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利用RT-PCR快速检测马铃薯X病毒(PVX) 总被引：2，自引：0，他引：2
采用TRIZOL试剂盒和异硫氰酸胍法2种方法提取了带PVX马铃薯试管苗的总RNA.根据设计好的1对特异性引物,运用反转录PCR技术对提取的总RNA进行了体外扩增.结果表明,所用2种方法都能有效地提取马铃薯RNA,并适合于反转录合成病毒cDNA,得到了与预期大小相一致的720 bp片段,而对照未得到任何产物.但利用TRIZOL试剂盒进行RNA提取价格较贵,而异硫氰酸胍法所用试剂可自己配制,方法灵活,价格较TRIZOL试剂盒便宜.从而建立了经济简便的PVX RT-PCR检测体系,为PVX的防治、脱毒种薯和核心种苗的检测提供有效手段. 相似文献
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河南省马铃薯Y病毒的分子检测与鉴定 总被引：6，自引：0，他引：6
利用RT-PCR技术对郑州市和信阳市的马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)进行了鉴定。依据PVY p1基因序列设计合成1对引物,以带毒的马铃薯叶片总RNA为模板,RT-PCR扩增得到0.58kb的目的DNA片段,而健康对照无此片段。对PCR产物进行序列测定,Blast分析表明,该DNA序列与PVY N:O株系p1基因序列相似性可达99%,证明所得DNA片段确为PVY p1基因,从而建立了PVY的RT-PCR检测方法。在此基础上,从节省检测时间、优化反应程序及反应体系等方面进行了改进。 相似文献
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通过对鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）RNA的提取、反转录及PCR反应条件、检测灵敏度等进行探讨,结果表明,采用反转录-多聚酶链式反应（RT－PCR）是检测鸡传染性法氏囊病病毒的可靠方法,RNA的提取简单易行,不经过病毒提纯,可检出的病毒RNA最低量可达1pg。 相似文献
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为了建立马铃薯M病毒(Potato virus M,PVM)的精准检测技术,根据PVM外壳蛋白基因核苷酸保守序列设计微滴数字PCR(dd PCR)的引物、探针,建立PVM的dd PCR检测技术。以田间采集并经RT-PCR验证的PVM及其他4种同样可侵染马铃薯的病毒(PVX、PVY、CMV、TMV)总RNA为模板,进行dd PCR特异性分析;对PVM的总RNA进行10倍梯度稀释并用作模板,进行dd PCR灵敏度测定。结果表明,建立的dd PCR方法可以特异性地检测马铃薯上的PVM,与实时荧光RT-PCR结果一致;最低可检测5.7 fg/μL的总RNA,比实时荧光RT-PCR灵敏度高100倍。说明建立的dd PCR检测方法可用于PVM的准确鉴定。 相似文献
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[目的]建立一种快速提取玉米基因组DNA的方法。[方法]对改良CTAB法进行进一步简化,不需要进行沉淀、洗涤、溶解和RNA消化等步骤,建立一种快速提取玉米基因组DNA的方法。[结果]该方法获得的DNA完整性及PCR扩增效果与试剂盒提取方法相比无明显差异;经过对样品ELISA检验可知,该方法得到的DNA用于PCR检测结果准确。[结论]该方法能够满足转基因玉米PCR检测中快速、高效、准确、高通量的要求。 相似文献
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适合RT-PCR的苹果芽RNA快速提取方法研究 总被引：1，自引：1，他引：0
[目的]从苹果单芽中高效、快速提取RNA,为后续分子生物学研究奠定基础。[方法]分别以苹果品种新红星、嘎拉和富士的单芽为材料,用改良SDS法提取RNA,并经过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳和RT—PCR检测RNA质量。[结果]研究出一种高效、快速的苹果单芽RNA提取方法,该方法能在2．5h内得到完整的RNA,经RT—PCR检验,能获得理想的目的片段。[结论]该方法稳定可靠,适合苹果单芽RNA提取。 相似文献
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对惠州市冬种马铃薯卷叶病发病情况进行调查研究,建立了马铃薯卷叶病毒(PLRV)RT-PCR检测技术。结果表明,马铃薯卷叶病发病率为3.0%～29.7%。比较LiCl、异硫氰酸胍和试剂盒3种方法提取马铃薯卷叶病毒总RNA,以异硫氰酸胍和试剂盒提取效果较好,LiCl次之;根据卷叶病毒外壳蛋白基因序列设计引物,从感染马铃薯卷叶病毒的马铃薯叶片中提取出病毒RNA,合成cDNA并运用RT-PCR技术进行体外扩增,得到一条长度约336bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而健康叶片RNA扩增未得到任何产物。应用RT-PCR技术对马铃薯试管苗和种薯进行了卷叶病毒检测。 相似文献
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旨在建立口蹄疫病毒可视化逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)快速检测方法。以猪口蹄疫灭活疫苗为材料,设计两对RT-LAMP引物,建立FMDV可视化RT-LAMP检测方法,并与普通PCR检测方法进行比较,同时进行特异性试验和敏感性试验。对从油佐剂疫苗中提取FMDV核酸方法进行比较结果发现,用商品化试剂盒提取时,3种样品处理方法对病毒RNA提取量没有显著影响;Trizol法提取RNA时,从油佐剂疫苗中直接提取,获得的RNA量最大,与其他2种方法差异极显著(P0.01)。建立了口蹄疫病毒可视化RT-LAMP方法,该方法检测到模板RNA最低稀释度为10-9,比RT-PCR方法灵敏10倍,特异性好。 相似文献
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CTAB法是一种广泛用于从染病植物中提取总核酸,并用于后续相关病原物PCR检测的核酸提取法,已普遍运用于DNA病毒、植原体、细菌、真菌侵染植物的总DNA提取和病原检测。本文尝试将CTAB法用于一种由RNA病毒（烟草丛顶病毒）引起的烟草丛顶病染病组织总核酸的提取,以总核酸进行烟草丛顶病毒的RT-PCR检测,并与常规RNA病毒核酸提取法——Trizol法作比较。结果表明CTAB法和Trizol法提取的核酸用于烟草丛顶病毒RT-PCR检测时,均能扩增到目的条带,检测结果一致。在对复合侵染材料进行检测时发现,CTAB法提取的染病植物组织总核酸既包括DNA也包含RNA,有利于对DNA和RNA病原物同时进行检测;CTAB法所用试剂较Trizol法便宜,毒性小,且提取的核酸量较多、保存时间较长。因此CTAB法是一种高效、简便、经济的从烟草丛顶病染病组织中提取烟草丛顶病毒RNA的方法。 相似文献
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[目的]对山西省马铃薯Y病毒cp基因进行克隆与序列特征分析。[方法]依据马铃薯Y病毒基因组序列,设计合成了一对引物PVYP1和PVYP2,以从山西省获得的带毒马铃薯叶片总RNA为模板,对RT-PCR扩增得到的基因片段进行序列测定。[结果]该DNA片段1～798bp为马铃薯Y病毒印基因,799～1064bp为3’非编码区序列,可编码265个氨基酸。将RT—PCR产物与载体连接后转入大肠杆菌提取阳性克隆的质粒DNA,酶切后琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,重组质粒已转入大肠杆菌。BLAST软件分析表明,山西省马铃薯Y病毒分离物CP氨基酸序列与已公布的PVY CP氨基酸序列相似性最高可达100％,说明所得DNA片段确为PVY cp基因片段。[结论]该研究为对山西省马铃薯Y病毒的防治提供理论依据。 相似文献
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PVYN与PVYO病毒RT-PCR快速检测体系研究 总被引：1，自引：1，他引：1
马铃薯Y病毒（PVY）是侵染马铃薯的重要病毒之一，严重影响马铃薯的生产。本文通过对PVY病毒N株系（PVYN）与O株系（PVYO）的基因序列进行比较，在其外壳蛋白同源区设计一对通用引物，建立了PVY病毒的RT-PCR检测体系。另外在N株系与O株系同源区设计一条3′引物，选择N株系与O株系差异区设计两条5′端引物，建立了可鉴定PVYN与PVYO的复合RT-PCR体系。这个体系的建立，对于马铃薯脱毒苗的检测与PVY病毒的调查及病理研究都具有一定的应用价值。 相似文献
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河北省马铃薯Y病毒株系分子鉴定及其RT-PCR检测 总被引：9，自引：0，他引：9
根据马铃薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物,从感染PVY的马铃薯田间病叶组织中提取出病毒的RNA,进行cDNA合成及PCR扩增,得到一条长度约800bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的基因片段大小一致,本试验建立了快速、灵敏、简便的PVY检测的方法。将RT-PCR扩增产物克隆到质粒pGEM-T上,并进行了序列分析。结果表明,克隆的cDNA片段由801个核苷酸组成,编码267个氨基酸组成的理论分子量为29kD蛋白,与PVY外壳蛋白的大小一致,与基因库登记的代表性株系相比,它们之间的核苷酸序列同源性为89 6%～98 8%,氨基酸序列的同源性为93 3%～98 5%,说明PVYCP基因具有高度的保守性(记为PVY-HBEI),与国内报道的PVY-CHU、PVY-ZHJ和PVY-ZHOU株系的氨基酸序列同源性分别为96 6%、98 5%和97 8%,与PVYN和PVYO株系的氨基酸序列同源性分别为93 6%和97 8%,从分子水平上确定PVY-HBEI归属于普通株系(PVYO株系)。 相似文献
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【目的】马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）是影响马铃薯产量和品质的主要病毒之一,目前尚未发现有效的防治药剂,脱毒种薯的应用是预防PVY危害的主要防治措施。建立灵敏度高、特异性强的PVY快速检测方法,为脱毒种薯质量控制提供技术支撑。【方法】将PVY衣壳蛋白（coat protein,CP）分段表达为有重叠部分的小段多肽,以其为抗原通过Western blot分析PVY-CP的抗原表位。以P/N值最大为标准,通过常规双抗夹心ELISA（DAS-ELISA）对识别不同抗原表位的单克隆抗体（monoclonal antibody,MAb）进行配对试验,筛选一组检测效果最优的配对单克隆抗体,并确认捕获抗体和检测抗体。通过方阵滴定法确定捕获抗体及检测抗体的最佳工作浓度,通过控制变量法确定检测抗体与抗原的最佳共同孵育时间。以不同浓度的PVY-CP蛋白为抗原,检验快速DAS-ELISA的灵敏度。以感染不同病毒的马铃薯样品为抗原,检测快速DAS-ELISA的特异性。同时通过快速DAS-ELISA与RT-PCR检测50份田间采集的疑似感染PVY的马铃薯样品,将二者结果相比较检验检测方法的符合率。运用建立的快速DAS-ELISA对不同株系PVY感染的马铃薯样品进行检测。【结果】利用PVY-CP的6条分段表达多肽筛选到一组能进行DAS-ELISA的配对单克隆抗体（9G6和3D3）,并以这对单抗为基础建立了PVY快速DAS-ELISA检测方法。以9G6为捕获抗体包被酶标板,检测抗体3D3经辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记后以2 μg·mL-1的工作浓度与抗原在37℃共同孵育5 min。该检测方法检测限为0.5 ng·mL-1,特异性分析结果显示该法仅在检测感染PVY的马铃薯样品时呈阳性反应,检测马铃薯S病毒（potato virus S,PVS）、马铃薯M病毒（potato virus M,PVM）、马铃薯卷叶病毒（potato leaf-roll virus,PLRV）等其他常见马铃薯病毒样品均呈阴性反应。通过快速DAS-ELISA与RT-PCR同时对50份田间采集的马铃薯样品进行检测,有48份样品检测结果一致,符合率达96%,且对PVYN及PVYO样品检测结果均呈阳性。【结论】建立的PVY检测方法灵敏度高、特异性强,30 min即可完成检测,方便快捷,为PVY的高通量检测、脱毒种薯的生产提供了关键技术支持。 相似文献
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马铃薯卷叶病毒的RT-PCR快速检测 总被引：7，自引：1，他引：7
根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物。从感染马铃薯卷叶病毒(PLRV)的马铃薯叶片中提取出病毒RNA,进行cDNA合成并运用RT-PCR技术进行体外扩增,得到一条长度约627bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而对照未得到任何产物。从而建立了快速灵敏的PLRV检测方法,为PLRV的防治及检测提供了有效手段。 相似文献
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昆明地区菊花病毒病的调查与鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
从昆明地区菊花种植较为集中的花卉基地和公园采集208份病毒症状明显的菊花病标样,通过鉴别寄主反应、电镜观察、血清学反应以及RT-PCR扩增,鉴定出危害菊花的病毒病原有:菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯X病毒（PVX）、黄瓜花叶病毒（CMV）和烟草花叶病毒（TMV）,其中CVB为侵染危害菊花的优势病毒,占52.5%,田间多数情况下是与TAV,PVY,PVX等病毒复合侵染。 相似文献
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以陕北地区8个县(区)种植2~3代疑似带毒的马铃薯叶片为材料,Trizol法提取马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯Y病毒外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列设计1对特异引物,反转录合成cDNA,RT-PCR扩增目的 DNA片段,1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。回收纯化CP基因片段并进行克隆和测序,采用DNAstar软件分析序列一致性。结果显示,所有马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致的、长度为400 bp的目的片段,表明这些马铃薯均感染了Y病毒;陕北8个县(区)马铃薯Y病毒CP基因与国内外其他地区12个样品之间的序列一致性为88.4%~99.8%,表明马铃薯Y病毒的CP基因序列比较保守,不易发生变异。RT-PCR方法可快速、准确地检测马铃薯Y病毒,从而为马铃薯茎尖剥离脱毒生产脱毒种苗(薯)提供依据。 相似文献
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中国马铃薯Y病毒的检测鉴定及CP基因的分子变异 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】查明马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）病在中国的发生情况,及时、准确地鉴定出PVY并对其分子变异进行分析。【方法】采用ELISA 方法对采自中国14个省（直辖市）马铃薯种植区疑似受PVY感染的样品进行了检测,并对其中的部分材料镜检验证,然后根据CP基因序列设计1对简并引物针对随机选择感染PVY的14个省（直辖市）代表样品进行CP基因扩增克隆,将测序得到的序列进行分子变异分析,并使用贝叶斯法（Bayesian inference,BI）重建系统发育关系。【结果】ELISA检测结果表明,691份样品中220个样品与PVY抗体呈阳性反应,其余呈阴性反应;ELISA检测的阳性材料在透射电镜下均可观察到明显的风轮状内含体,14个PVY分离物均成功扩增出预期大小（约800 bp）的特异性片段,CP基因的核苷酸序列与已报道PVY不同株系的核苷酸序列一致性均在88%以上;在14个PVY分离物CP基因中共发现有29个多态性位点,其中6个简约信息位点,23个单一变异位点。系统发育分析结果显示,14个PVY分离物与PVYN:O株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上,与PVYN:O株系的亲缘关系最近。【结论】PVY CP基因高度保守,但不同地区分离物也存在一定的分子变异,本研究可为今后了解PVY病毒病流行、变异趋势及其防治提供依据。 相似文献