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1.
本研究克隆了来源于马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)外壳蛋白(CP)基因(PVYNCP)5′端和3′端的反向重复cDNA序列,并构建了植物表达载体pROKII-5′IR和pROKII-3′IR,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草NC89,分别获得166和126株转基因烟草。抗病性试验表明,转化PVYNCP基因3′端茎50 bp(环50 bp)hp RNA(hairpin RNA)的烟草抗病率达69%,而转化PVYNCP基因5′端相同片段长度的hpRNA的烟草却全部发病。Southern blot结果表明,转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性;Northern blot结果表明,目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,证明所获得的抗病性是RNA介导的抗病性。研究结果证明PVYNCP基因的3′端比5′端更能有效地诱发基因沉默,并且hpRNA茎部的长度可减少到50 bp。该结果为探索利用CP基因的最短长度和有效部位的基因片段来培育多抗病毒转基因植物提供了依据。 相似文献
2.
hpRNA的茎环比例对RNA介导的病毒抗性产生的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
以马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因3'端50bp片段为hpRNA的茎,以pUC19不同长度的序列为hpRNA的环,构建了茎环比例分别为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4和1:8的植物表达载体。利用农杆菌介导法转化烟草品种NC89,获得了多种转基因植株。室内抗病性检测发现:不同茎环比例的hpRNA介导的病毒抗性效率不同;茎环比例为4:1、2:1和1:1时效率较高,抗性植株的比例达60%左右;随着环长度的逐渐增加,抗性植株的比例逐渐降低;当茎环比例为1:8时,抗性植株的比例仅为9.52%。Southern blot分析结果表明:外源基因已整合于烟草的基因组中,且转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性。Northern blot分析结果表明:目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,证明所获得的抗病性是RNA介导的。 相似文献
3.
本研究以转不可翻译的马铃薯Y病毒坏死株系外壳蛋白基因(PVYN CP)烟草的T3代植株为材料,在获得高度抗病植株并证明转基因植株的抗病性是由RNA沉默介导的基础上,采用Northern杂交及ELISA检测病毒的方法,分析了温度对转基因烟草中RNA沉默以及转基因植株抗病水平的影响。结果表明,低温可以改变转基因植株中已发生的RNA沉默和转基因植株的抗病状态。在15℃低温下生长的转基因植株,转基因产生的RNA沉默被抑制,转基因植株失去了对PVYN高度抗病的特性,表现感病症状;而在25℃或以上高温(30℃、35℃)下生长的转基因植株,转基因产生的RNA沉默没有发生被抑制的现象,转基因植株对PVYN病毒的侵染仍保持高度抗病性。 相似文献
4.
马铃薯Y病毒HC-Pro、CI、NIb和CP基因介导的病毒抗性比较研究 总被引：2，自引：0，他引：2
根据已克隆的马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)的基因组序列设计引物,利用PCR扩增HC-Pro、CI、NIb和CP4个基因的3'端400bp cDNA区段,分别反向插入含有査尔酮合成酶基因(Chalcone synthase,CHS)内含子的双元载体pRCHS中,构建了含内含子的发夹结构RNA (intron splicing hpRNA,ihpRNA)表达载体pRCHS-HC-Pro、pRCHS-CI、pRCHS-NIb和pRCHS-CP。利用农杆菌介导法转化烟草品种NC89,获得了多种转基因植株。病毒抗性检测的结果显示:转pRCHS-HC-Pro、pRCHS-CI、pRCHS-NIb和pRCHS-CP的烟草中,抗性植株的比例分别为55.34%、73.69%、61.54%和84.21%。大分子RNA和siRNA的Northern blot分析表明,目的片段转录产物的积累量与转基因植株的抗病性呈负相关,转基因植株中可检测到siRNA,说明所获得的抗病性是RNA沉默介导的。 相似文献
5.
利用RNA介导的抗病性获得高度抗马铃薯Y病毒的转基因烟草 总被引：29，自引：8，他引：21
以马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)的RNA为模板,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,扩增出长度为801 bp的非翻译的马铃薯Y病毒外壳蛋白基因。将扩增的片段克隆到pBSK的BamHI和KpnI之间并进行了序列测定。用BamHI和KpnI从重组克隆载体上切下该基因并插入到质粒pROKII内得到植物表达载体pPVYCP。通过根癌农杆菌(LBA4404)介导的方法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选、PCR和Southern blot检测,获得82株转基因植株。Northern blot和Western blot分析表明,转基因植株只在RNA水平上得到了表达。抗病性试验表明转基因植株之间抗性水平存在着差异,其中有7株是对PVYN高度抗病性的植株。转基因植株抗病特异性试验初步表明,对PVYN表现高度抗病的植株对PVYO也具有高度抗病性。 相似文献
6.
正向和反向重复RNA介导的抗马铃薯Y病毒基因工程比较研究 总被引：20，自引：2，他引：20
RNA介导的病毒抗性与RNA沉默现象密切相关。反向重复cDNA序列(IR)的转录产物往往形成双链RNA结构,而双链RNA是诱发RNA沉默的有效因子。据此,本研究通过体外合成马铃薯Y病毒坏死株系衣壳蛋白基因(PVYN-CP)5'端反向重复cDNA序列和正向重复cDNA序列(DR),分别构建植物表达载体pROK-IR和pROK-DR,利用农杆菌介导方法转化烟草NC89,比较这2种转基因烟草在RNA介导抗病性方面的差异。抗病性检测表明,转化IR和DR的转基因烟草均可获得抗病程度达到免疫的植株,但转化IR序列可大大提高抗病植株在转基因植株中的比例。分析结果表明所获得的抗病性为RNA介导的抗病性,是RNA沉默的结果。这一研究结果为利用IR策略进行抗病毒遗传育种提供了理论依据,并为讲一步开展RNA介导抗病性的机制研究奠宗了基础。 相似文献
7.
利用Fny-CMV株系RNA3全长cDNA克隆.构建了MP基因全长的、缺失AUG、5'端缺失(111nt)、3'端缺失(124nt)及内部缺失KpnI片段(501nt)5种不同形式的植物表达载体pBMPR、pBMPA、pBMPS、pBMPH和pBMPK。上述植物表达载体在土壤农杆菌LBA4404介导下转化烟草生产品种NC89,获得了所有5种表达载体的转基因植株,并对其分别进行了分子检测和抗病性分析。 相似文献
8.
利用RNA干扰介导抗病性获得兼抗四种病毒的转基因马铃薯 总被引：1，自引：1，他引：0
为获得兼抗马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)和马铃薯潜隐花叶病毒(Potato virus S,PVS)4种病毒的转基因马铃薯新材料,分别以这4种病毒全长CP基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得4种病毒CP基因相对保守区段的基因片段,并将其拼接成融合基因,以载体pHANNIBAL和pBI121为基础,构建RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体,利用农杆菌介导的转基因体系进行马铃薯遗传转化,并对获得的转基因马铃薯进行病毒抗性检测。结果表明,所获得的融合基因片段RH1和RH2,酶切鉴定分别得到长度为1 200 bp的条带,与预期片段相符;构建了含pdk内含子和RH1、RH2融合基因的RNAi植物表达载体,经Bam H I/Sac I双酶切,获得长度约3 200 bp的片段,表明RNAi植物表达载体pBI121-pRH构建成功;转化易感病毒马铃薯品种陇薯11号,PCR检测和PCRSouthern杂交分析表明融合基因已整合到陇薯11号马铃薯基因组中;抗病性检测显示4株转基因马铃薯植株对4种病毒均免疫。表明利用RNAi可筛选出抗多种病毒的转基因马铃薯新种质。 相似文献
9.
抗菌肽和几丁质酶基因提高烟草对黑胫病菌和赤星病菌的抗性研究 总被引：4，自引：0，他引：4
通过农杆菌介导法将加信号肽修饰的人工合成杂合抗菌肽CEMA基因(SPCEMA),苜蓿防御素基因(AFP),苦瓜几丁质酶基因(CHI)以及SPCEMA-CHI、AFP-CHI、AFP-SPCEMA双价基因导入本明烟(Nicotiana benthamiana),并对转基因烟草T0和T1代进行了抗病性检测,比较了不同转基因植株的抗病效果。研究结果表明,转基因烟草对黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)、赤星病菌(Alternaria alternata)的抗性均强于非转基因烟草,病情指数差异达极显著水平,其中转AFP-CHI双价基因烟草具有较强的抗性,与单价转基因烟草的抗性差异达显著水平。但各单价转基因以及双价转基因烟草之间对上述病菌并未表现出显著的抗病性差异。结果表明植物源的抗菌肽基因与几丁质酶基因在抗植物真菌病害中具有协同增效作用。 相似文献
10.
烟草蚀纹病毒山东分离物全基因组序列的克隆和保守性分析 总被引：1，自引：1，他引：0
为利用RNA介导的病毒抗性策略,培育抗性稳定或抗多烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus,TEV）株系的转基因植株,采用RT-PCR及5＇-RACE方法克隆了烟草蚀纹病毒山东分离物TEV-SD1的全基因组序列。TEV-SD1全基因组核苷酸序列长度为9494 bp,包含1个9165 bp的开放阅读框架（open reading frame,ORF）,编码3054个氨基酸。将TEV-SD1基因组序列与GenBank中已公布的4个TEV全基因组序列和11个外壳蛋白（coat protein,CP）基因序列比对分析发现,各分离物CP基因间的核苷酸和氨基酸序列平均相似性分别为96.65%和98.31%,高于其它功能基因间的相似性;各分离物CP基因3＇端核苷酸序列相似性平均为96.55%,高于5＇端序列。聚类分析发现TEV在自然界中的分子变异与其寄主关系密切。 相似文献
11.
核基质结合区对马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因介导抗病性的影响 总被引：3，自引：0，他引：3
为探索核基质结合区(matrix attachment regions,MARs)对RNA介导的病毒抗性的影响,我们将从烟草中克隆到的核基质结合区TM2构建在包含马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因的植物表达载体pRPVYCPN的表达盒的两侧,构建了植物表达载体pRTM2CPNTM2。采用农杆菌介导基因转化法,将表达载体pRPVYCPN和pRTM2CPNTM2转入烟草品种NC89中,分别获得了144株和344株转基因烟草。抗病性检测发现,核基质结合区的存在能明显提高RNA介导抗性的产生效率。在含MARs转基因植株中,抗病植株的比率为15.1%,而不含核基质结合区的转基因植株的抗病比率则为8.3%。这一研究结果对抗病毒植物的分子育种和转基因表达调控有指导意义。 相似文献
12.
转二价核酶基因马铃薯及抗病性研究 总被引：2，自引：0，他引：2
用克隆的特异性切割马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)复制酶基因负链RNA的二价核酶基因,构建植物表达载体pROKⅡ/DR,经土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导叶盘法转化马铃薯外植体,获得再生植株。PCR和Southern-blot检测,证明目的基因已成功地导入马铃薯再生植株,其转化率约为14.5%,并能够在无性繁殖后代植株中稳定存在。RT-PCR检测表明,再生马铃薯植株中的二价核酶基因可以转录表达。经病毒接种的转基因马铃薯株系L5、L7、L8和J-1的无性繁殖后代在继发感染中仍表现出较高的抗病性,为最终获得抗PLRV马铃薯新品系打下了基础。 相似文献
13.
马铃薯Y病毒复制酶基因不同位置cDNA区段介导对PVY的不同抗性 总被引：2，自引：2，他引：0
为探究靶序列位置对RNA介导的病毒抗性产生的影响,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)复制酶基因(nuclear inclusion b,NIb)不同位置的cDNA区段,反向插入双元载体pROKII中,构建了发夹RNA(hairpin RNA,hpR-NA)结构的植物表达载体。将构建的植物表达载体采用冻融法转入农杆菌LBA4404,叶盘法转化烟草NC89,获得转基因植株。攻毒试验表明:PVYNIb基因不同位置cDNA区段介导的对PVY的抗性存在显著差异;3′端1/2处和中间位置的序列可介导高水平的病毒抗性,抗性植株的比例在50%以上,而5′端、5′端1/2处和3′端的序列介导的抗性效率较低,抗性植株的比例仅为10%~30%。Northern杂交显示:抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株,抗性与RNA积累量呈负相关;抗病转基因植株中有siRNA存在,表明病毒抗性是由RNA介导的。 相似文献
14.
转隐地蛋白基因烟草的抗病性及遗传分析 总被引：3，自引：0，他引：3
对转隐地蛋白(Cryptogein)基因烟草植株进行了抗病性测定、抗病分子机理及遗传分析的研究。结果表明:80%以上的转基因植株对烟草上3种重要病原菌的抗病性均增强,且能稳定遗传;转基因烟草植株的抗病性与整合的拷贝数成负相关,即绝大多数高度抗病的植株只含有1个拷贝,而感病植株一般为2~3个拷贝;部分转基因烟草植株Northern杂交分析表明:病程相关蛋白和渗透调节蛋白等防卫反应相关基因的表达丰度与转基因植株的抗病性存在着一定的正相关性,表达丰度越高,抗病性越强;综合农艺性状考察表明Cryptogein基因对烟草植株的生长有显著的促进作用。 相似文献
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16.
ABSTRACT Transformation of plants with the nucleocapsid (N) gene of Tomato spotted wilt tospovirus (TSWV) provides resistance to disease development; however, information is lacking on the response of plants to natural inoculum in the field. Three tobacco cultivars were transformed with the N gene of a dahlia isolate of TSWV (TSWV-D), and plants were evaluated over several generations in the greenhouse. The resistant phenotype was more frequently observed in 'Burley 21' than in 'KY-14' or 'K-326', but highly resistant 'Burley 21' transgenic lines were resistant to only 44% of the heterologous TSWV isolates tested. Advanced generation (R(3) and R(4)) transgenic resistant lines of 'Burley 21' and a 'K-326' F(1) hybrid containing the N genes of two TSWV isolates were evaluated in the field near Tifton, GA, where TSWV is endemic. Disease development was monitored by symptom expression and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) analysis. Whereas incidence of TSWV infection in 'Burley 21' susceptible controls was 20% in 1996 and 62% in 1997, the mean incidence in transgenic lines was reduced to 4 and 31%, respectively. Three transgenic 'Burley 21' lines were identified that had significantly lower incidence of disease than susceptible controls over the two years of the study. In addition, the rate of disease increase at the onset of the 1997 epidemic was reduced for all the 'Burley 21' transgenic lines compared with the susceptible controls. The 'K-326' F(1) hybrid was as susceptible as the 'K-326' nontransformed control. ELISA analysis demonstrated that symptomless plants from the most resistant 'Burley 21' transgenic lines accumulated detectable nucleocapsid protein, whereas symptomless plants from more susceptible lines did not. We conclude that transgenic resistance to TSWV is effective in reducing incidence of the disease in the field, and that accumulation of transgene protein may be important in broad-spectrum resistance. 相似文献