化、有囊膜的单股正链RNA病毒。其基因组长约15kb,含有8个开放的阅读框架（ORFs）。PRRSV基因组的顺序依次为：5’-ORFla-ORFlb-ORF（2—6）．ORFT-3’。鲁韦韦等分析表明,PRRSV的ORF7基因保守性较好,变异较小。此外,ORF7编码的核衣壳蛋白（N蛋白）具有良好的免疫原性及反应原性,机体产生的PRRSV抗体主要是针对N蛋白的。因此,N蛋白常可作为诊断抗原来检测PRRSV。 相似文献
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依据猪伪狂犬病毒g B和g C蛋白的B细胞表位编码序列,分别设计g B和g C蛋白B细胞表位编码序列的融合扩增引物,利用融合PCR技术,将g B和g C蛋白B细胞表位编码序列有机地融合为g B-C表位编码序列。将融合基因片段插入到原核表达载体p ET28a,并转化大肠杆菌BL21(DE3),1.0 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白g B-C能够高效表达,重组蛋白的分子质量约为38 ku;经Western blot鉴定分析,小鼠抗His标签单克隆抗体和PRV阳性血清均能识别表达的重组蛋白。表明成功表达了融合蛋白g B-C,且表达的重组蛋白具有较好的免疫学活性。 相似文献
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[目的]获得重组表达质粒pGEX-6P-N在大肠杆菌BL21中高效表达,分析表达蛋白的免疫学活性及纯化后蛋白的浓度.[方法]通过优化诱导剂终浓度和诱导时间来实现融合蛋白的高效表达,使用BCA法测定蛋白浓度,利用Western blotting分析融合蛋白的免疫学活性.[结果]融合蛋白在37℃条件下,经终浓度为1.2 mmol/L的IPPG诱导表达4.5 h后获得了较高的表达水平.纯化后的融合蛋白经BCA法测定蛋白浓度达到0.587 mg/mL.Western blotting试验表明,GST-N蛋白能与抗PRRSV阳性血清发生特异性反应.[结论]为建立N特异性抗体的间接ELISA检测方法及PRRS诊断试剂盒的研制奠定了基础,为新疆PRRS的防控提供了理论支持. 相似文献
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PRRSV GP5基因含有一段信号肽及3个跨膜功能区,这些区域可以使翻译的GP5停留在内质网,从而抑制其表达.根据实验室分离测定的PRRSV T1株GP5基因序列进行优化设计,通过人工合成获得GP5-ShortDNA并构建表达载体pGEX-GP5,将其转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达获得约41kD的目的融合蛋白.通过Western-blot检测,结果显示该融合蛋白可与PRRSV阳性血清发生特异性反应,表明该蛋白具有免疫学活性.研究结果为PRRSV基因工程苗的研究奠定了基础,同时也为基因的优化提供了借鉴. 相似文献
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鸭β-防御素9基因的克隆、组织分布及其原核表达 总被引：4，自引：2，他引：2
【目的】从鸭组织中克隆鸭β-防御素9（AvBD9）基因,在原核表达重组鸭AvBD9蛋白;研究重组鸭AvBD9蛋白的体外抗菌活性与理化特性。【方法】采用RT-PCR法,从鸭肝脏组织中扩增鸭AvBD9基因,测定该基因在鸭各组织器官中的分布;将鸭AvBD9基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒pGEX-duck AvBD9,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达;亲和层析纯化蛋白,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定重组鸭AvBD9蛋白的体外抗菌活性与理化特性。【结果】从鸭肝脏组织中克隆得到鸭AvBD9基因,序列分析表明该基因大小为204 bp,前体肽包括67个氨基酸残基。AvBD9基因在鸭体内广泛分布。SDS-PAGE电泳表明鸭AvBD9基因在大肠杆菌中高效表达,表达的重组鸭AvBD9融合蛋白以包涵体的形式存在,分子量约31 kD。重组鸭AvBD9蛋白对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌有抗菌活性,在-70～100℃或pH 3～10处理30 min后仍有抗多杀性巴氏杆菌作用。【结论】鸭AvBD9基因为204 bp,编码67个氨基酸残基,在鸭组织中广泛分布。重组鸭AvBD9蛋白基因在大肠杆菌中高效表达,该重组蛋白具有广谱的抗菌活性,对温度和酸碱性有较高的稳定性。 相似文献
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Zhi-bang ZHANG Lei XU Xue-xia WEN Jian-guo DONG Lei ZHOU Xin-na GE Han-chun YANG Xin GUO 《农业科学学报》2018,17(5):1171-1180
The nonstructural protein 10 (nsp10) of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) encodes for helicase which plays a vital role in viral replication. In the present study, a truncated form of nsp10, termed nsp10a, was found in PRRSV-infected cells and the production of nsp10a was strain-specific. Mass spectrometric analysis and deletion mutagenesis indicated that nsp10a may be short of about 70 amino acids in the N terminus of nsp10. Further studies by rescuing recombinant viruses showed that the Glu-69 in nsp10 was the key amino acid for nsp10a production. Finally, we demonstrated that nsp10a exerted little influence on the growth kinetics of PRRSV in vitro. 相似文献
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【目的】对家蚕浓核病毒镇江株非结构蛋白2（NS2）基因进行克隆、表达,并测定表达产物的生物活性。【方法】利用PCR技术从家蚕浓核病毒镇江株（BmDNV-Z）基因组中扩增得到非结构蛋白2(NS2)基因片段,将其克隆到表达载体pET28a得到重组表达质粒pET28a-NS2,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,SDS-PAGE和Western blot检测,表达产物经Ni柱纯化,经过复性检测其Helicase和ATPase活性。【结果】克隆获得了BmDNV-Z NS2基因,并在大肠杆菌中得到了成功表达,表达产物经Ni柱纯化获得了目的蛋白NS2。纯化的NS2蛋白具有Helicase活性,能将双链DNA底物解旋成为单链,并且具有一定的底物极性选择性,对于极性底物表现出更高的解旋活性。同时,纯化的NS2蛋白具有ATPase活性,其酶活力可达到0.276 μmol?μg-1?h-1。【结论】BmDNV-Z NS2基因编码的病毒非结构蛋白具有Helicase和ATPase活性,并且Helicase活性具有一定的底物极性选择性,推测该基因在病毒DNA的复制过程中发挥重要作用。 相似文献
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【目的】克隆及真核表达猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus ,TGEV）陕西分离株的3a和3b基因,研究表达蛋白在细胞中的分布及其对细胞周期的影响。【方法】利用软件Primer 5.0参照Genbank公布的序列设计两对分别针对TGEV非结构蛋白基因3a和3b的特异性引物。采用RT-PCR方法从TGEV 陕西分离株克隆3a和3b基因,再将其与真核表达载体pEGFP-N1连接,构建真核表达质粒p3a-EGFP-N1和p3b-EGFP-N1。利用脂质体转染法将重组质粒转染猪小肠黏膜上皮细胞（intestinal epithelial cells,IEC）,采用激光共聚焦显微镜检测转染细胞内融合蛋白的表达分布情况。通过RT-PCR检测细胞中目的基因的转录情况,Western blotting检测细胞中融合蛋白的表达情况。利用流式细胞仪检测表达蛋白对细胞周期的影响,采用实时荧光定量PCR检测融合蛋白的表达对内质网应激蛋白标志性分子GRP78和细胞周期蛋白Cyclin A的表达的影响,通过Western blotting试验检测细胞中蛋白表达后GRP78、Cyclin A和Cyclin B1表达量的变化情况。【结果】成功克隆出完整的TGEV陕西分离株的3a及3b基因,经过测序鉴定,3a基因的大小为213bp,3b基因的大小为732bp;经过与不同来源的TGEV毒株进行对比分析,3a基因的核苷酸序列与其他毒株同源性为97.4%-100%,氨基酸同源性为98.6%-100%;3b基因的核苷酸序列与其他毒株同源性为98.3%-99.9%,氨基酸同源性为100%。重组表达载体转染IEC细胞后,经Western blotting分析IEC分别表达出分子质量约为35kD的3a-GFP和54kD的3b-GFP的融合蛋白,与预期结果相一致。激光共聚焦显微镜观察到融合蛋白3a-GFP和3b-GFP在IEC细胞的细胞核和细胞质中均有表达,流式细胞仪分析TGEV非结构蛋白3b的表达能够使G2/M期的细胞增多,实时荧光定量PCR分析显示细胞周期蛋白Cyclin A的mRNA水平高于对照组细胞（IEC和IEC-GFP）,同时Western blotting分析结果显示表达3b蛋白的细胞中Cyclin A 蛋白水平表达量高于对照组,并且Cyclin B1的表达量低于对照组细胞,差异显著;TGEV非结构蛋白3a对细胞周期没有影响。实时荧光定量PCR分析结果显示,表达TGEV非结构蛋白3a的细胞中GRP78的mRNA水平高于对照组, Western blotting分析GRP78的蛋白水平高于对照组,差异显著,说明非结构蛋白3a可以使GRP78表达水平的上调;TGEV非结构蛋白3b对GRP78的表达没有影响。【结论】TGEV陕西株的非结构蛋白3a和3b在IEC细胞中成功表达,3a蛋白可以引起细胞内质网应激反应,3b蛋白通过使细胞周期蛋白Cyclin A表达上调并且使Cyclin B1表达下调引起细胞周期阻滞于G2/M期。 相似文献
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根据MagaininⅡ氨基酸序列,选用大肠杆菌偏爱密码子,化学合成了2个DNA片段,利用重叠区互补PCR法得到MagaininⅡ的基因序列.构建了融合表达载体pET21 b-MagaininⅡ,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,在5.1 kD处可见目的蛋白条带,... 相似文献