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1.
《福建农业学报》2021,(6)
【目的】建立一种新型鹅星状病毒(New goose astrovirus,NGAstV)的RT-PCR检测方法。【方法】根据ORF2基因序列,利用Oligo 7软件设计并筛选出特异性扩增引物,通过优化扩增条件,建立检测新型鹅星状病毒的RT-PCR方法,对其进行特异性及敏感性检验,并在临床上进行初步应用。【结果】RT-PCR最佳反应体系为:Premix 10μL,ORF2上下游引物浓度10μmol·L~(-1)各1μL,模板3μL,无菌去离子水补足至20μL。最佳反应程序为:94℃2 min;94℃30 s、55℃15 s、72℃15 s,30个循环;72℃10 min。该方法对新型鹅星状病毒能扩增出特异性片段,对其他鹅常见病原无特异性扩增;检测灵敏度为62 fg·μL~(-1)。对45份临床样品进行检测,结果检测出15份阳性样品,阳性率为33.33%。【结论】建立的新型鹅星状病毒RT-PCR方法特异性强、稳定性好,可作为新型鹅星状病毒快速检测和流行病学调查的实用技术。 相似文献
2.
【目的】建立鸭源新城疫病毒逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)快速检测方法,为鸭源新城疫病毒的快速诊断提供支持。【方法】选取鸭源新城疫病毒NP基因的相对保守区序列,利用Primer Explorer V4在线软件设计了3对RT-LAMP引物,以鸭源新城疫病毒SDFCH株RNA为模板进行RT-LAMP反应,通过对反应温度、时间及反应体系各组分浓度的筛选,优化反应体系和反应条件,然后对该方法的灵敏性和特异性进行检测(以RT-PCR方法为对照),并将其应用于临床病料检测。【结果】优化的RT-LAMP反应体系能够在63℃下1h内实现目标核酸区段的大量扩增,反应结果可直接用肉眼判断;建立的鸭源新城疫病毒RT-LAMP检测方法特异性较强,灵敏度较高,与其他病毒,如H9N2亚型禽流感病毒(AIV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、禽偏肺病毒(aMPV)、传染性支气管炎病毒(IBV)等的核酸无交叉反应,可检测到1×10-3稀释度的目标RNA(0.1pg/μL),较普通RT-PCR的灵敏性高10倍;利用建立的鸭源新城疫病毒RT-LAMP检测方法对24份疑似鸭源新城疫样品的阳性检出率为41.7%。【结论】建立的鸭源新城疫病毒的RT-LAMP检测方法,具有快速、准确、特异性强、灵敏度高的特点。 相似文献
3.
【目的】建立一种适用于H5亚型禽流感病毒（AIV）的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）可视化快速检测技术,为控制疫情扩散、减少经济损失争取了时间。【方法】根据GenBank中H5亚型AIV血凝素（HA）基因序列,设计一套针对HA基因6个区域的4条特异性引物,在反应之前向反应液中加入荧光试剂（Calcein/MnCl2混合液）,然后对反应条件和体系进行优化。【结果】优化的RT-LAMP技术操作简便迅速,常规水浴锅中50 min可完成,能特异性地检测出H5亚型AIV,但对其他HA亚型AIV、禽呼吸道病原体无交叉扩增反应,灵敏度是常规RT-PCR的10倍;反应结束后无需打开反应管盖,即可根据反应液的颜色变化对结果进行判定。【结论】建立的H5亚型AIV RT-LAMP可视化检测技术具有简便、快速、特异等特点,可在设备有限的基层兽医站及养殖场对H5亚型AIV进行快速初步诊断。 相似文献
4.
《广东农业科学》2020,(4)
【目的】建立甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)的RT-LAMP检测方法,为SCSMV的检测提供技术支持。【方法】根据甘蔗线条花叶病毒外壳蛋白基因的保守序列设计特异引物,优化RT-LAMP的反应条件,对比分析RT-LAMP的检测灵敏度和特异性;并在RT-LAMP反应产物中加入SYBR GREEN I进行可视化检测,方便快速判定结果。【结果】成功建立了一种用于检测SCSMV的RT-LAMP方法,可在60 ～ 63 ℃下60 min完成对SCSMV的检测,且具有较高的灵敏度,比传统RT-PCR高100 倍,最低检测RNA浓度为167.9×10~(-5) ng。此外,该方法具有较高的特异性,可特异检测SCSMV。【结论】建立了一种灵敏、简便、快速的SCSMV RT-LAMP检测方法并用于田间甘蔗样品的检测。 相似文献
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【目的】建立一种适用于H5亚型禽流感病毒（AIV）的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）可视化快速检测技术,为控制疫情扩散、减少经济损失争取了时间。【方法】根据GenBank中H5亚型AIV血凝素（HA）基因序列,设计一套针对HA基因6个区域的4条特异性引物,在反应之前向反应液中加入荧光试剂（Calcein／MnCl2混合液）,然后对反应条件和体系进行优化。【结果】优化的RT-LAMP技术操作简便迅速,常规水浴锅中50min可完成,能特异性地检测出H5亚型AIV,但对其他HA亚型AIV、禽呼吸道病原体无交叉扩增反应,灵敏度是常规RT-PCR的10倍;反应结束后无需打开反应管盖,即可根据反应液的颜色变化对结果进行判定。【结论】建立的H5亚型AIVRT-LAMP可视化检测技术具有简便、快速、特异等特点,可在设备有限的基层兽医站及养殖场对H5亚型AIV进行快速初步诊断。 相似文献
7.
【目的】建立甘蔗线条花叶病毒（Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV）的 RT-LAMP 检测方法,为 SCSMV 的检测提供技术支持。【方法】根据甘蔗线条花叶病毒外壳蛋白基因的保守序列设计特异引物,优化 RT-LAMP 的反应条件,对比分析 RT-LAMP 的检测灵敏度和特异性;并在 RT-LAMP 反应产物中加入 SYBR GREEN I 进行可视化检测,方便快速判定结果。【结果】成功建立了一种用于检测 SCSMV 的 RT-LAMP 方法,可在 60 ~ 63 ℃下 60 min 完成对 SCSMV 的检测,且具有较高的灵敏度,比传统 RT-PCR 高 100 倍,最低检测RNA 浓度为 167.9×10-5 ng。此外,该方法具有较高的特异性,可特异检测 SCSMV。【结论】建立了一种灵敏、简便、快速的 SCSMV RT-LAMP 检测方法并用于田间甘蔗样品的检测。 相似文献
8.
《福建农业学报》2021,(8)
【目的】建立快速检测甘薯卷叶病毒重组酶聚合酶(RPA)等温扩增方法,为甘薯卷叶病毒(sweet potato leaf curl virus,SPLCV)提供快速、简便的检测方法。【方法】根据甘薯卷叶病毒AV1基因的保守区段设计RPA检测用引物,并对引物进行筛选,对反应条件和反应体系进行优化,建立SPLCV的RPA检测方法。【结果】建立的甘薯卷叶病毒RPA方法快速简便,39℃反应20 min完成检测;灵敏度高,最低检测限为10 pg·μL~(-1);特异性强,与感染番茄黄化卷叶病毒(TYLCD),甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯G病毒(SPVG)、甘薯退绿矮化病毒(SPCSV)等4种DNA病毒均无交叉反应。【结论】建立的RPA检测方法具有快速、灵敏、特异性强、不需要特殊仪器等优点,适合田间甘薯卷叶病毒样品的快速检测。 相似文献
9.
《福建农业学报》2021,(7)
【目的】建立一种快速、敏感的ENTV-2检测方法,用于ENT的早期诊断与流行病学调查。【方法】通过生物信息学的方法将ENTV-2与ENTV-1、ERVs、JSRV进行比对,寻找ENTV-2的保守序列并设计1对特异性引物,建立SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,对所建立的PCR反应条件进行优化,将PCR扩增产物连接T载体构建的阳性质粒作为标准品,对SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。【结果】建立的检测ENTV-2 qPCR方法标准曲线呈现良好的线性关系(R~2=0.992);该方法的特异性良好,对ENTV-2可以产生特异性扩增曲线,与ENTV-2高度同源的ERVs没有交叉反应,也无法扩增羊口疮病毒(ORFV)、绵羊肺炎支原体(Mo)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)等常见病原;敏感性良好,最低检测限度为7.5×10~2 copies·μL~(-1),敏感性可达常规PCR检测方法的100倍;批内、批间的变异系数CV1%,重复性良好;对81份临床样品的阳性检出率为17.3%。【结论】建立的SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR方法特异性良好,敏感性较高,重复性良好,为山羊地方性鼻内肿瘤的早期、快速检测提供了技术支持。 相似文献
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[目的]建立一种快速、敏感、特异的检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）方法,为诊断与监测BVDV 提供准确可靠工具。[方法]根据GenBank公布的BVDV序列,在其保守序列区域设计了一套 LAMP引物,优化了反应时间与反应温度,建立了检测 BVDV的 RT-LAMP方法。[结果]该方法能在56℃等温条件下40分钟完成扩增,扩增结果可通过凝胶电泳梯形带判定。该方法具有良好的特异性和敏感性,最低能检测到3.74×100 copies/μl的病毒 RNA,而且与其他病毒无交叉反应。[结论]该方法能用于牛病毒性腹泻病毒的诊断与监测。 相似文献
12.
减蛋综合征病毒环介导等温扩增检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank登录的减蛋综合征病毒(EDSV)六邻体基因的保守区,设计了3对环介导等温基因扩增(LAMP)引物,优化反应体系,并对其灵敏性、特异性进行验证.结果表明:LAMP优化后的反应体系为外引物浓度0.1μm01·L-1,内引物浓度0.8 μmol·L-1,环引物浓度0.4μmol·L-1,Mg2+浓度8.0 ... 相似文献
13.
以芒果基因组DNA为模板,选择正交设计试验对控制DNA保守序列多态性——聚合酶链式反应(CDDP-PCR)的4个因素(模板DNA浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Mg~(2+)DNA聚合酶用量)进行正交试验,构建了较佳的芒果CDDP-PCR反应体系,含0.50 U Mg2+DNA聚合酶、0.40 mmol·L~(-1)d NTPs、1.00μmol·L~(-1)引物、0.50 ng·μL~(-1)模板DNA,加双蒸水使得总体积达20.00μL.对比四因子对PCR反应的影响,影响最强的因素是含Mg2+的DNA聚合酶,影响最弱的因素是模板DNA.利用供试的20个芒果品种验证了该体系的稳定性和可行性,21条CDDP引物均可扩增出明晰整齐的条带. 相似文献
14.
[目的]建立一种同步检测肉品中金黄色葡萄球菌与沙门氏菌的双重聚合酶链式反应.[方法]采用7.5;氯化钠肉汤和GN增菌剂分别对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌进行增菌,根据金黄色葡萄球菌的femA基因与沙门氏菌的invA基因设计引物,通过PCR反应对目标基因进行扩增,并对反应体系进行优化.[结果]特异性实验显示引物特异性良好,经双重体外扩增体系优化显示条带清晰,无非特异性的扩增条带.[结论]双重PCR是一种灵敏度高的快捷检测方法,可为这两种致病菌的同时检出提供新途径. 相似文献
15.
参照GenBank收录的猪圆环病毒2型(PCV2)基因组全序列选择保守区域设计合成了引物及其探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqM an荧光定量PCR检测方法.用建立的检测方法对临床采集的组织病料进行了检测,并与常规PCR检测方法作比较.结果显示,所建立的方法灵敏度可达3×101拷贝.μL-1,比常规PCR检测方法灵敏度高10倍,而与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)没有交叉反应,具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点,适合于PCV2的流行病学调查和临床诊断. 相似文献
16.
为筛选可用于长柱金丝桃遗传分析的最适ISSR-PCR反应体系,采用正交试验对影响ISSR-PCR反应的5个重要因素(Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg~(2+)、引物和模板DNA浓度)进行4水平正交优化,并对退火温度、循环次数进行筛选。结果表明,20μL ISSR-PCR最佳反应体系包括Taq DNA聚合酶1.0 U、dNTPs 0.2 mmol·L-1、Mg2+3.0 mmol·L~(-1)、引物0.4μmol·L~(-1)、DNA模板40 ng,对ISSR-PCR反应的影响程度由大到小为:Taq DNA聚合酶、引物、Mg2+、dNTPs、DNA模板;引物UBC822的最佳退火温度52.7℃,最佳循环次数41,利用优化的反应体系从61条引物中筛选出12条稳定性好、多态性高的引物,验证试验表明优化的反应体系具有较高的稳定性。 相似文献
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[目的]建立1种快速、灵敏、特异的检测猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。[方法]根据JEV E基因序列的保守区6个位点设计了4条特异性LAMP引物,以JEV阳性样品RNA为模板进行一步法扩增,并对反应条件和反应体系进行了优化。[结果]该方法具有较高的灵敏度,其检测极限为0.5 pg;特异性试验表明其具有较高的特异性,对其他病毒性病原体均无扩增反应。与RT-Nested-PCR相比,2种方法检出率的符合率为90.9%。反应结束后可以通过添加化学发光剂进行可视化观察,大大缩短了检测时间。该方法无需特殊仪器,只需在水浴锅中进行,是一种适于基层的简便、灵敏、快速的猪JE的检测方法。[结论]成功建立了猪流行性乙型脑炎RT-LAMP方法,并在临床上进行了初步应用。 相似文献
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杜鹃花属植物基因组DNA RAPD-PCR反应体系的优化 总被引：1，自引：0，他引：1
试验通过系统比较研究,确立了杜鹃属植物RAPD-PCR的最佳反应体系,即20μL反应体系中:模板DNA(10 g.L-1)1.5μL;10×PCR buffer 2μL;Taq酶(0.5 U.μL-1)0.3μL;引物(0.8μmol.L-1)4μL;MgCl2(25 mmol.L-1)1.8μL;dNTPs(dATP、dCTP、dTTP、dGTP各含1.0 mmol.L-1)0.6μL。经试验验证,该反应体系重复性高,扩增条带亮度均匀,弥散现象少。 相似文献
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鹅源性成分PCR检测方法的建立 总被引：3，自引：0，他引：3
[目的]建立一种检测鹅源性成分的PCR方法。[方法]以15种动物的DNA为模板,利用鹅的特异性引物进行PCR反应,PCR产物用1．4％的琼脂糖凝胶电泳检测并测序,检测引物的特异性和敏感性。[结果]通过PCR反应从鹅样品中扩增到了304bp的目的片段,其他物种火鸡、鸭、鸽鹑、鸵鸟、鸽子、鸡、马、牛、羊、猪、狗、驴、猫、鱼和空白对照则无目的片段,表明该引物的特异性良好。鹅组织PCR产物的核苷酸序列与GenBank中检索到的相应序列基本符合,相似性为98％;PCR检测方法的检测灵敏度为0．01％。[结论]该PCR检测方法特异性强、准确性好、灵敏度高、可重复性好,为明确食品与饲料的成分和来源,预防禽流感的传播提供了有效的分子生物学捡测方法. 相似文献