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1.
猪生长激素基因的原核表达及其抗体制备 总被引：6，自引：0，他引：6
通过构建pGH基因的原核表达质粒，转化大肠埃希氏菌TOP10，经IPTG诱导，成功表达了重组猪生长激素的融合蛋白。经SDSPAGE分析，在分子质量50．4ku处有1条新的特异蛋白质条带。对以包涵体形式表达的融合蛋白进行SDSPAGE分离，并经透析得到了重组融合蛋白，以此融合蛋白免疫家兔，制备并纯化了抗pGH多克隆抗体，经酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析和免疫组织化学方法检测，此抗体具有较高效价和特异性。成功地表达了pGH基因并获得了多克隆抗体。 相似文献
2.
利用RT-PCR技术克隆了猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts882蛋白基因,测序结果表明：序列长度为270bp,包含258bp的编码区,编码85个氨基酸,与GenBank中西班牙分离株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均为99％;将该基因成熟肽部分亚克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导后,进行SDS-PAGE初步分析,在34ku位置有1条蛋白条带,与预期结果一致。通过GST亲和纯化获得了较高纯度的重组融合蛋白,Westernblot结果表明,纯化后的重组融合蛋白可与兔抗全囊囊尾蚴血清发生特异性反应。排泄分泌抗原Ts882的成功表达、纯化为进一步研究该蛋白在抗体检测中的应用奠定了基础。 相似文献
3.
以原构建的克隆载体为模板,PCR扩增梅花鹿FSHα亚基基因,TA克隆后经双酶切插入表达载体pGEX-6P-2,阳性克隆导入E.coli BL21,IPTG诱导表达GST-FSHα融合蛋白,SDS-PAGE进行分析鉴定。结果表明,FSHα PCR产物大小约380 bp,测序结果与GenBank序列一致;重组表达载体pGEX-6P-2-FSHα构建成功;融合蛋白经SDS-PAGE分析,结果发现,在分子质量39.3 ku处出现特异性蛋白质条带,说明梅花鹿FSHα亚基基因片段已在E.coli BL21中成功表达了FSHα-GST融合蛋白。 相似文献
4.
α-银环蛇毒素融合基因表达载体的构建及原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
设计并人工合成2条引物,对作者构建的重组质粒pMD-α-BGT进行PCR扩增获得α-BGT基因。将目的基因连接至pUCm-T载体构建克隆质粒pUCm-α-BGT。克隆质粒经BamHⅠ、NotⅠ双酶切后连接至融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,成功构建融合基因表达载体pGEX-α-BGT,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。表达产物经15%SDS-PAGE分析,在约34ku处可见明显的外源蛋白质表达带,与预计的分子量大小一致,其表达量约占细菌总蛋白的32.6%。Westernblotting和间接ELISA检测结果表明,α-BGT的融合表达蛋白与天然α-BGT标准品具有相似的抗原性。 相似文献
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猪囊尾蚴抗原基因Ts11的克隆及其在大肠杆菌的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
PCR扩增重组噬菌体λTs11克隆的cDNA片段,与pUC18连接,得到的重组子用以测序,并进行同源性比较分析,将该片段克隆到原核表达载体pGEX-1λT中,免疫印迹筛选得到能正确表达该片段的重组子,制备该和理组子在大肠杆菌中的表达产物,进行浓度梯度SDS-PAGE和West-ern blotting分析,结果表明Ts11 cDNA片段为522 ,编码含139个氨基酸残基的多肽,在Gen-Bank和EMBL数据库均未发现同源序列,重组质粒在大肠杆菌中表达的融合蛋白分子量为41KD,能与免抗猪囊尾蚴囊液血清产生很强的免疫反应,这些结果证实分离到一个新的编码具有较强免疫原性猪囊尾缦抗原的 DNA克隆..λλ 相似文献
6.
参照GenBank中小反刍兽疫病毒（PPRV）H抗原基因序列，人工合成了PPRVH基因，将其克隆至PUC18-T质粒中，转化E．coli JM109感受态细胞，构建并选择PPRVH基因克隆重组质粒，经核苷酸序列分析正确，将其克隆至pBAD／Thio—TOPO载体中，转化E．coli TOP10感受态细胞，核苷酸序列分析证实，成功构建了PPRVH基因重组表达载体。经不同浓度L-阿拉伯糖诱导，可稳定、高效地表达PPRVH抗原。SDS-PAGE分析结果表明，用终浓度为0．2g／L的L-阿拉伯糖诱导5h的表达量最高，表达蛋白为分子质量约83ku的融合蛋白；经薄层扫描分析，其表达产量约占菌体总蛋白的10％。Western-blotting检测表明，诱导的蛋白能与PPRVH蛋白单抗发生特异性反应，说明表达的融合蛋白中含有PPRVH糖蛋白抗原。 相似文献
7.
利用RT—PCR技术从黑龙江省猪源旋毛虫获得了Ts43基因，并克隆入pcDNA3．1-CT—GFP真核表达载体中构建重组质粒，用该重组质粒在脂质体介导下转染VeroE6细胞，GFP标签证明质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达，通过Western—blot分析，细胞裂解液样品中有1条约66ku的条带，可被小鼠旋毛虫阳性血清所识别，与预计大小一致，说明，真核表达载体pcDNA3．1-CT—GFP中的Ts43基因在VeroE6细胞中获得了表达，表达产物具有抗原性。 相似文献
8.
猪生殖与呼吸综合征病毒CH-1a株GP5蛋白基因的表达及其单克隆抗体的制备 总被引：5，自引：1，他引：5
将猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）CH-1a株GP5蛋白基因信号肽部分删除后克隆于pGEX-6p-1．载体上，并在大肠埃希氏菌中进行表达。经SDS-PAGE电泳分析发现，融合表达的rtGP5蛋白约42ku，将融合蛋白rtGP5用PRRSV阳性血清进行Western-blotting分析，证实所表达的融合蛋白能被其特异性识别。收获融合表达产物rtGP5，按50pg／只的剂量与等量弗氏佐剂乳化，经腹腔免疫BALB／c小鼠3次后，取脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合，分别以融合蛋白rtGP5和GST蛋白为抗原，通过间接ELISA方法对融合细胞的上清液进行检测，筛选阳性克隆，结果得到了15株能稳定分泌抗rtGP5蛋白抗体的阳性细胞克隆株。经间接免疫荧光检测发现，获得的15株单克隆抗体都能与PRRSV感染细胞产生特异性荧光。15株单克隆抗体亚型鉴定结果显示均为IgG1型，且轻链均为k链。 相似文献
9.
改良菌落原位杂交技术快速筛选NDV F基因阳性克隆株 总被引：1，自引：0，他引：1
应用从表达型质粒载体构建的ＤＮＶ Ｆ基因文库中筛选阳性克隆株的改良融合蛋白质－抗体蛋白质原位杂交技术，可使菌落在硝酸纤维素薄膜上增殖，经适当处理后，即可用特异性抗体探针进行原位筛选，获得含目的基因编码的特异抗原蛋白的阳性克隆株。 相似文献
10.
将O型口蹄疫病毒VP1基因和牛集落刺激因子(GM—CSF)成熟肽基因共同克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中，转化RS21后经IPTG诱导，实现了重组融合蛋白BoGM—CSF／VP1在大肠埃希氏菌RS21中的高效表达，表达产物经SDS—PAGE和Western-blotting分析，重组的蛋白质分子质量约为66ku，与预期大小相符。表达蛋白占菌体总蛋白的30％，表达产物以包涵体形式存在；包涵体提取物经变性复性，用透析方法提纯，得到高纯度的表达蛋白。 相似文献
11.
本研究用PCR方法获得猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白基因,经酶切后将ORF2 3′端部分基因克隆至原核表达载体pGEX-6p-1中,转化大肠杆菌BL21,加入终浓度为0.3 mmol/LIPTG,在30℃诱导表达6 h后,经SDS-PAGE及western-blot分析,目的基因得到正确表达,大小约为40 ku。收集菌体并进行超声裂解后证实,表达产物以可溶蛋白与包涵体共同存在。对可溶蛋白与包涵体分别进行纯化,分别用做ELISA包被抗原检测PCV2抗体,结果两者无明显差异。 相似文献
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绵羊肺腺瘤病毒内蒙毒株囊膜蛋白基因在大肠杆菌中的分段表达 总被引：2，自引：0，他引：2
为了建立原核高效表达体系,从自然感染绵羊肺腺瘤病毒内蒙毒株的肺肿瘤组织中提取基因组DNA,应用PCR技术分别扩增编码囊膜蛋白(env)基因的表面蛋白(surface protein,SU)和跨膜蛋白(transmembrane protein,TM)区域基因,通过T-A克隆的方法分别克隆入pGEM-TEasy载体中,然后利用设计的起始密码、终止密码以及相应酶切位点的引物,把env基因的SU区和TM区基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1中,分别构建SU和TM的重组表达质粒,经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,将阳性质粒转化入大肠杆菌BL21 CodonPlus中并在IPTG的诱导下表达,表达产物用SDS-PAGE分析鉴定。结果表明,该基因可以在大肠杆菌中以稳定的包涵体形式高效表达,表达的SU和TM融合蛋白表观分子质量约为68 ku和46 ku,表达量分别占全菌蛋白的25%和30%,并且从包涵体分离纯化得到的表达蛋白具有较高纯度,是一种理想的免疫原。 相似文献
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14.
为了构建荷包猪SLA-3-HB01基因四聚体前体链原核表达载体,并获得SLA-3-HB01表达蛋白,试验以SLA-3-HB01/pMD18-T为模板进行PCR扩增四聚体前体链SLA-3-HB01-BSP,并克隆至pMD19-T载体中,经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切筛选阳性克隆并测序,目的基因连接至表达载体pET-21a（+）,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白大小及表达情况,提取包涵体并进行检测。结果显示,PCR成功扩增得到SLA-3-HB01-BSP,大小为896 bp左右。酶切鉴定证实,目的基因成功克隆至pMD19-T载体中,插入片段大小为876 bp,阳性克隆经测序后所获序列与原序列一致,并在3'端带有BSP标签序列。酶切鉴定进一步证实成功构建SLA-3-HB01-BSP/pET-21a（+）重组表达载体,经转化及诱导表达,SDS-PAGE检测显示目的蛋白分子质量在33.5 ku左右。包涵体蛋白分子质量约33.5 ku,与菌体中目的蛋白大小一致,经凝胶成像系统UVP扫描分析,包涵体蛋白纯度接近于90%,符合进行相关结构和功能研究的要求。本研究成功构建了荷包猪SLA-3-HB01基因四聚体前体链的pET-21a（+）重组表达系统,并获得了一定纯度的包涵体蛋白。 相似文献
15.
To construct tetramer precursor chain of swine lymphocyte antigen 1 (SLA-1) heavy chain in Hebao pig and study its protein expression in the pET-21a (+) vector,the SLA-1 complete genome sequence was referenced with the characteristics of the expression vector,and a pair of primers was designed to integrate the BirA substrate peptide (BSP) sequence at the C-terminus of the SLA-1-HB01 and the SLA-1-HB01-BSP was amplified by PCR. Then,the products were cloned into the pEASY T1 vector and the positive clones of SLA-1-HB01-BSP/pEASY T1 was selected. After the double digestion,the interest of the gene in positive clone was further ligated into the pET-21a (+) expression vector and transformed into E.coli BL21 to construct the recombinant strain of pET-21a (+)/SLA-1-HB01-BSP. After induction with IPTG,the target protein were detected by SDS-PAGE. Finally,the inclusion body of the SLA-1-HB01-BSP was isolated and detected to evaluate its purity. The PCR results showed that the length of SLA-1-HB01-BSP was about 898 bp,which was consistent with the theoretical value. The amplified fragment was successfully cloned into pEASY T1 vector, and the positive clones were identified by Nde Ⅰ and Xho Ⅰ digestion. The size of inserted fragment was 876 bp. The interest of gene was also inserted into pET-21a (+) and transformed into E.coil BL21 successfully. After induction,SDS-PAGE detection results showed that the target protein was 31.4 ku. Further detection showed that the target protein was mainly expressed as inclusion bodies,and the purity of the protein was about 80%. In this study,the recombinant tetramer precursor of SLA-1-HB01 heavy chain was constructed in pET-21a (+) expression line successfully, which would lay a foundation to detect the tetramer of SLA class Ⅰ molecular. 相似文献
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福氏志贺菌外输调节蛋白基因marA的原核表达载体构建及其鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
目的构建志贺菌外输调节蛋白基因marA的原核表达载体并对其表达的蛋白进行鉴定。方法采用PCR从志贺菌基因组DNA中扩增得到志贺菌外输调节蛋白基因marA,并将其定向克隆到原核表达载体pET-30a,构建原核表达重组质粒pET-30a-marA,重组子经限制性内切酶分析、PCR及测序鉴定后,转化宿主菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果经鉴定证实原核表达载体pET-30a-marA构建成功,且在大肠杆菌BL21中获得了MarA与His的融合表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被特异性抗体所识别。结论MarA在大肠杆菌中获得了高效的表达,为进一步研究其免疫学特性和功能奠定了基础。 相似文献
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试验旨在构建荷包猪猪白细胞抗原1（swine lymphocyte antigen 1,SLA-1）重链四聚体前体链并研究其在表达载体pET-21a（+）中蛋白的表达情况。以SLA-1全基因序列为模板,结合表达载体的特点设计引物,利用PCR扩增技术在SLA-1-HB01胞外区序列C-末端加载上可生物素酰化序列（BirA substrate peptide,BSP）。将PCR扩增产物SLA-1-HB01-BSP克隆到pEASY T1载体上,筛选出阳性克隆菌SLA-1-HB01-BSP/pEASY T1,经双酶切后进一步与表达载体pET-21a（+）连接,再转化到E.coli BL21感受态细胞中构建pET-21a（+）/SLA-1-HB01-BSP重组表达菌,通过IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测蛋白的大小及表达情况,提取包涵体检测蛋白的纯度。PCR扩增结果显示,SLA-1-HB01-BSP大小为898 bp,与理论值相符,扩增片段成功克隆至pEASY T1载体构建克隆菌,经Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切筛选及测序,成功获得阳性克隆菌株SLA-1-HB01-BSP/pEASY T1,插入的目的基因片段大小为876 bp。阳性克隆菌株与pET-21a（+）表达载体经Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后进行连接,转化E coli BL21感受态细胞后获得pET-21a（+）/SLA-1-HB01-BSP重组表达菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白大小为31.4 ku。进一步检测分析发现,目的蛋白以包涵体形式存在,且蛋白纯度达到80%以上。本研究成功构建了荷包猪SLA-1-HB01重链四聚体前体链的pET-21a（+）重组表达体系,为下一步进行猪SLA Ⅰ类分子四聚体的检测奠定基础。 相似文献
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以Protean软件对犬细小病毒南京株(CPV-GN)VP2蛋白的分子结构进行分析,从中筛选出具有良好免疫原性潜能的部分片段(VP2′片段),利用PrimerPremier5.0软件设计一对引物,用以该片段的扩增。将PCR扩增产物克隆入pMD18-T载体,构建了pMD-VP2′重组质粒。双酶切回收目的条带,将之亚克隆入表达载体pET32a(+),构建了重组表达质粒pET32-VP2′。转化宿主菌BL21,经IPTG诱导后成功表达了分子量约为34ku的融合蛋白。免疫转印显示,目的蛋白可被CPV-2b抗血清所识别,证明其具有与特异性抗体结合的抗原性,为CPV亚单位疫苗和免疫学诊断方法的研究打下基础。 相似文献
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运用生物信息学软件DNAStar对副猪嗜血杆菌S4型OmpA的二级结构、表面特性及抗原表位等进行分析，联合重组抗原表位基因片段，并对其进行密码子改造，人工合成改造后的基因片段。将其插入pET-32a构建重组表达载体pETpA，转化大肠杆菌BL21（DE3），进行诱导表达、鉴定及纯化。结果显示，OmpA胞外段的抗原表位分布于40～61、94～108、138～148、193～214氨基酸残基。重组后的表位基因序列与理论设计序列完全一致，表达产物为28000大小的融合蛋白且其能与兔抗Hpss4型多抗血清特异性地反应。融合蛋白经过柱纯化并经脱盐处理后质量浓度为4～40g／L。结果表明，成功构建表达OmpA多抗原表位的重组质粒pET—pA，并对融合蛋白进行分离纯化，为单克隆抗体的制备、检测方法的建立及疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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鸡毒支原体黏附蛋白PvpA的原核表达与纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
利用基因重组技术将PvpA基因的PCR扩增产物与原核表达栽体pET-41a(+)连接,转化入DH5a感受态细胞,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入大肠杆菌BL21(D3)受体菌,用IPTG诱导蛋白表达.用纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备PvpA蛋白多克隆抗血清,并用Western blotting检验抗体特异性.结果表明,本研究成功获得PvpA纯化蛋白,在免疫印迹试验中,兔抗PvpA高免血清能与目的蛋白发生阳性反应,证实表达产物为特异性蛋白. 相似文献