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1.
高盐是小麦的主要非生物胁迫因子之一, 发掘小麦耐盐品种中的相关基因, 分析其调控机理, 有助于解析小麦耐盐性机制。本文利用TAIL-PCR和电子克隆的方法, 从耐盐小麦RH8706-49中克隆了耐盐基因TaSC的启动子序列, 命名为ProTaSC。该DNA序列中存在多个顺式作用元件, 包含与非生物胁迫响应有关的ABA响应元件(ABRE)和MYB蛋白结合位点(MBS)各1个。以GUS为报告基因, 对克隆的启动子序列及不同长度的5′端缺失片段的表达活性分析表明, 克隆的全长片段及2个5′端缺失的片段(681 bp和1096 bp)均能启动GUS表达, 而小于等于343 bp的片段不具备启动功能, 说明ProTaSC中从-681位到-343位核苷酸之间的区域为核心启动子区。在ProTaSC:GUS转基因拟南芥的根、叶片、花药、萼片及成熟角果的果荚壳中均检测到GUS蛋白, 而在主茎、花瓣、幼果和种子中没有检测到GUS, 表明ProTaSC是组织表达特异性启动子。对ProTaSC:GUS转基因拟南芥在NaCl (200 mmol L-1)和ABA (10 μmol L-1)胁迫处理后的GUS定量分析表明, ProTaSC是受NaCl和ABA显著诱导表达的功能序列。 相似文献
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大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14受低磷诱导表达,其超表达显著提高植物有机磷利用效率,为进一步探究其调控机制,本研究以GmPAP14cDNA序列检索大豆参考基因组,获取基因上游启动子序列,设计引物克隆了中黄15 GmPAP14启动子序列。利用PLACE与PlantCARE预测启动子调控元件发现,该序列中含有增强子调控元件、组织特异表达元件,根特异表达元件、转录因子PHR1结合的PIBS元件等。构建了GmPAP14启动子3个5’端缺失片段融合GUS的植物表达载体PGmPAP14-2568-GUS、PGmPAP14-2238-GUS、PGmPAP14-1635-GUS,并通过Floraldip法获得转基因拟南芥。利用GUS染色和活性测定分析GmPAP14启动子不同片段表达活性发现,正常磷条件下各片段转基因拟南芥均在根尖表达,低磷条件下GUS染色可扩展到成熟区和根毛,另外转PGmPAP14-2238-GUS植株的GUS活性最高。这些结果为后续的基因调控研究奠定重要基础。 相似文献
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拟南芥RBCS-1A基因受光调节表达模式及其启动子遗传转化应用评价 总被引：2，自引：0，他引：2
RBCS编码光合碳同化关键酶核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的小亚基, 是控制植物光合作用的重要基因之一。本研究利用实时荧光定量PCR技术分析拟南芥RBCS-1A受光调节表达模式, 结果表明, AtRBCS-1A表达受光诱导, 同时具有组织表达特异性; 运用生物信息学手段分析发现, 该基因启动子序列中存在多个参与光应答的顺式作用元件; 采用PCR技术从拟南芥基因组中分离到长度为1 691 bp的AtRBCS-1A启动子片段, 将该片段与GUS报告基因融合构建植物表达载体并转化野生型拟南芥, 对获得的转基因植株进行GUS染色, 结果显示, AtRBCS-1A启动子是光诱导型和组织特异型启动子。以上结果初步证明, AtRBCS-1A启动子应用于植物遗传转化切实可行, 具有重要应用价值。 相似文献
4.
桑树1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因(MnACO)启动子功能分析 总被引：1，自引：0，他引：1
1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)作为关键酶,能够催化1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)形成乙烯。为探究桑树MnACO基因在桑树生长发育和抵御外界胁迫中的功能,本研究构建了p MnACO::GUS的植物表达载体并转化拟南芥。采用GUS组织染色法鉴定转基因拟南芥不同生长阶段及胁迫处理后的GUS活性。通过PCR克隆得到MnACO1和MnACO2启动子片段,它们分别为1518 bp和1429 bp,启动子区域有大量的TATA-box、CAAT-box和其他响应外界刺激的顺式作用元件。GUS活性分析显示MnACO启动子能驱动GUS在拟南芥中表达;MnACO1启动子能驱动GUS在拟南芥的根、叶片、花瓣、花药、花丝、柱头以及果荚中表达,且活性较MnACO2强;MnACO2启动子不能驱动GUS在果荚中无表达。转MnACO1和MnACO2植株经不同逆境处理后GUS表达活性不同,转MnACO1植株的GUS活性随处理延长时间而减弱,转MnACO2植株GUS活性随处理时间延长而增强。q RT-PCR检测2周苗龄的桑幼苗在经过胁迫处理后Ma ACO1和Ma ACO2的基因表达量,发现Ma ACO基因的表达模式与MnACO启动子GUS活性变化趋势一致。本研究结果表明,MnACO为诱导型启动子,MnACO1兼具组成型启动子特性,MnACO2兼具组织特异型启动子特性。MnACO1在转基因植株中对胁迫响应能力更强,预示着可将其用来调控改良桑树品种抗逆性靶基因;Ma ACO2可能与果实成熟有关,可将其启动子作为果实特异性启动子对桑椹品质进行合理改良。 相似文献
5.
GmDREB3基因能提高转基因烟草和拟南芥的抗逆性。利用SiteFinding-PCR技术, 从大豆品种铁丰8号基因组中分离到大豆抗逆基因GmDREB3启动子片段, 长度1 648 bp。该片段富含A/T碱基, 还含有TATA-box、低温响应元件MYC及其他顺式元件MYB、CAAT-box等。将该启动子分区段与GUS报告基因连接构建表达载体, 利用基因枪法转化小麦愈伤组织, 并进行干旱、高盐、低温等处理, 通过组织化学染色和GUS荧光定量测定分析各区段调控元件的活性。结果表明, 在干旱和低温的诱导下, 该启动子能激活下游GUS基因的表达, 在–285 ~ –1 117区域存在与低温和干旱应答有关的重要调控元件, 在–1 464 ~ –1 648区域内存在抑制启动子活性的调控元件。由此推断, 在逆境条件下通过启动子区域正、负调控元件的共同作用, 使GmDREB3基因的表达维持在一个恰当的水平。 相似文献
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大豆抗逆基因GmDREB3启动子的克隆及调控区段分析 总被引：1，自引：0，他引：1
GmDREB3基因能提高转基因烟草和拟南芥的抗逆性。利用SiteFinding-PCR技术, 从大豆品种铁丰8号基因组中分离到大豆抗逆基因GmDREB3启动子片段, 长度1 648 bp。该片段富含A/T碱基, 还含有TATA-box、低温响应元件MYC及其他顺式元件MYB、CAAT-box等。将该启动子分区段与GUS报告基因连接构建表达载体, 利用基因枪法转化小麦愈伤组织, 并进行干旱、高盐、低温等处理, 通过组织化学染色和GUS荧光定量测定分析各区段调控元件的活性。结果表明, 在干旱和低温的诱导下, 该启动子能激活下游GUS基因的表达, 在–285 ~ –1 117区域存在与低温和干旱应答有关的重要调控元件, 在–1 464 ~ –1 648区域内存在抑制启动子活性的调控元件。由此推断, 在逆境条件下通过启动子区域正、负调控元件的共同作用, 使GmDREB3基因的表达维持在一个恰当的水平。 相似文献
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富含油酸的菜籽油具有重要的经济价值,使得高油酸育种和形成机理的研究成为热点。油酸脱氢酶基因(FAD2基因)是控制油酸含量的关键酶基因。本文针对BnFAD2-C5基因展开研究,根据油菜和甘蓝的同源性,克隆了1257 bp启动子序列,利用GUS和GFP作为报告基因分别构建含有不同片段长度的启动子和内含子的缺失载体并转化拟南芥,经GUS染色检测发现–319 ~ –1 bp为该研究中最小启动子;采用Western技术分析启动子和内含子不同区域的功能,发现BnFAD2-C5启动子区域–1257 ~ –1020 bp和–319 ~ –1 bp能够诱导报告基因在转基因拟南芥种子发育中期高效表达,BnFAD2-C5内含子具有增强启动子转录水平的功能,该功能主要由631~1033 bp区域调控。 相似文献
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花生Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因启动子的克隆及功能分析 总被引：1，自引：0，他引：1
Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶(SAD)是决定植物体内饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比值的关键酶。以花生品种豫花9326基因组DNA为模板,通过基因组步移技术,克隆到花生Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因(Ah SAD)起始密码子ATG上游720 bp片段,利用5'RACE方法获得了该基因的5'UTR序列,通过序列比对确定720 bp片段为Ah SAD启动子区域。PLACE在线启动子预测分析表明,该序列具有真核生物启动子必需的核心元件TATA-box和CAAT-box,含有多个与光诱导和激素响应相关顺式序列元件。将Ah SAD启动子片段替换pBI121质粒中的CaMV35S启动子驱动下游GUS基因表达,构建植物表达载体pBI-PAh SAD。通过农杆菌介导法转化拟南芥和在花生不同组织中瞬时表达,利用GUS组织化学染色研究其表达特性。表明在拟南芥和花生受体中,AhSAD启动子主要调控下游基因在根、茎、叶片和子叶中表达,在花生的果针中也检测到GUS活性;拟南芥的茎生叶只有叶脉中具有GUS活性,而花生整个叶片中都具有GUS活性。 相似文献
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高转录活性籽粒特异性启动子可调控目的基因在植物籽粒中特异性、高水平表达。为发掘玉米籽粒特异性启动子，以公开发表的玉米表达谱芯片数据为切入点，筛选出籽粒优势表达基因GRMZM2G006585,克隆其编码区上游约2 000 bp的DNA序列，命名为PZm2G006585。利用在线网站New PLACE和PlantCARE对其进行启动子顺式作用元件分析，发现其含有E-box、P-box等多个籽粒特异性相关元件，初步认为所克隆编码区上游序列为玉米来源的籽粒特异性启动子。为验证其功能，构建该启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的表达载体并进行植物遗传转化。转基因水稻的GUS组织化学染色结果表明，该启动子驱动外源基因表达模式为籽粒特异、胚优势表达；转基因拟南芥单拷贝株系T3种子中GUS活性检测结果显示，PZm2G006585驱动的GUS活性为909.52 nmol/(min·mg)。籽粒特异性启动子PZm2G006585的发掘和功能验证为驱动目标基因在玉米、水稻等单子叶植物籽粒中特异性表达提供了候选启动子资源。 相似文献
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糖基转移酶(glycosytransferase, GT)是催化活化的供体糖基转移到特异受体生成糖苷键的酶类, 在应答多种生物和非生物胁迫中起重要作用。本研究利用PCR技术从陆地棉品种Coker 312基因组中分离克隆了GhGalT1基因的启动子, 序列长度为539 bp, 命名为pGhGalT1。启动子分析软件PlantCARE分析表明pGhGalT1含有CAAT-box、TATA-box核心元件, 以及响应干旱、热、脱水、防御与胁迫应答的顺式作用元件MBS、HSE、MYCCONSE、TC-rich repeats和CGTCA-motif等。因此将pGhGalT1构建到启动子检测载体pBI101-GUS上, 形成pBI101-pGhGalT1-GUS融合表达载体, 以检测其启动子活性。通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥, 经卡那霉素抗性筛选及PCR检测成功获得阳性转基因植株。对T3代转基因拟南芥进行组织化学染色分析显示该启动子主要在生长5~15 d的幼苗主根及侧根根尖表达, 在子叶及莲座叶边缘也有微弱表达。非生物胁迫和激素处理后的组织化学染色、GUS酶活性及GUS基因定量分析结果显示GhGalT1基因的启动子受盐、渗透胁迫和激素(6-BA、MeJA、BL)的诱导, 该结果为合理选用启动子改良作物提供理论依据。 相似文献
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Pib基因启动子内YTCANTYY暗诱导分子元件功能的转基因验证 总被引：2，自引：0，他引：2
用不同长度5′端缺失的Pib启动子驱动gus基因的水稻转基因植株, 系统研究了Pib启动子中分子元件YTCANTYY拷贝数目与该启动子启动活性和暗诱导性的关系。GUS组织化学分析结果表明, 含6个、3个和1个拷贝该分子元件的Pib启动子的转基因水稻愈伤组织在暗处理后均能在X-Gluc溶液中显示不同深浅的GUS蓝色, 而6个分子元件全部缺失的启动子片段的转基因愈伤组织不显现GUS蓝色。荧光定量分析结果表明, Pib启动子序列具有很强的器官特异性, 即便是长仅222 bp、不含YTCANTYY元件的5′端缺失体Pib启动子-gus构建的转基因植株, 其根部Pib启动子活性仍高于地上部器官。但其启动活性和暗诱导性都随启动子缺失片段的缩短即该分子元件拷贝数增加而提高。这些结果表明, YTCANTYY在Pib启动子序列中是一个暗诱导的功能性分子元件, 它赋予了启动子的暗诱导性, 至少在6个拷贝以内, Pib启动子的暗诱导活性与其拷贝数目呈正相关, 各个YTCANTYY分子元件的暗诱导活性可能是累加的。 相似文献
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Pib基因启动子内YTCANTYY暗诱导分子元件功能的转基因验证 总被引：1，自引：0，他引：1
用不同长度5′端缺失的Pib启动子驱动gus基因的水稻转基因植株, 系统研究了Pib启动子中分子元件YTCANTYY拷贝数目与该启动子启动活性和暗诱导性的关系。GUS组织化学分析结果表明, 含6个、3个和1个拷贝该分子元件的Pib启动子的转基因水稻愈伤组织在暗处理后均能在X-Gluc溶液中显示不同深浅的GUS蓝色, 而6个分子元件全部缺失的启动子片段的转基因愈伤组织不显现GUS蓝色。荧光定量分析结果表明, Pib启动子序列具有很强的器官特异性, 即便是长仅222 bp、不含YTCANTYY元件的5′端缺失体Pib启动子-gus构建的转基因植株, 其根部Pib启动子活性仍高于地上部器官。但其启动活性和暗诱导性都随启动子缺失片段的缩短即该分子元件拷贝数增加而提高。这些结果表明, YTCANTYY在Pib启动子序列中是一个暗诱导的功能性分子元件, 它赋予了启动子的暗诱导性, 至少在6个拷贝以内, Pib启动子的暗诱导活性与其拷贝数目呈正相关, 各个YTCANTYY分子元件的暗诱导活性可能是累加的。 相似文献
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分离了金华中棉(Gossypiun arboreum var. jinhua)光诱导基因cab 5'上游的调控序列1 009 bp,并对其功能进行了分析,证明获得的这一DNA片段具有驱动光诱导表达的功能。为了进一步分离具有最大转录活性的最小光诱导启动子,根据光诱导表达调控元件所在的位置,构建了Gacab P和197 bp、504 bp、779 bp的5'端缺失体,并将这些缺失体分别与gus (uid A)基因融合,构建植物表达载体。用农杆菌介导法转化烟草,获得转基因烟草。GUS组织化学分析表明,转基因烟草的T1代种子在光下培养时,只有Gacab P驱动gus基因在转基因烟草的叶片表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达;当转基因烟草的T1代种子在暗中萌发及培养时,Gacab P驱动gus基因在转基因烟草中无表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达。GUS定量分析表明,–504 ~ –1 bp的启动子缺失体启动活性最高,比CaMV35S启动子高0.6倍。上述结果表明只有全长的Gacab启动子具有光诱导和绿色组织特异表达特性,且–504 ~ –1 bp的启动子缺失体启动活性最高。 相似文献
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逆境相关蛋白(stress associated protein, SAP)是植物中一类具有A20/AN1锌指结构域的蛋白,而A20/AN1锌指蛋白主要参与植物逆境响应。小麦中TaSAP1基因参与植株对各种逆境的响应,其5′非翻译区含有2个内含子(5' untranslated region intron, 5UI)。本研究利用重叠PCR,构建了TaSAP1的2个5UI缺失突变的表达载体,并转化二穗短柄草(Brachypodium distachyon),通过分析GUS活性,研究TaSAP1启动子及其5UI的生物学功能。结果表明TaSAP1启动子P1可受干旱、低温和外源ABA胁迫上调表达,表达活性分别是对照的10、6和4倍。TaSAP1基因2个5UI对启动子活性至关重要,2个5UI同时突变可致P1失活;Intron-1缺失突变导致P1活性降低约2.7倍(P0.05),但不影响P1对逆境胁迫的响应;Intron-2缺失突变导致P1失去对干旱、低温和外源ABA的响应能力。本研究结果为深入研究TaSAP1 5UI的生物学功能奠定了基础,也为改善作物抗逆性提供了重要元件。 相似文献
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苦荞中的黄酮类化合物具有很高的药用价值和保健功能。以苦荞川荞1号为材料,克隆出FtF3GT1基因,其CDS全长为1 401bp,编码467个氨基酸。系统发育分析表明,FtF3GT1与甜荞中的FeUF7GT蛋白亲缘关系最近。组织特异性表达分析结果表明,FtF3GT1基因在各个组织中均有表达,在根部最低,在茎部最高;MeJA处理苦荞和转pCAMBIA3301:FtF3GT1pro::GUS毛状根中发现,FtF3GT1基因的表达量以及GUS的活性明显受MeJA诱导;转过表达FtF3GT1基因毛状根中,总黄酮含量明显升高,推测FtF3GT1基因可促进黄酮类物质的合成。 相似文献
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玉米突变体vp-like8具有明显的穗发芽性状且能稳定遗传,遗传分析表明该突变性状受隐性单基因控制。用vp-like8与自交系郑58杂交构建F2遗传定位群体,利用BSR-Seq方法,将基因初定在玉米第3染色体160.4 Mb～165.6Mb区间内。参考玉米基因组信息,发现已报道的穗发芽基因Vp1位于此定位区间内。分别利用vp1、vp-like8的杂合突变体进行等位测验,发现杂交后代中正常与穗发芽籽粒符合3∶1遗传分离比。经序列分析,发现vp-like8突变体中Vp1基因在第2内含子有343 bp碱基的缺失,且第3内含子有222 bp重复序列的插入,而已报道的vp1突变体只在第2个内含子有343 bp碱基的缺失。通过实时定量PCR检测发现,与正常籽粒相比, vp-like8与Vp1突变籽粒中Vp1基因的转录水平均明显降低。以上证据表明, vp-like8是一个新的Vp1基因等位突变体。 相似文献
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Mao-Ni CHAO Hai-Yan HU Run-Hao WANG Yu CHEN Li-Na FU Qing-Qing LIU Qing-Lian WANG 《作物学报》2020,46(1):40-51
KUP/HAK/KT钾转运体基因的转录调控是植物响应低钾胁迫的一项重要机制。克隆和分析棉花钾转运体基因的启动子,不仅有助于了解其表达模式及调控机制,对于改良棉花的钾吸收特性也具有重要意义。陆地棉钾转运体基因GhHAK5是一个在根中特异性高表达的基因,其表达受低钾胁迫诱导,目前关于该基因启动子的功能还不清楚。本研究以陆地棉品种百棉1号为材料,通过PCR方法对GhHAK5上游2000bp启动子片段(pGhHAK5)进行克隆,并通过转化拟南芥、GUS组织定位和低钾诱导表达特性分析来研究其功能。结果表明, pGhHAK5除具有TATA-box和CAAT-box等基本顺式作用元件外,还含有多个响应于光、逆境胁迫、植物激素和生物钟等的顺式作用元件。pGhHAK5与雷蒙德氏棉pGrHAK5在重要调控元件的数量和位置分布上具有较高的一致性,均具有5个参与根特异性表达调控的元件(ATAAAAT)和1个参与低钾条件下转录调控的ARF转录因子结合位点(TGTCNN)。GUS组织化学染色结果显示,转基因拟南芥幼苗的叶脉和胚轴维管束组织染色较深,根系染色较浅;成熟期转基因拟南芥植株的根、叶脉和花萼维管束组织染色较深,茎和荚皮染色较浅,表明pGhHAK5驱动的GUS主要在拟南芥成熟的根和地上部维管束组织中表达。进一步低钾诱导表达特性分析表明, PGhHAK5驱动的GUS在拟南芥幼苗幼嫩根中的表达很弱,且其表达不受低钾胁迫诱导而增强,表明PGhHAK5可能是一个主要在成熟根中具有功能的低钾诱导型启动子。转录组分析和荧光定量PCR结果表明, GhHAK5主要在成熟的根中表达,且其表达受发育时期的影响,该结果与pGhHAK5驱动的GUS在拟南芥根中的表达结果一致。本研究结果有助于深入了解GhHAK5表达调控的分子机制,并为棉花钾吸收效率的提高及钾高效棉花品种的培育提供理论依据。 相似文献
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基于CRISPR/Cas9技术的水稻温敏不育基因tms5突变体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
为创新优良温敏不育系, 促进两系杂交稻育种的发展, 我们以水稻温敏不育基因TMS5为编辑对象, 设计了由水稻U3启动子驱动、长20 bp的guide RNA (gRNA)靶点以靶向编辑 TMS5 基因的第1个外显子, 将靶点与表达载体pCAMBIA1301连接, 再用农杆菌介导法获得水稻转基因株系。提取T0代转基因株系的基因组DNA, 并对TMS5编辑位点附近的DNA片段进行PCR检测及测序分析。结果表明, T0代植株的突变率为63.89%, 其中纯合缺失突变率为34.78%。对T1代纯合缺失突变体的不育起点温度和农艺性状调查分析结果表明, 28℃是tms5突变体花粉育性的转换温度。大田试验结果表明, 与野生型相比, tms5突变体的结实率和单株重均显著降低。粳稻tms5突变体的获得为培育粳稻不育系奠定了材料基础。 相似文献