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1.
提取第28期伊萨鸡(Gallus domesticus)生殖嵴原始生殖细胞(PGCs),将其与性腺基质细胞共培养,并对PGCs进行PAS(过碘酸希夫试剂)和AKP(碱性磷酸酶)染色鉴定。构建pL-CMV-eGFP慢病毒表达载体,与辅助质粒共转染293FT细胞生产病毒颗粒。将慢病毒浓缩后转染鸡胚PGCs,转染率高达24.19%。 相似文献
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原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)作为精细胞的祖细胞,广泛用于研究精子的发生。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)家族对PGCs的形成至关重要。为了探究成纤维生长因子8(FGF8)的具体功能,本研究通过构建家鸡(Gallus domesticus)FGF8的短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)慢病毒干扰载体,获得稳定低表达FGF8的鸡胚胎干细胞株,并进一步研究FGF8在鸡胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)向PGCs分化中的功能。根据家鸡FGF8的转录本设计3个RNA干扰靶点,连接到p GMVL-SC5干扰载体,瞬时转染鸡胚成纤维细胞DF1。以q RT-PCR技术检测各靶点对FGF8的干扰效率,将干扰效率最佳的sh RNA载体进行慢病毒包装。在以慢病毒敲低FGF8的ESCs中进行视黄酸(retinoic acid,RA)诱导,观察各组细胞形态变化,收集不同时间的各组细胞,利用q RT-PCR、间接免疫荧光以及流式细胞术等方法,分析检测生殖相关标记基因的表达变化和PGCs形成效率。结果表明,FGF8慢病毒干扰载体构建成功,分别命名为sh FGF8-1、sh FGF8-2、sh FGF8-3,其中sh FGF8-2干扰效率最佳。将sh FGF8-2进行慢病毒包装,获得滴度为5×10~(8 )TU/m L、干扰效率为(70±4.31)%的慢病毒载体。对于FGF8表达抑制的ESCs,体外RA诱导4 d后,PGC样细胞显著增加,ESC标记基因Nanog表达极显著下调(P0.01),PGC标记基因Cvh、C-kit表达极显著上调(P0.01)。此外,免疫荧光及流式细胞术分析结果也进一步证实,诱导4 d后与对照组比较,FGF8低表达使CVH~+PGCs比例显著增加(P0.01)。本研究成功构建了稳定转染鸡胚胎干细胞的FGF8特异性慢病毒载体,并证实FGF8在体外参与调控PGCs的形成。 相似文献
3.
家禽的原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)是形成精子和卵子的前体细胞,可在性成熟的家禽体内生成精子和卵子,因此家禽PGCs可应用于以PGCs为基础的现代保种技术、转基因技术以及家禽的发育生物学等研究领域,具有重要的科研与应用价值。本研究使用Nycodenz密度梯度离心法在孵化至13~15期的鸡(Gallus gallus)胚血液中分离纯化鸡胚的PGCs,经显微注射针分拣后,PGCs的纯度可达99%以上,细胞直径主要集中于13~15μm;将所分离纯化的PGCs分别通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)染色、高碘酸希夫氏(periodic acid-schiff,PAS)染色及阶段特异性胚胎表面抗原-1(stagespecific embryonic antigens-1,SSEA-1)免疫化学染色进行鉴定,染色结果均出现PGCs所特有的反应;使用活细胞荧光染料PKH26对分离纯化的PGCs进行标记,成功标记的PGCs在荧光显微镜下可观测到红色荧光,将约200个标记后的PGCs,通过腹主动脉注入孵化至14~16期的受体鸡胚中,在孵化至第8天的鸡胚性腺冷冻切片中,可检测到供体PGCs的存在,这一结果表明,所分离纯化的PGCs可定植于受体鸡胚的性腺中。本研究为以PGCs为基础的种质资源保存研究以及转基因技术研究提供了基础资料。 相似文献
4.
作为精原细胞和卵原细胞的祖细胞,由于其全能性的特点可作为体外胚胎发育研究的良好模型,而禽类独特的生理和发育特点使得其原始生殖细胞(PGCs)在转基因研究中有着巨大价值。本研究通过对孵化5.5d的梅岭土鸡(Gallus domesticus)胚生殖腺中分离得到的PGCs,接种于24孔培养板在温度37℃、95%空气和5%CO2的培养箱中进行体外培养;借助组织化学及免疫组织化学染色对PAS(高碘酸希夫氏染色)、AKP(碱性磷酸酶染色)、SSEA-1(胚胎阶段特异性表面抗原-1)以及TERT(端粒酶反转录酶)进行了鉴定;采用荧光定量PCR技术对PGCs阶段特异性表达基因Cvh(鸡Vasa基因同系物)、Cdh(鸡死端同系物)、Dazl(类无精症缺失)和干细胞多能性相关基因PouⅤ(POU结构域Ⅴ类转录因子1)、Nanog(nanog同源异型盒)、Sox-2(性别决定区Y盒2)基因表达进行了分析;利用脂质体介导法,将绿色荧光蛋白(pEGFP-N3)基因导入鸡PGCs细胞,结果表明,PGCs集落有典型的鸟巢状结构,且PAS、AKP、SSEA-1以及TERT染色阳性;PGCs阶段特异性表达基因Cvh、Cdh、Dazl和干细胞多能性相关基因PouV、Nanog和Sox-2在鸡PGCs中均远远高于在鸡成纤维细胞(CEF)中的表达;转染24h后,绿色荧光蛋白均匀的充满细胞质和细胞核,转染效率最高为16%,研究结果为禽类PGCs分化过程中基因调控及基因标记、转基因动物克隆等技术提供了良好基础。 相似文献
5.
恒定链(invariant chain,Ii)是脊椎动物重要的免疫分子,在主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ类分子递呈抗原中起重要作用。为研究鸡(Gus gallus)Ii与MHCⅡ类分子的关系,本研究构建了4个沉默Ii基因的慢病毒表达载体,并比较了其干扰效果。首先,用自行设计合成的4条鸡Ii基因干扰序列,分别经一步退火法获得双链短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA),并将其用双酶切法插入慢病毒载体pLL3.7。4个构建的慢病毒重组载体经酶切和测序鉴定,分别命名为pLLIi-shRNA236、pLL-Ii-shRNA376、pLL-Ii-shRNA527和pLL-Ii-shRNA539。然后把这些重组载体分别转染293T细胞(转染腺病毒E1A基因(lethal infection gene)的人肾上皮细胞系),进行病毒包装,再用包装的慢病毒感染鸡源巨噬细胞HD-11。结果表明,重组载体感染的293T细胞表达绿色荧光蛋白,用包装的慢病毒接种293T细胞,其滴度达2.2×107~5.1×107TU/mL;接种HD-11细胞的感染率均达到95%以上。最后用荧光定量PCR方法检测其沉默鸡源巨噬细胞HD-11的鸡Ii mRNA的效率,与对照组相比,4个重组慢病毒干扰效率分别为37%、52%、88%和78%;其中,pLL-Ii-shRNA527的干扰效率最高。综上所述,本研究从4个构建的重组载体中筛选出1个高效沉默鸡巨噬细胞Ii基因重组载体,并提示shRNA序列是决定沉默特定基因的关键。实验结果为研究鸡Ii在递呈抗原中与其他免疫分子的关系提供了基础资料。 相似文献
6.
将鸡Ⅱ型干扰素(ChIFNγ)基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中，获得重组转移载体pSY681-ChIFNγ。将pSY681-ChIFNγ转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组，产生表达ChIFNγ的重组鸡痘病毒rFPV-ChIFNγ。在含有X-ga1的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选，通过PCR和间接免疫荧光等实验证实获得纯化的、表达ChIFNγ的重组鸡痘病毒。将在鸡胚成纤维细胞中培养72h的rFPV-ChIFNγ上清接种小鼠成纤维细胞(L929)，通过细胞病变抑制实验证明重组ChIFNγ具有抑制水疱性口炎病毒复制的活性，培养上清的抗病毒效价为2048U／mL。 相似文献
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利用shRNA真核表达载体干涉雌性鸡胚性腺中芳香化酶基因(CYP19A1)的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究通过把构建的短发夹结构RNA(shRNA)真核表达载体导入鸡胚,检测鸡胚性腺分化期质粒载体在鸡胚体内代谢情况及雌性鸡胚性腺中芳香化酶基因(CYP19A1)mRNA表达效率,进而探讨利用该方法在鸡胚体内进行特定基因干涉的可行性.实验针对CYP19A1基因构建了4条特异性表达载体,一条非特异性表达载体.每个实验组选取45个新鲜种蛋作为实验材料进行胚盘下腔注射,并设立空白对照组.鸡胚发育12d时,检测各处理组鸡胚肝脏组织中质粒存在情况,并取其左侧性腺组织进行目标基因的荧光定量分析.研究结果表明,导入组在12日胚龄时所有鸡胚基因组中均可检测到绿色荧光蛋白基因(EGFP);荧光定量结果显示,导入特异性表达载体cyp-580、cyp-1083和cyp-1295后,对应雌性鸡胚性腺CYP19A1 mRNA表达效率显著低于空白对照组,干涉效率分别为:73％、52％和85％;特异性表达载体cyp-1403组CYP19A1mRNA表达效率与空白对照组相比有所降低但无显著性差异.本实验为诱导鸡胚性反转提供了新方法并建立了鸡胚发育期特定基因体内干涉新平台. 相似文献
8.
慢病毒表达载体具有感染宿主广和基因组整合效率高的优点,因此在转基因动物的制备中得到广泛应用.本研究构建了含有红色荧光和绿色荧光的慢病毒表达载体,用磷酸钙转染法将三质粒慢病毒载体转染293T细胞,转染效率达72%,降低了慢病毒的生产成本.在进行慢病毒的浓缩与纯化时,通过超速度离心和超滤相结合的方法,在150 mL的慢病毒原液中经纯化后得到80 μL效价为2.38×109 TU/mL的慢病毒颗粒.获得的高效价双荧光慢病毒表达载体可为后续双基因转基因动物的制备提供可靠的制作途径与检测基础. 相似文献
9.
对鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）的鸡胚、鸡胚肾细胞等培养系统进行研究；对病毒包涵体、病毒形态进行观察；对病毒毒价进行测定。结果，病毒在鸡胚绒毛尿囊膜产生痘斑和坏死灶，鸡胚发育不良并致死；鸡胚肾细胞稳定地产生合胞体等细胞病变；绒毛尿囊膜切片经Ｈ－Ｅ梁色，可观察到紫红色嗜酸性核内包涵体充满细胞核；病毒细胞培养物粗提后用负染法电镜观察，绒毛尿囊膜用超薄切片法电镜观察，均可见到病毒颗粒，病毒直径约２４０～３００ｎｍ，核衣壳直径约１００～１４０ｎｍ，外有圆形或椭圆形囊膜；经微量培养系统测定，病毒毒价为１０６．１２ＴＣＩＤ５０／０．０５ｍＬ。 相似文献
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原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)作为配子的原始祖细胞,参与胚胎生殖细胞的发育过程。类固醇激素通路中3β羟基类固醇脱氢酶2(3β-hydroxysteroid dehydrogenase 2,Hsd3β2)能促进细胞分化,但其对原始生殖细胞的形成具体调控机制还不得而知。本研究旨在通过构建类固醇激素合成过程中关键基因Hsd3β2的短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)干扰载体并研究其对鸡(Gallus gallus)胚胎干细胞分化为原始生殖细胞的影响。通过慢病毒包装Hsd3β2感染鸡胚胎干细胞并进行RNA干扰(RNA interference,RNAi)诱导,分别于2、4、6 d观察细胞形态变化并收集细胞样品,q RT-PCR检测Hsd3β2、生殖标记基因鸡Vasa基因同系物(chicken vasa homologue,Cvh)、鸡KIT原癌基因受体酪氨酸激酶(chicken KIT proto-oncogene receptor tyrosine kinase,C-kit)及甾类激素合成信号通路下游基因细胞色素P450亚酶(cytochrome P450 subenzyme,Cyp1a1)、葡萄糖醛酸转移酶1A1(UDP glucuronosyltransferase family 1member A1,Ugt1a1)和17β羟基类固醇脱氢酶7(17beta-hydroxysteroid dehydrogenase7,Hsd17b7)表达;流式细胞检测诱导产生类胚体阳性率;在鸡胚孵化过程中鸡胚注射慢病毒干扰载体,孵化4.5 d后收集生殖嵴,q RT-PCR检测Cvh、C-kit及下游基因Cyp1a1、Ugt1a1和Hsd17b7表达;流式细胞分析原始生殖细胞生成效率。本实验成功构建sh-Hsd3β2慢病毒载体,挽救实验表明过表达Hsd3β2能使sh RNA引起的基因表达下降回升;在体外诱导过程和鸡胚孵化过程中,q RT-PCR结果表明干扰Hsd3β2后,甾类激素合成信号通路中的下游基因的表达显著下调(P0.01);在RA诱导实验过程中,随诱导时间推进,类胚体数量逐渐增加。Hsd3β2抑制后,类胚体形成数量减少。Cvh、C-kit在诱导过程中上调表达,但Hsd3β2干扰后,其表达显著降低(P0.01),流式细胞分析表明干扰Hsd3β2后,诱导4d后产生类胚体阳性细胞(3.27±0.19)%显著低于对照组(7.39±0.09)%;体内实验结果表明干扰Hsd3β2后,Cvh、C-kit表达显著降低(P0.01),生殖细胞数量显著减少。本研究结果表明Hsd3β2能通过甾类激素合成信号通路促进原始生殖细胞的形成,为研究该通路对原始生殖细胞形成具体机制提供理论基础。 相似文献
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本文从第19期（孵化68~72h）鸡（Gallus domesticus）生殖嵴分离到原始生殖细胞（PGC），通过PGC-体细胞共培养进行了原代和传代培养，并对PGC做了c-kit免疫组化鉴定。通过改变PGC的体外培养条件，诱导PGC分化成了神经样细胞、上皮样细胞和骨骼肌样细胞，并分别通过神经元特异性烯醇化酶（NSE）和角蛋白（keratin）免疫组化进行了分化细胞的鉴定，均呈阳性。结果表明培养的鸡胚PGC在体外可分化成神经样细胞、上皮样细胞和骨骼肌样细胞。 相似文献
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鸡胚原始生殖细胞的分离、培养及鉴定 总被引：2，自引：2，他引：2
采用Ficoll密度梯度离心法分离第19期(孵化68～72 h)艾维茵鸡(Gallus domesticus)生殖嵴原始生殖细胞(PGC)，通过体细胞-PGC共培养进行了原代和传代培养，对PGC进行了碱性磷酸酶(AKP)和过碘酸雪夫氏反应(PAS)鉴定，并用细胞增殖核抗原(PCNA)免疫细胞化学检测了传代于鸡胚饲养层上PGC的增殖活性。培养的PGC经AKP和PAS鉴定均为阳性，AKP阳性为红棕色，PAS阳性为深红色，PCNA染色显示PGC集落为红棕色，表明PGC处于增殖状态。同时比较了不同体外培养条件(5%~20%胎牛血清(FCS), ITS培养液(M199+ 10 μg/mL 胰岛素+5 μg/mL转铁蛋白+3×10-8 mol/L亚硒酸钠), 条件培养液, 15%FCS+ITS, 15%FCS+40% 条件培养液)下PGC增殖情况。发现未经密度梯度离心的PGC生长较离心的PGC好，且5%FCS在原代培养中起较好的促增殖作用；而传代培养时在不同培养条件下，5%FCS组或ITS组形成的PGC集落的直径较大，而仅用单纯的条件培养液效果并不明显。结果表明除鸡胚饲养层可作为PGC增殖的支持体系外，在体细胞-PGC共培养方式下5%FCS或单独的ITS也可作为PGC体外增殖的一种培养体系。 相似文献
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microRNA对细胞的增殖和分化有着重要的调节作用,从大白猪(Susscrofa)基因组DNA上扩增microRNA-378-1前体序列,经XhoⅠ酶切后回收相应片段,连接到pEGP-miR载体中,构建重组载体pEGP-miR-378-1,转染猪胎儿成纤维细胞系(PEF),通过荧光观察转染效率及报告基因的表达效率,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)测定细胞内microRNA-378-1的表达活性。结果表明,成功地构建了重组载体pEGP-miR-378-1;荧光观察转染后的细胞,显示有较高的转染效率,报告基因有较高的表达效率;QRT-PCR结果显示,实验组和对照组microRNA-378-1表达显著提高,实验组和对照组细胞间差异极显著(P<0.01);为制备转基因动物研究microRNA-378-1功能提供技术平台。 相似文献
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鸡输卵管组织特异性分泌表达载体的构建和表达 总被引：4，自引：0，他引：4
摘要：为了实现外源基因在鸡(Gallus gallus )输卵管上皮细胞内的特异性分泌表达，采用RT-PCR的方法扩增了鸡溶菌酶基因的450 bp的cDNA片段，该片段保留了5ˊ端信号肽编码序列。将该片段插入到含有1.2 kb卵清蛋白5ˊ调控序列的特异性表达载体pOVA-GFP中，与绿色荧光蛋白基因形成融合基因，使融合蛋白具有分泌功能。新构建的分泌表达载体pOVALG转染鸡胚成纤维细胞和大鼠乳腺上皮细胞系SHZ-88后，成功地检测到了绿色荧光蛋白的表达。 相似文献
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自PGCs分离克隆哺乳动物ES细胞的研究进展 总被引：1，自引：1，他引：1
原始生殖细胞（PGCs）是哺乳动物各级生殖细胞的祖细胞。PGCs在体外合适的培养条件下，可自我更新，形成具有ES特征的多能干细胞系，称作胚胎生殖细胞（EG细胞）。EG细胞高度类似于ES细胞，PGCs可作为哺乳动物ES细胞分离克隆的一个有效替代途径，本研究对自PGCs分离克隆哺乳动物ES细胞的研究进展及其相关问题作一简述。 相似文献
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摘要：为构建重组人红细胞生成素（hEPO）真核表达载体，应用PCR及人工合成方法获得除第一内含子的hEPO基因组基因，并将其插入载体pIRES2-AcGFP1，成功构建hEPO基因和AcGFP1共表达载体phEPO-IRES-AcGFP1，然后用脂质体法使该载体转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）及山羊成纤维细胞，于转染后48h在荧263光显微镜下观察到绿色荧光。经G418筛选，在荧光显微镜下发现成簇的绿色荧光细胞，说明重组质粒被成功导入细胞并表达AcGFP1，为鉴定hEPO转染成功与否及阳性细胞筛选提供了方便。 相似文献
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α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-LA)是哺乳动物乳汁中一种重要的蛋白质,富含机体必需氨基酸和支链氨基酸,其极佳的氨基酸比例、易吸收性以及功能特异性,使得α-LA在婴幼儿个体正常生长中具有重要的意义。本实验旨在构建人α-乳清蛋白真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,将其转染至猪(Susscrofa)的成纤维细胞,获得稳定表达人α-LA的细胞。根据猪基因密码子偏爱性优化并合成人α-乳清蛋白基因mRNA序列opLA,并将其定向克隆入pIRES2-Zs Green1真核表达载体,双酶切及测序方法鉴定重组载体;脂质体介导的方法将载体转染入培养的猪成纤维细胞,荧光显微镜下观察转染效果,G418抗性筛选重组细胞;RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果表明,通过酶切以及测序鉴定得到的重组载体pIRES2-Zs Green1-opLA构建成功;荧光显微镜下观察,转染了pIRES2-Zs Green1-opLA和pIRES2-Zs Green1空载体的细胞均发出绿色荧光,且荧光多集中于细胞核;筛选重组细胞的最小G418浓度为400ng/μL;RT-PCR法检测到与目的基因大小一致的片段,而未转染组和转染空载体组均未检测到。本实验成功构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,并获得稳定表达目的基因的猪成纤维细胞,该细胞可作为进一步研究转基因克隆猪的供体细胞。 相似文献
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摘要：本实验从质粒pGEM-HA中扩增H5N1亚型禽流感病毒HA基因，构建转移载体pFastBacHT-HA并与E.coliDH10Bac中的Bacmid质粒重组，构建重组转座质粒rBacmid-HA。在脂质体介导下将rBacmid-HA转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。在sf9昆虫细胞中表达HA蛋白，通过SDS-PAGE、Western blot和血细胞吸附实验鉴定重组蛋白。结果显示重组HA蛋白分子量约为66kDa，该蛋白与AIV H5亚型鸡血清发生特异性反应，与H7、H9亚型鸡血清不反应，转染重组杆状病毒后的细胞能吸附鸡的红血球，证明HA基因在sf9昆虫细胞中获得了正确表达，不仅具有型特异性，而且有良好的生物反应性。 相似文献