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盐藻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因DsSTPK的克隆、原核表达及纯化 总被引：1，自引：1，他引：0
前期研究表明,盐藻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶DsSTPK在转录水平上的表达受盐胁迫诱导。为了进一步研究该蛋白激酶的生理功能,通过RT-PCR扩增DsSTPK的开放阅读框,并将其克隆至pET32a(+)载体,得到重组表达载体pET32a(+)-DsSTPK。将重组表达载体转化E. coli. BL21 (DE3),IPTG诱导表达,然后对融合蛋白进行表达形式分析,利用His60 Ni离子重力柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。本研究成功构建了重组表达载体pET32a(+)-DsSTPK,经IPTG诱导后表达出的融合蛋白的分子量与预期相符;表达形式分析显示该融合蛋白在上清和包涵体中均存在;将上清蛋白纯化后获得了纯度较高的融合蛋白;Western-blot检测显示该融合蛋白能被抗组氨酸抗体特异性识别,具有良好的免疫学活性。DsSTPK的成功表达、纯化,为下一步制备抗体,然后进一步在蛋白质水平上研究其在盐藻耐盐机制中的作用奠定了基础。 相似文献
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内蒙古羊源细粒棘球蚴Eg95基因原核表达及蛋白鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
在克隆内蒙古羊源细粒棘球蚴疫苗候选基因Eg95的基础上,构建原核表达载体pET-Eg95并转化E.coli BL21(DE3),优化表达体系,获得Eg95纯化蛋白.将Eg95基因从克隆质粒pMD19-T-Eg95亚克隆到原核表达载体pET44a(+)上,构建原核表达载体pET-Eg95,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,优化表达条件.纯化的 Eg95 融合蛋白经 SDS-PAGE和Western Blot鉴定其正确性和免疫学活性.原核表达载体pET-Eg95在大肠杆菌中高效表达,优化的原核表达条件为:当菌液OD600值为0.6时,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG,37℃,振荡培养5 h.纯化后的蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定为目的蛋白并具有生物学活性.原核表达载体pET-Eg95构建正确并可高效表达可溶性Nus-Eg95融合蛋白,可作为特异性抗原应用于免疫印迹法检测血清抗体. 相似文献
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克隆油菜GDSL脂肪酶基因BnLIP1,实现该基因在原核系统中重组表达,为研究其功能奠定基础。采用TRIzol法提取总RNA,通过RT-PCR法扩增BnLIP1编码序列,构建原核表达载体pEL1并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达后通过SDS-PAGE检测目的蛋白。根据GenBank报道的序列设计引物,从萌发的油菜种子黄化幼苗中成功克隆到BnLIP1的编码序列,长度为1170bp。将该编码序列构建到原核表达载体pET32a( )并与标签序列融合,在E.coliBL21菌株中成功表达了与标签蛋白融合的BnLIP1蛋白,大小约为61kDa。首次实现了油菜GDSL脂肪酶基因在原核系统中的表达,为GDSL脂肪酶Bn-LIP1蛋白的分离纯化及活性研究奠定了基础。 相似文献
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棉花GhCOMT3基因的原核表达、纯化及鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
为了深入研究GhCOMT3基因的功能,将GhCOMT3基因构建到原核表达载体pET-28a中,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。用0.2mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,结果发现,16℃诱导12h、30℃诱导3h和37℃诱导3h后融合蛋白均以包涵体的形式表达;30℃诱导的蛋白表达量最大,之后对包涵体进行变性溶解,进行SDS-PAGE检测,再经过蛋白标记亲和层析柱(His TrapTMHP)纯化得到变性的pET-28a-GhCOMT3融合蛋白,用SDS-PAGE和Western blotting检测纯化效果,鉴定表达产物,目的蛋白相对分子量约为39.119kDa,检测结果与预期一致。结果表明,pET-28a-GhCOMT3蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达产物,为在蛋白水平上研究GhCOMT3基因功能奠定了基础。 相似文献
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为克隆、表达单核细胞增生李斯特菌sRNA分子伴侣蛋白hfq基因,并纯化重组蛋白,通过PCR的方法从单核细胞增生李斯特菌基因组DNA中扩增出hfq基因,将扩增产物克隆于pMD18-T载体中,测序验证后,再将hfq基因亚克隆至表达载体pET-32a（＋）中,成功构建pET-32a（＋）-hfq原核表达载体。然后,转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,通过IPTG进行诱导表达,对表达蛋白进行可溶性分析,并采用Ni-NTA纯化目的蛋白。结果显示：克隆的hfq基因全长234 bp,编码77个氨基酸,通过SDS-PAGE可以检测到27 kDa的蛋白特异性条带;并从上清中纯化得到了Hfq融合蛋白。为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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为了进一步研究FecB基因,利用PCR-RFLP技术筛选出FecB基因,PCR扩增FecB基因编码区序列1509bp,利用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ定向插入原核表达载体pET30a(+),构建原核表达载体pET30a(+)-FecB,诱导表达纯化重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,WesternBlot检测重组蛋白的免疫活性,ELISA检测抗体效价。结果表明,成功的构建了绵羊FecB基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达目的蛋白,经过4次免疫后,获得多克隆抗体,ELISA方法检测小鼠抗体免疫效价达到1∶32000,纯化的蛋白具有免疫活性。为研究绵羊FecB基因蛋白的功能提供参考。 相似文献
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根据胚胎发育后期丰富蛋白基因OsLEA19a的读码框序列设计引物,PCR扩增目的基因后,利用基因重组技术成功构建原核表达载体pET30a-OsLEA19a,并将重组质粒转化到E.coli BL21中。优化诱导OsLEA19a表达的条件,使目的蛋白可在E.coli BL21中高效表达。OsLEA19a融合蛋白的SDS-PAGE电泳分析表明,诱导蛋白表达的最适条件是37℃、4 h,融合蛋白的大小大约为30 kDa。抗逆性分析表明,OsLEA19a的表达能增强大肠杆菌对高盐、高渗透压、高温和低温等非生物胁迫的抗性。 相似文献
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亚硝基谷胱甘肽还原酶(S-nitrosoglutathione reductase,GSNOR)在生物体中调控信号分子一氧化氮(NO)的代谢和平衡。为了深入研究GSNOR的功能,利用RT-PCR和RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)技术从菠菜根中克隆了SoGSNOR基因的全长序列,该基因编码框1 140 bp,编码379个氨基酸,GenBank登录号为KR381778。将其克隆到原核表达载体pET32a上,构建原核表达载体pET32a-SoGSNOR,并转化大肠杆菌BL21 star(DE3),通过IPTG诱导重组SoGSNOR在大肠杆菌BL21 star(DE3)中高效表达,表达的融合蛋白分子质量约为65 ku,且在上清液和包涵体中均有表达,可溶性部分经Ni~(2+)NTA亲和柱纯化,获得纯化蛋白,并注射昆明小鼠,制备多克隆抗体,并对其进行了Western Blot检测,结果表明,稀释10 000倍的抗血清能够检测到与预期SoGSNOR大小一致的目的条带。试验结果为进一步研究菠菜SoGSNOR基因功能奠定了基础。 相似文献
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根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR方法扩增得到完整的NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a和pET32a上,构建出重组表达质粒pET28a-NS1和pET32a-NS1,转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导得到NS1融合蛋白(His-NS1),其分子质量约分别为44,58 kDa,均在诱导后6 h达到表达量高峰。分析显示,2种融合蛋白均以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于鹅坦布苏病毒NS1蛋白的研究奠定了基础。 相似文献
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贯叶连翘无菌苗茎尖诱导变异体研究 总被引：1，自引：0，他引：1
以研究贯叶连翘离体诱变及筛选变异体为目的,用贯叶连翘无菌苗茎尖为供试材料,研究了平阳霉素处理浓度、时间、外源添加物对供试茎尖存活率以及激素配比对茎尖不定芽诱导率的影响。结果表明：平阳霉素80mg/L的20min处理可作为适宜诱变处理,添加椰汁有利于茎尖存活;6-BA0.5mg/L、NAA0.01mg/L的激素组合有利于诱导正常型不定芽和获得较高的诱导率。通过研究,建立了贯叶连翘变异体诱导技术程序,获得了金丝桃素含量提高的变异体材料。 相似文献
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贯叶连翘不定根悬浮培养的初步研究 总被引：1，自引：1，他引：0
为了给贯叶连翘不定根的大量扩繁提供可靠的理论依据,以贯叶连翘不定根为材料进行悬浮培养,对不定根生长的培养基种类、糖种类以及IBA浓度进行优化筛选,再通过观察贯叶连翘不定根的生长情况,测量其鲜物重和干物重,计算干物率和增殖系数,来确定最佳的悬浮培养条件。不同的培养基种类对贯叶连翘不定根的生长影响较大,MS对促进不定根生长的效果最好;蔗糖可明显增加贯叶连翘不定根的鲜物重和干物重,分别为8.29 g、0.46 g;当IBA浓度为1.0 mg/L时,贯叶连翘不定根的鲜物重﹑干物重﹑干物率以及增殖系数均达到最大值,分别为8.98 g﹑0.49 g﹑5.46%和13.97。贯叶连翘不定根在MS+IBA 1.0 mg/L,蔗糖作为其碳源的悬浮培养基中生长,增殖效果最好。 相似文献
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Three adjacent EcoRI fragments of the rDNA unit from Lycopersicon esculentum, eleven anonymous genomic and two anonymous cDNA
clones from Brassica napus and three restriction endonucleases: BamHI, EcoRI and EcoRV were used for RFLP analysis of the
genome of Hypericum perforatum L. A polymorphic band identified with EcoRI and two rDNA probes in five somaclones originated
from the same genotype was detected in all progenies of two somaclones indicating the inheritance of the molecular changes.
rDNA unit heterogeneity represented by two types of RFLP pattern revealed among somaclones and seed-derived control plants
using EcoRV and two rDNA probes may indicate an alloploid origin of Hypericum perforatum. The occurrence of the identical
RFLP patterns in some R0 somaclones and seed-derived plants and their progenies may be related to the apomictic mode of reproduction which is assumed
to be prevalent in Hypericum perforatum. The differences in RFLP patterns of progenies when compared with the maternal plants
(1 out of 10 progenies of one control plant and 1 out of 8 progenies of one somaclone) may indicate that some progenies have
originated through sexual recombination.
This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date. 相似文献
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贯叶连翘茎段和叶片的离体培养及植株再生研究 总被引：3，自引：0，他引：3
以贯叶连翘的叶片和茎段作为外植体,培养在含有不同种类及浓度激素的MS基本培养基上,进行愈伤组织、丛生芽、根的诱导实验,并进行试管苗的移栽。结果表明,2,4-D有利于贯叶连翘愈伤组织的形成;加有6-BA 0.5 mg/L的MS培养基最适合丛生芽的形成;诱导生根较好的培养基是MS+IBA 0.5 mg/L +NAA 0.5 mg/L和MS+IBA 1.0 mg/L。 相似文献
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桃果实中ACC合酶基因克隆及基因沉默载体构建 总被引：1，自引：0，他引：1
摘 要：植物中乙烯是一种具有促进果实成熟和衰老的内源激素。ACC合酶是植物乙烯生物合成途径中一个重要的限速酶,沉默ACC合酶基因的表达能减少植物性内源性乙烯的产生。本研究以中华寿桃为研究材料,采用RT-PCR 技术,克隆获得ACC合酶基因。将该基因酶切回收后连接到pTRV-RNA2载体上,转化DH5α,筛选阳性克隆,进行酶切鉴定。测序后与已知序列进行同源性比较,其同源性达到99.6%,表明将ACC合酶基因成功连接到pTRV-RNA2基因沉默载体上。 相似文献
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【研究目的】从苹果果实中克隆细胞质型NADP-苹果酸酶（NADP-ME）基因，并且从基因转录水平上研究该基因与苹果果实酸度的关系。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆NADP-ME基因，半定量RT-PCR分析该基因在高酸和低酸个体不同发育时期果实中的转录情况，并进行原核表达分析。【结果】成功克隆了细胞质型NADP-ME基因的cDNA全长序列，命名为Mal-ME (GenBank注册号：DQ280492)；该基因表达一个约66kD的蛋白；半定量RT-PCR分析表明：不同发育时期的果实中Mal-ME的转录与苹果酸含量呈负相关，即随着Mal-ME转录水平的增强果实含酸量下降。【结论】成功从苹果果实中克隆了细胞质型Mal-ME基因，Mal-ME在果实发育过程中对苹果酸的积累起负调控作用。 相似文献
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樱桃病毒A外壳蛋白基因克隆及其原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
为制备樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)抗血清,克隆CVA外壳蛋白基因(CP),构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。根据CVA全基因组序列(NC_003689.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增CVA外壳蛋白基因,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-CVACP,转化大肠杆菌BL21(DE3)株系,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。序列分析显示,该区段长为603 bp,编码201个氨基酸,与法国分离物PF(HQ267856.1)的同源性为96.8%,与印度分离物JKSPMi-5(FN669548.1)同源性为86.3%。成功构建了原核表达载体pET30a-CVACP,SDS-PAGE电泳分析显示,转pET30a-CVACP载体的BL21(DE3)菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白,该重组蛋白在37℃、1.5 mmol/L IPTG、诱导4 h条件下表达量最大。 相似文献
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马铃薯A病毒重组CP多克隆抗体的制备及其在DAS-ELISA检测中的应用 总被引：2，自引：0，他引：2
利用重组CP作抗原制备出马铃薯A病毒的多克隆抗体,并将其用于DAS-ELISA检测。以p ET22b(+)为起始载体,构建了PVA-CP基因的原核表达载体p ET22b-ACP,重组菌BL21(p ET22b-ACP)经IPTG诱导表达出了分子量为30 k Da的特异性重组CP。利用高纯度重组CP为抗原免疫家兔,制备出了效价为1∶512 k的抗血清。以PVA重组CP为抗原,用间接ELISA与直接ELISA分别测定重组CP纯化抗体(Ig G)及其碱性磷酸酶标记物(Ig G-AP)的活性,用DAS-ELISA测定2种抗体的活性,目测及OD值测定结果表明3种ELISA测定反应都呈阳性。以PVA病毒阳性标准物为抗原,在上述3种ELISA测定中也呈阳性反应,重组CP多克隆抗体及其酶标抗体与PVA有较强的反应信号。利用重组CP制备的多克隆抗体及其酶标抗体达到了马铃薯A病毒DAS-ELISA检测的要求。 相似文献