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人工抗凋亡蛋白PTD-Bcl-x L能保护多种因素引起的细胞异常凋亡,为了获得高纯度Bcl-x L与PTD(Protein transduction domains)的融合蛋白,首先采用TRIzol法提取SD大鼠肝脏总RNA,将RNA反转录为c DNA,设计引物以c DNA为模板,PCR扩增Bcl-x L基因,构建p UM19-T-Bcl-x L质粒,并对质粒双酶切鉴定和测序鉴定;其次设计包含PTD序列的Bcl-x L引物,以测序正确的p UM19-T-Bcl-x L质粒为模板,PCR扩增PTD-Bcl-x L序列,将扩增序列克隆入p ET28a载体,构建PTD-Bcl-x L蛋白的原核表达质粒p ET28a-PTD-Bcl-x L,并对p ET28a-PTD-Bcl-x L载体双酶切鉴定和测序鉴定;将p ET28a-PTD-Bcl-x L重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对IPTG诱导融合蛋白表达的浓度和诱导时间进行了优化;SDS-PAGE分析表达蛋白的可溶性情况,在变性条件下用Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白;最后用SDS-PAGE、Western Blot及质谱对融合蛋白进行鉴定。结果表明:双酶切p UM19-T-Bcl-x L质粒出现约774 bp大小条带,p UM19-T-Bcl-x L质粒测序结果与NCBI数据库比对序列一致,表明成功构建p UM19-T-Bcl-x L质粒;双酶切p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒出现约744 bp大小条带,p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒测序结果与预期序列一致,表明成功构建了p ET28a-PTD-Bcl-x L原核表达载体;在IPTG诱导下p ET28a-Bcl-x L重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出36 k Da大小蛋白,最优IPTG诱导浓度为0.1 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为6 h;SDS-PAGE电泳显示融合蛋白主要出现在菌液超声后的沉淀里,以包涵体形式表达,经Ni-NTA琼脂纯化获得了高纯度的融合蛋白;Western Blot和质谱鉴定证明IPTG诱导表达蛋白和纯化的融合蛋白为PTD-Bcl-x L蛋白。纯化得到了PTD-Bc L-x L融合蛋白,推进了PTD-Bcl-x L蛋白在猪、牛等家畜精液冷冻保存的应用进程。 相似文献
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O型口蹄疫病毒VP1蛋白的原核表达及功能鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDV VP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析.结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性.结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础. 相似文献
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为了进一步研究MAPKK激酶的生理功能,利用RT-PCR技术扩增了DsMAPKKK的开放阅读框序列,并利用T4连接酶与质粒pGS21a连接,构建了原核表达载体pGS21a-DsMAPKKK。将该重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导成功表达了融合蛋白。经SDS-PAGE检测,融合蛋白在上清和包涵体中均存在。可溶性蛋白经过GST柱纯化,电泳分析结果表明,在68kD左右有单一的蛋白条带,说明融合蛋白得到有效纯化。蛋白印迹结果显示在68kD左右有明显的杂交条带,初步证明纯化的蛋白就是带有GST标签的MAPKK激酶。DsMAPKKK的成功表达与纯化,为深入探讨DsMAPKK激酶的性质及功能打下了坚实的基础。 相似文献
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旨在克隆藏猪胰岛素样生长因子1(IGF-1)的成熟肽基因,并进行原核表达的研究。提取藏猪肝脏组织RNA,通过RT-PCR扩增出藏猪IGF-1全长基因,构建重组质粒p MD19-T-IGF-1,以p MD19-T-IGF-1质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽序列并构建成熟肽p ET-32α-IGF-1表达质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3),对IPTG诱导剂浓度和诱导时间进行优化,Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白后采用Western Blot对其鉴定。结果显示,IGF-1成熟肽基因(315 bp),成功构建了成熟肽p ET-32α-IGF-1原核表达质粒;重组大肠杆菌BL21-IGF-1以包涵体形式表达出分子量约31 k Da融合蛋白,最优IPTG浓度为0.5 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为10 h;纯化获得了高纯度的融合蛋白,经鉴定IPTG诱导表达和纯化的蛋白为IGF-1融合蛋白。结果表明,成功构建了表达质粒p ET32α-IGF-1及获得重组大肠杆菌BL21-IGF-1,表达了藏猪IGF-1成熟肽融合蛋白及该蛋白具有抗原抗体反应活性。 相似文献
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番木瓜畸形花叶病毒(papaya leaf distortion mosaic virus, PLDMV, Potyvirus属)是目前威胁中国番木瓜种植的主要病原之一。辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase, HC-Pro)是PLDMV编码参与病毒运动、复制、媒介传播、基因沉默抑制的多功能蛋白。为了获得HC-Pro基因的纯化蛋白,本研究通过密码子优化HC-Pro基因序列,成功构建原核表达质粒p ET-30a-HCPro,经IPTG诱导后实现HC-Pro在大肠杆菌中的原核表达,在0.5 mmol/L IPTG,20℃条件下诱导过夜时其表达量最高;破碎菌体后,SDS分析全菌、破碎上清以及沉淀中目标蛋白的表达量,结果显示重组HC-Pro蛋白主要以不可溶的包涵体形式在沉淀中表达;进一步溶解包涵体通过Ni-NTA层析柱进行纯化,在500 mmol/L浓度咪唑下可以获得分子量大小约为54 kD的HC-Pro重组蛋白;Western Blot分析纯化后的目标蛋白,结果显示54 kD处有明显的条带,与预期的HC-Pro重组蛋白大小一致。本研究成功表达并纯化获得了PL... 相似文献
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为了研究流产衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)的免疫原性,建立快速有效的流产衣原体抗体检测方法,根据Gen Bank中公布的流产衣原体基因组序列,设计并合成了流产衣原体CPAF蛋白编码基因的特异性引物,以流产衣原体标准菌株基因组为模板,经PCR扩增获得长度为1 809 bp目的基因片段;对获得的目的基因进行测序,并用生物信息学软件进行预测分析;再将该片段插入原核表达载体p ET-30a中,经双酶切、测序鉴定;构建成功的表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG对目的蛋白进行诱导表达,通过对诱导条件的优化,确定诱导表达的最佳条件,表达产物用SDS-PAGE和Western Blot检测。结果显示,成功克隆流产衣原体CPAF蛋白的编码基因,该编码产物可能是定位于宿主细胞质中的一种衣原体分泌性蛋白酶,分子内具有多个可能的抗原表位;重组表达质粒经IPTG诱导后,表达分子质量为67.6 ku的CPAF蛋白,该重组蛋白能与抗His-tag单克隆抗体以及流产衣原体阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。结果表明,以大肠杆菌表达系统重组表达的流产衣原体CPAF蛋白具有良好的免疫原性,可作为动物流产衣原体病的血清学诊断及亚单位疫苗研究的候选抗原。 相似文献
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绿盲蝽膜结合型海藻糖酶ALTre-2基因表达、纯化及酶学特性 总被引：1，自引：0，他引：1
以绿盲蝽为材料,在前期获得绿盲蝽膜结合型海藻糖酶(ALTre-2)基因的基础上,构建了ALTre-2原核表达载体(pET28a-ALTre-2),经IPTG诱导表达、变性、复性和蛋白纯化后,获得具海藻糖酶活力的重组蛋白,最后在以海藻糖为底物及重组蛋白浓度为1.1 mg·mL-1的条件下,对纯化得到的重组ALTre-2蛋白进行活性检测,确定了其酶促反应的最佳pH和最适温度.试验结果表明:ALTre-2基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够高效表达一个约60 kD大小的蛋白,SDS-PAGE显示该蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性及蛋白纯化获得了具海藻糖酶活力的重组蛋白;该重组ALTre-2蛋白在pH为7.0时活性最高,同时重组ALTre-2蛋白酶活性最适温度是50℃.研究结果为深入探讨绿盲蝽膜结合型海藻糖酶分子调控机制奠定基础. 相似文献
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一种高效、稳定的可溶性原核表达载体的构建及应用 总被引：2，自引：0，他引：2
以O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因重组克隆载体pGEM-OVP1为模板,设计表达引物,经PCR扩增获得上游带有PelB信号肽编码序列的VP1 C端编码区,将其克隆至该表达载体pET-30a(+)中,构建了可溶性原核表达载体pET-30a-PelB-VP1C.将VP1全长编码区替换VP1C,获得重组原核表达载体pET-30a-PelB-VP1.将两种重组质粒分别转化大肠杆菌工程菌株BL21-(DE3)-plysS,经IPTG诱导表达,实现了VP1全长及其C端的可溶性表达,以金属离子螯合层析法分别对表达的VP1及其C端融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE显示纯化的目的蛋白分别在32 ku和20 ku处有单一目的条带,具有较高的纯度.Western blot 分析,VP1蛋白及其C端均可与牛O型口蹄疫病毒阳性血清反应.对重组菌株的连续传代实验证实了该可溶性表达载体的遗传稳定性,显示了该可溶性原核表达载体在蛋白可溶性表达中的应用价值. 相似文献
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为研究兔出血症病毒VP60基因原核表达蛋白的免疫原性。采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60基因。PCR产物纯化后连接T载体,提取质粒后进行序列测定,将测序正确的纯化产物经双酶切,克隆入原核表达载体PET28b中,构建原核表达载体。将鉴定正确的重组质粒转化表达宿主菌E. coli RosettaTM中,用IPTG诱导培养重组表达菌。结果表明：经SDS-PAGE分析,在相对分子量62.0 KD处可见明显的表达带,经Western blot鉴定,在62.0 KD处出现明显的反应带。以纯化的重组蛋白制备的抗血清可以与纯化的RHDV发生特异性的ELISA反应。说明RHDVVP60基因原核表达蛋白具有较好的免疫原性。 相似文献
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为了原核表达鸭疫里默氏菌噬菌体RAP44的裂解酶基因,以噬菌体RAP44的基因组为模板,用PCR方法扩增裂解酶基因,与表达载体p GEX-6P-1连接,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱纯化表达蛋白。结果成功构建了表达载体p GEX-N,转化菌经IPTG诱导后成功表达出了分子量约为37 k D的可溶性重组蛋白。本研究获得了纯化的鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶重组蛋白,为裂解酶的功能研究奠定了基础。 相似文献
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K+通道蛋白在维持细胞离子平衡等生命活动中发挥重要的作用。利用真核或原核表达系统高效表达K+通道蛋白是深入研究其生化特征及生理功能的基础和前提。本研究在成功克隆巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)K+通道蛋白基因cDNA全长的基础上,将HbKCO1 cDNA 编码区插入pET-28a构建原核表达载体pET-28a(+)-HbKCO1,并分别转化大肠杆菌RosettaTM(DE3) pLysS和BL21(DE3)菌株。经过条件优化,转化的大肠杆菌RosettaTM(DE3) pLysS菌株经1mM IPTG诱导3h能够高效表达HbKCO1重组蛋白,但同等条件下转化的BL21(DE3)菌株仅能微量表达。HbKCO1重组蛋白原核表达具有菌株依赖性。 相似文献
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小麦TaGAPC定点突变体基因载体构建及其原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研究催化活性半胱氨酸Cys154、Cys158残基对小麦细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Ta GAPC)蛋白酶活性的影响,利用重叠延伸PCR法分别将这2个位点的半胱氨酸突变成丝氨酸,并分别连入p ET28a(+)原核表达载体。在25℃条件下,Ta GAPC及其定点基因Ta Cys154S/Ta Cys158S经0.25 mmol/L IPTG诱导后高效表达,SDS-PAGE电泳检测结果显示,目标重组蛋白均为可溶性且大小约为40 k Da,与预测结果一致。在此基础上,经超声波破菌及镍柱纯化获得3种纯化重组蛋白。这为后续Ta GAPC及其定点突变体蛋白酶活性测定及活性位点分析提供试验材料。 相似文献
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为找到理想的工业化生产海藻糖合成酶基因工程菌,以长白山温泉SH-110基因组DNA为模板,PCR扩增编码Tres基因片段,克隆至pET-30a(+)原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3),实验中采用IPTG和乳糖同时进行对比诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和酶学性质研究。成功克隆了2912 bp的Tres基因,实验中发现加入IPTG和乳糖后,融合蛋白在胞内都得到了表达,而且添加乳糖诱导的蛋白表达量偏高。表达重组酶Tres相对分子量约为110 kDa,最适作用温度60℃,最适pH7.0。金属离子Ca2+、K+、Zn2+对重组酶有明显激活作用,Ba2+、Cu2+、Mn2+有明显抑制酶活作用。重组酶的动力学常数Km为8.823 mmol/L和Vmax为235.29 mmol/L。已成功在大肠杆菌表达重组Tres,为进一步研究利用基因工程菌生产大量海藻糖合成酶,进行大规模生产海藻糖提供理论依据。 相似文献
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棉花组蛋白去泛素化酶GhOTUD5与生殖发育密切相关。为了获得大量可溶性表达的GhOTUD5蛋白,本试验对目的蛋白原核表达条件进行优化。采用分子克隆方法构建重组表达载体pET-22b-GhOTUD5,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)和Transetta(DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导目的蛋白表达。在对影响原核表达的四个单因素(菌体密度OD600,诱导剂IPTG终浓度,诱导时间和诱导温度)分别分析的基础上,设计三水平的正交试验L9(43),摸索大量可溶性目的蛋白表达的最优条件。结果显示,目的蛋白GhOTUD5在Transetta(DE3)中成功表达,在BL21(DE3)中不表达。在菌体密度OD600为0.8、诱导温度为28℃、IPTG终浓度为0.7 mmol/L、诱导3 h的条件下可溶性目的蛋白表达量最高,达到13%左右。该研究结果为进一步研究GhOTUD5在棉花育性方面的功能提供了科学数据。 相似文献
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利用RT-PCR技术从荷斯坦奶牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增IFN-γ(ccIFN-γ)基因,克隆至pMD18-T载体进行测序。测序结果表明,ccIFN-γ基因全长501bp,编码166个氨基酸,其中前23个氨基酸残基构成信号肽序列,后面147氨基酸残基构成成熟肽,其中含有2个潜在的N-链糖基化位点。二级和三级结构预测发现,ccIFN-γ蛋白分子中存在7个的α-螺旋,中间由无规卷曲连接,折叠成由α-螺旋包绕的中空状结构。将ccIFN-γ成熟肽编码区序列进一步克隆至pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。经SDS-PAGE分析,表达出与预期大小(20.6KDa)相符的重组蛋白,占菌体蛋白18.6%。Western blot检测证实表达的融合蛋白为牛IFN-γ,这为进一步开展重组ccIFN-γ生物学活性的研究奠定了基础。 相似文献