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1.
为了阐明红麻耐盐机理,以耐盐性较强的中红麻16号为材料,从红麻耐盐转录组测序结果中获得了1个与AVP1基因高度相似的Unigene,根据该片段的序列设计引物,直接进行PCR扩增,经Sanger测序获得该基因全长c DNA序列。对该基因序列进行生物信息学分析表明:该基因全长2 298 bp,开放阅读框为2 298 bp,编码765个氨基酸,其编码蛋白质的分子量和等电点分别为80.2 k Da和5.25,与雷蒙德氏棉、甜橙、毛果杨、烟草和大豆的H+-PPase基因核苷酸序列的相似性分别为90%,85%,85%,83%,83%,蛋白质序列的相似性分别为96%,93%,91%,93%,94%,说明该基因与AVP1为同源基因,命名为Hcvp1。qRT-PCR分析表明,该基因的表达量随着Na Cl浓度的增加而增加。这将为Hcvp1基因的功能验证和红麻耐盐机理的研究奠定坚实的基础。 相似文献
2.
苎麻Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因的克隆和表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
以耐旱性较强的湘苎3号为材料,从苎麻转录组测序结果中获得了1个与P5CS基因高度相似的Unigene,该片段长1 448 bp,根据该序列设计5′RACE和3′RACE槽式PCR引物,利用RACE结合RT-PCR技术分别克隆得到590 bp的5′端和293 bp的3′端,拼接获得该基因全长cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析表明,该基因全长为2 318 bp,其中开放读码框为2 154 bp,编码717个氨基酸,其编码蛋白质的等电点和分子量分别为6.57 kD和77.56 kD,与亚洲棉、麻风树、拟南芥和水稻的P5CS基因的核苷酸序列相似性分别为81%、81%、75%和72%,蛋白质序列的相似性分别为86%、85%、78%和77%,说明该基因与P5CS为同源,被命名为BnP5CS1。半定量RT-PCR分析表明,该基因在苎麻的茎尖中表达量最高,在根中其次, 且受干旱胁迫的诱导。P5CS基因是植物体内合成脯氨酸的关键酶基因,BnP5CS1基因的克隆将为苎麻的抗逆分子育种和进一步的功能分析鉴定基础。 相似文献
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小麦抗叶锈病Lr35基因同源序列RGA1侧翼序列的扩增与分析 总被引：1，自引：0，他引：1
利用小麦抗叶锈病近等基因系材料TcLr35,根据已扩增出的Lr35相关基因组DNA片段RGA1设计3对特异性引物,通过热不对称交错PCR技术获得2个有效扩增片段,将目的片段回收纯化,连接到pGEM-TEasy载体,转化EcoliDH5α感受态细胞中,经EcoRⅠ酶切,验证插入片段,选择合适菌液测序。获得了2条侧翼序列,长度分别为511bp和614bp,与RGA1重叠区分别为293bp和509bp,分别向3'端和5'端延长了208bp和100bp,拼接后序列为915bp。经BLASTn同源性比较与小麦抗叶锈病基因Lr21同源性为93%(score值为674,E值为0.0),与含有Lr10基因的450Kb大片段重叠群同源性为90%(score值为260,E值为7e-66),该研究为克隆Lr35目的基因奠定了基础。 相似文献
4.
本研究旨在分离玉米谷氨酰胺合成酶(GS)家族重要成员Gln1-4 gDNA序列全长,分析基因结构、保守功能域与自然等位变异,为氮利用效率功能位点关联性分析奠定基础。利用PCR步移(walking)方法分离Gln1-4基因区域基因组DNA序列,用生物信息学方法分析基因结构与保守功能域,测序与序列比对法分析重要区域自然等位变异。结果表明,分离得到自交系Mo17 Gln1-4区域gDNA 3 724 bp,起始密码子至终止密码子序列长2 858 bp,登录到GenBank (登录号为EU369651), 并注释。Gln1-4基因含10个外显子与9个内含子,18个剪接位点均为保守的5'供位GU与3'受位AG模式。编码的GS蛋白由356个氨基酸组成,分子量39.2 kD,等电点(pI)为5.202。氨基末端外显子2到外显子6为氨离子结合结构保守功能域;羧基末端外显子8与外显子9构成ATP酶活性保守功能域。Gln1-4与Gln1-3基因相比,在DNA序列、氨基酸序列、基因结构、保守功能域均很保守,氨基酸序列一致性达98.31%。52个玉米自交系的Gln1-4等位变异分析中,共鉴定出318个等位变异位点,其中242个SNP,45个Indels,占90%。该基因氮利用效率功能关联性分析区间应位于氨离子结合功能域与ATPase活性保守功能域中重要的变异位点,18个剪接位点。 相似文献
5.
桃果实乙烯反应因子PpERF1全长基因的克隆及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
以成熟肥城桃果实的cDNA为模板,根据EST库中的核苷酸序列,设计2条特异引物分别与B26进行PCR扩增,结果得到了该基因下游包括3′ 端非编码区的765 bp大小的cDNA片段。PpERF1基因全长为1 263 bp,包含一个708 bp大小的完整开放阅读框(ORF)。序列分析表明,PpERF1与番茄、拟南芥、苹果和葡萄等在DNA结合功能域的约58个氨基酸中,同源性可达68.4%-100%,且在该区域中存在1个α-螺旋和3个反平行链构成的β-折叠结构。经同源性分析,该序列与拟南芥、葡萄、豌豆等植物的氨基酸同源性为58.8%～67.5%,属于同一类ERF家族成员。 相似文献
6.
从Phytozome数据库中获得包括大豆在内的12种植物的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)氨基酸序列,利用MEGA5.10软件进行多序列比对、构建进化树。进化分析表明,植物GS可以分成胞质型(GS1)和质体型(GS2)两大类,GS1可进一步分成分5个亚类,包括双子叶植物为主的I、II和III亚类、低等植物类(IV)和单子叶植物类(V)。这5亚类中,第II类是豆科植物特有的一类,大豆的4个GS1 (GmGS1β1/2和GmGS1γ1/2)属于该亚类;利用qPCR在大豆盛花期分析GS1基因的组织表达特异性,结果表明不同类型GmGS1基因在表达部位和表达丰度上存在较大差异,而同一类基因之间具有相似的表达规律;4个豆科植物特有的GS1基因在大豆根瘤中都有较高的表达量,其中位于大豆第18染色体上的GmGS1β2基因表达丰度最高;利用原核表达系统体外表达GmGS1β2蛋白,诱导出分子量大小与理论预测值一致的目标蛋白,酶活性分析表明GmGS1β2可以与底物发生催化反应,具有谷氨酰胺合成酶活性,推测该基因在大豆根瘤氮素同化代谢中具有重要作用。 相似文献
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花生白藜芦醇合成酶基因PNRS1的克隆及其在原核中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR克隆花生白藜芦醇合成酶(resveratrol synthetic enzyme, RS)基因全长,命名为PNRS1,GenBank登录号为FM955393。序列分析表明该基因的开放读码框1 170 bp,编码389个氨基酸残基。以花生品种鲁花14基因组DNA为模板经PCR扩增,获得该基因的基因组序列长1 537 bp,包含2个外显子和1个内含子。比较发现,PNRS1与其他已知RS序列的同源性达91%~95%。表达模式分析显示,PNRS1在花生根中特异表达,并可被紫外线UV-B诱导。PNRS1与pET-28a(+)构建原核表达载体,经IPTG诱导后可表达获得相对分子量约为46 kD的外源融合蛋白。以上结果证实PNRS1属花生RS基因家族成员,并为进一步分析该基因的功能奠定了基础。 相似文献
9.
本研究以热研3号苦瓜总RNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术,获得苦瓜谷氨酰胺合成酶基因,并命名为McGS1。生物信息学分析表明:苦瓜McGS1基因全长1 302 bp,其中CDS序列长度为1 071 bp,编码356个氨基酸;蛋白分子量为39.14 kD,等电点(pI)为5.49,元素组成为:C1751H2685N479O525S9,N末端主要为疏水性的氨基酸,而C端亲水性氨基酸较多;利用软件进行预测发现该蛋白没有跨膜区,说明它不是一个跨膜蛋白,同时发现该蛋白不存在信号肽;其蛋白质二级结构中,α-螺旋占28.37%,延伸链占17.42%,β-折叠占5.34%,无规则卷曲占48.88%;同源性比对发现苦瓜McGS1蛋白与甜瓜和黄瓜中的GS1蛋白亲缘关系最近,相似度分别达到了94.66%和95.22%。本研究结果可为进一步研究谷氨酰胺合成酶基因在苦瓜氮代谢中的调控作用提供理论参考。 相似文献
10.
本研究从已构建的苦瓜果实均一化文库筛选得到一个EIN3-like同源EST序列,结合RACE技术,克隆得到EIN3基因c DNA全长序列,命名为Mc EIL2(Gen Bank登录号:KF595122)。该基因全长2 122 bp,开放阅读框1 890 bp,编码629个氨基酸,预测该蛋白的分子量为71.58 k D,与黄瓜Cus EIN3、甜瓜Cm EIL1、苜蓿Mt EIL1、绿豆Vr EIL1和番茄Le EIL1的蛋白同源性分别为89.61%、78.37%、71.23%、69.09%和65.66%。Mc EIL2基因的编码蛋白亚细胞定位于细胞核,荧光定量分析表明Mc EIL2基因表达量在幼果期先强后弱,绿熟期最低,破色期表达量大幅增加至最高随后下降,推测该基因参与苦瓜果实成熟软化调控过程。本研究初步明确了Mc EIL2基因在苦瓜成熟过程表达模式,可为今后进一步揭示苦瓜果实成熟软化的分子机制奠定基础。 相似文献
11.
干旱应答元件结合蛋白(DREB)在植物非生物逆境胁迫中调节下游一系列抗逆基因的表达。本研究利用电子克隆和RT-PCR方法从高粱中克隆到1个DREB类基因SbDREB2,该基因ORF 789 bp,推测编码蛋白含262个氨基酸残基,相对分子质量28.6 kD,理论等电点为5.52,在DNA序列内包含1个740 bp的内含子,符合GT-AG剪接规则。氨基酸序列分析表明,该蛋白在82~145区含有DREB类转录因子家族特有的AP2保守结构域,与玉米DREB2A及水稻DREB1蛋白相似度分别为84%和69%。成功构建了原核表达载体pET28a-SbDREB2,经IPTG诱导获得32.5 kD左右蛋白,与理论值一致。Real-time PCR表达特性分析显示,该基因为组成型表达,在根、茎、叶中均表达,根中表达量约是茎中的2.5倍;受干旱、高盐和外源ABA的强烈诱导,但对低温几乎没有响应。 相似文献
12.
富含油酸的菜籽油具有重要的经济价值,使得高油酸育种和形成机理的研究成为热点。油酸脱氢酶基因(FAD2基因)是控制油酸含量的关键酶基因。本文针对BnFAD2-C5基因展开研究,根据油菜和甘蓝的同源性,克隆了1257 bp启动子序列,利用GUS和GFP作为报告基因分别构建含有不同片段长度的启动子和内含子的缺失载体并转化拟南芥,经GUS染色检测发现–319 ~ –1 bp为该研究中最小启动子;采用Western技术分析启动子和内含子不同区域的功能,发现BnFAD2-C5启动子区域–1257 ~ –1020 bp和–319 ~ –1 bp能够诱导报告基因在转基因拟南芥种子发育中期高效表达,BnFAD2-C5内含子具有增强启动子转录水平的功能,该功能主要由631~1033 bp区域调控。 相似文献
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小麦亚硝酸还原酶基因及调控序列克隆、定位和表达分析 总被引：2，自引：0，他引：2
利用in silico及反向PCR技术, 从小麦中克隆了亚硝酸还原酶编码基因及其调控序列, 进一步利用原核诱导表达、半定量RT-PCR、AS-PCR及生物信息学手段对克隆的新基因进行鉴定及染色体定位分析。开放阅读框预测结合测序结果表明, 该基因gDNA长2 881 bp, 包含4个外显子和3个内含子, cDNA长1 830 bp, GenBank登录号分别为FJ555239和FJ527909, 预测编码产物大小约为65.7 kD, 与NCBI已公布的亚硝酸还原酶基因编码产物同源性达60%以上, 其中与其他单子叶谷类作物同源性达80%以上。IPCR技术延伸该基因5′端侧翼序列至-2 924 bp (以ATG起始计算), 经1 mmol L-1 IPTG诱导后可表达大小约为70 kD的蛋白(含约3.8 kD的组氨酸标签)。RT-PCR结果显示, 30 mmol L-1 KNO3处理小麦幼苗1 h, 亚硝酸还原酶基因表达量最高。酶活性测定表明, 随着KNO3处理时间延长亚硝酸还原酶活性增强。AS-PCR检测发现, 该基因在普通小麦6A及6B染色体上至少各存在1个拷贝。 相似文献
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根据GenBank中已发表的鸡白细胞介素2 (IL-2)mRNA基因序列,利用Premier 5.0软件设计一对特异性引物,采用RT-PCR技术,以ConA刺激的鸡外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出鸡IL-2基因。经琼脂糖凝胶电泳显示扩增片段约为432 bp,分离纯化片段,克隆入pMD-18T载体,转化DH5α感受态细胞,获得阳性重组质粒,经酶切鉴定,测序结果显示,我们得到了长432bp的基因,含有一个 432bp的开放阅读框,编码143个氨基酸。生物软件分析结果表明该序列与GenBank中发表的鸡的IL-2的核苷酸序列同源性为98.8%,与黄牛、马、鸡、绵羊、牛、犬、人、山羊、鼠、水牛的核苷酸同源性分别为31.2%、28.2%、27.3%、30.6%、26.2%、31.7%、30.1%、30.8%、26.6%、30.6%。与GenBank中发表的鸡IL-2编码的氨基酸序列同源性为95.8%,与上述动物的氨基酸序列同源性分别为7.6%、7.6%、9.7%、7.6%、6.9%、10.4%、11.8%、7.6%、9.0%、7.6%、10.4% 。这表明鸡的IL-2基因被成功克隆,它存在着种属特异性。这为进一步研究该基因的生物学作用特别是利用IL-2增强DNA疫苗的免疫效果奠定了基础。 相似文献
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柽柳MnSOD基因的克隆及功能验证 总被引：2，自引：0，他引：2
根据已克隆得到的柽柳MnSOD基因片段,采用RACE技术从柽柳中获得MnSOD的cDNA全长序列.该基因全长为1 087 bp.其中,5'非编码区40 bp,3'非编码区333 bp,开放读码框(ORF)长699 bp,编码232个氨基酸.分子量为26 KD,等电点为7.10.该MnSOD氨基酸序列与拟南芥MnSOD序列同源性最高为83%,从12个物种的序列比对可以看出MnSOD氨基酸序列保守性较高.该序列的Genbank注册号为AY573576(基因)和AAS77885(蛋白).将MnSOD基因与酵母表达载体pYES2连接,并进一步转化到酵母基因组中.对重组酵母INVSc1(pYES2-SOD)和对照INVSc1 (pYES2)进行干旱、高温胁迫实验.结果表明:重组酵母的抗干旱、高温能力明显高于对照,证实了来源于柽柳的MnSOD基因具有抗干旱和耐高温能力. 相似文献
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为进一步利用基因工程手段调控无花果乙烯的合成,以无花果果肉为材料提取基因组DNA,根据已报道的无花果ACC合成酶基因序列设计引物,采用PCR技术扩增得到一条约600 bp的特异片段,将该片段克隆到pGM-Teasy vector上经PCR、酶切和测序鉴定。序列分析结果表明,基因全长590 bp,编码196个氨基酸,该序列与GenBank上已登陆的Masui Dauphine-ACS1的cDNA序列同源性达99%,氨基酸同源性达98%。结果表明,成功克隆到了无花果ACS基因片段。 相似文献
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谷氨酰胺合成酶家族是高等植物体内氨态氮同化酶, 是植物体内氮利用与循环的核心构件。玉米Gln1-3基因编码叶肉细胞中的细胞质同工酶, 与全株氮向籽粒蛋白质同化与氮利用效率及产量紧密相关。本研究以玉米自交系辽白371为材料, 采用PCR与接头步移(walking)方法分离得到Gln1-3基因区域基因组DNA(gDNA)全长4 571 bp, 起始密码子至终止密码子序列长3 062 bp。将该基因在GenBank注册, 登录号为EU338535, 并进行了详细注释。该基因由10个外显子、9个内含子组成, 剪接方式主要为5′供位保守的GU与3′受位AG模式。编码的GS1蛋白由356个氨基酸组成, 分子量39.2 kD, 等电点 (pI) 为5.202。保守功能域分析表明, 氨基末端外显子2到外显子6为氨离子结合结构域, 羧基末端外显子8与外显子9构成ATP酶结构域, 在胞内行使催化功能。对50个玉米自交系Gln1-3基因重要分析区域进行了等位变异分析, 鉴定出364个等位变异, 其中313个为SNP变异, 占86%。 相似文献
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鸡IL-2的毕赤酵母表达和生物活性鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
IL-2是一种重要的免疫相关细胞因子,借助PCR去掉鸡IL-2基因片段(387bp)信号肽,连接到pPICZαA表达载体中,通过电转化转入Pichia酵母GS115菌株的感受态中,对筛选出来的阳性菌株以终浓度为1%的甲醇诱导表达,经SDS-PAGE及Western Blot分析,结果表明酵母成功分泌表达了重组鸡IL-2,分子量为17.8kD。通过Ni-NTA His Bind 柱层析,250mM咪唑的洗脱液洗脱,得到纯度较高的重组鸡IL-2,淋巴细胞增殖实验证明,重组鸡IL-2具有明显的促进淋巴细胞增殖的生物活性,为进一步研究其免疫佐剂的作用提供了实验基础。 相似文献
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玉米Gln1-3 gDNA序列分离、基因结构、保守功能域与等位变异分析 总被引：2，自引：1，他引：1
谷氨酰胺合成酶家族是高等植物体内氨态氮同化酶, 是植物体内氮利用与循环的核心构件。玉米Gln1-3基因编码叶肉细胞中的细胞质同工酶, 与全株氮向籽粒蛋白质同化与氮利用效率及产量紧密相关。本研究以玉米自交系辽白371为材料, 采用PCR与接头步移(walking)方法分离得到Gln1-3基因区域基因组DNA(gDNA)全长4 571 bp, 起始密码子至终止密码子序列长3 062 bp。将该基因在GenBank注册, 登录号为EU338535, 并进行了详细注释。该基因由10个外显子、9个内含子组成, 剪接方式主要为5′供位保守的GU与3′受位AG模式。编码的GS1蛋白由356个氨基酸组成, 分子量39.2 kD, 等电点 (pI) 为5.202。保守功能域分析表明, 氨基末端外显子2到外显子6为氨离子结合结构域, 羧基末端外显子8与外显子9构成ATP酶结构域, 在胞内行使催化功能。对50个玉米自交系Gln1-3基因重要分析区域进行了等位变异分析, 鉴定出364个等位变异, 其中313个为SNP变异, 占86%。 相似文献