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1.
【目的】构建原核表达载体p ET28a-r Ch IFN-α-Ch IL-18、大肠埃希菌Escherichia coli表达及产物纯化与活性检测,研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂,以对鸡的病毒性疾病进行防治.【方法】采用融合PCR(Fusion PCR)方法,利用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR产物,通过PCR产物重叠链的延伸将鸡α干扰素(Chicken interferon alpha,Ch IFN-α)与鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18,Ch IL-18)基因构建Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因并克隆入p ET-28a原核表达载体中进行原核表达.通过镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白,并进行SDSPAGE分析、Western-blot鉴定.采用细胞病变抑制法检测r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白在细胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)及新城疫病毒(NDV)增殖活性.【结果和结论】成功构建并克隆了p ET28a-r Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因.融合基因在大肠埃希菌中表达的r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白相对分子质量约为38 000,蛋白经纯化后纯度在90%以上.r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白在鸡胚成纤维(CEF)细胞上具有明显抗病毒活性,其抗VSV和NDV的活性明显高于单一r Ch IFN-α、r Ch IL-18蛋白的抗病毒活性. 相似文献
2.
QIAexpress系统高效表达鸡γ-干扰素cDNA的研究 总被引：15，自引：0，他引：15
深入进行基因工程鸡干扰素的研究 ,将前期工作所得到的 p GEM T Easy/ Ch IFN-γ2重组质粒中的 Ch IFN- γ2基因亚克隆到表达质粒 p QE30上 ,构建了重组表达质粒 p QE- Ch IFN- γ2 ,转化大肠杆菌 M1 5,构建了高效表达重组蛋白的双质粒 QIAexpress系统。经对重组蛋白的可溶性判定、包涵体的溶解、纯化、复性及活性测定 ,结果表明 Ch IFN-γ2的表达水平为 2 2 % ,包涵体的纯度为 80 % ,生物学活性为 3 2 0 0～ 6 40 0 U.mg-1 。本方法可供大量制备活性鸡γ-干扰素参考 相似文献
3.
鸡γ-干扰素的可溶性表达及纯化产物的抗NDV活性 总被引：1，自引：1，他引：0
将鸡γ-干扰素(chIFN-γ)基因先克隆,接着通过大肠杆菌表达后进行产物纯化与活性检测.通过PCR方法以带有信号肽的重组质粒PMD-18T-preIFN-γ为模板,扩增无信号肤chIFN-γ基因片段,克隆至原核表达载体pProEXTM HTa,构建重组表达质粒pProEXTM HTa-chIFN-γ,在大肠杆菌BL2... 相似文献
4.
白介素18(IL-18)最早被称为干扰素诱导因子(interferon-γ-inducing factor,IGIF),是近年发现的一种重要的免疫调节因子。该实验根据Gen Bank中已公布的鸡IL-18的基因序列,设计并合成了一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出IL-18基因,并将该基因克隆到p MD18-T载体中,经过质粒酶切、PCR和测序鉴定,阳性克隆命名为Chp MD18-T-IL-18。将Chp MD18-T-IL-18双酶切后与p ET32a表达载体连接,转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,经IPTG诱导表达鸡IL-18蛋白,结果表明,在28k D左右出现了目的条带,经west-ern blot检测确定该蛋白获得高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。 相似文献
5.
鸡IL-18成熟蛋白基因原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备 总被引：1，自引：1，他引：0
应用RT-PCR技术得到鸡IL-18成熟蛋白基因(chicken mature interleukin-18),将克隆片段与原核表达载体pET28a+连接,构建了重组表达载体pET28a+-ChMIL18,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,获得重组表达菌株。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析后,用含有融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳颗粒免疫家兔,制备兔抗鸡IL-18多克隆抗体,Western-Blot检测抗体效价和特异性。结果表明,鸡IL-18在BL21中得到了表达,相对分子质量约为23kD,获得了具有较高效价的特异性多克隆抗体。为进一步研究鸡IL-18成熟蛋白的生物学活性和作用机制奠定了基础。 相似文献
6.
鸡传染性支气管炎病毒S1基因的原核表达及生物活性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]研究鸡传染性支气管炎病毒S1基因的原核表达及反应原性鉴定。[方法]将S1基因克隆到pMD18-T质粒载体上构建pMD18-T-IBV-S1载体;将目的基因插入原核表达载体pET-32a（＋）的多克隆位点区,并将构建的重组质粒转化至宿主菌BL21中;IPTG诱导后的蛋白做SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析。[结果]S1基因在大肠杆菌中成功地进行了表达,表达的融合蛋白约为66kD,以包涵体形式存在。免疫印迹试验显示,重组蛋白可被IBV多克隆抗体识别。[结论]S1重组蛋白具有反应原性,为进一步研究IBV的新型疫苗奠定了基础。 相似文献
7.
根据GenBank已发表的鸡γ干扰素（ChIFN-γ）eDNA基因序列设计一对引物,以ConA刺激8h后的鸡全血淋巴细胞提取的总RNA为模板．通过RT—PCR方法克隆出ChIFN-γ基因,将其连接到pMD18-T载体上获得阳性重组质粒。测序结果表明,该ChIFN-γ与GenBank上发表的ChIFN-γ序列的同源性可达99．6％,其含有1个495bp的开放性阅读框架,编码164个氨基酸。通过KpnⅠ和NotⅠ两个酶切位点将该基因插入酵母表达载体（pPICZa—A）,并将该重组酵母ChIFN-γ载体线性化,通过电转化使ChIFN-γ基因整合到酵母（X-33）基因组上,经甲醇诱导后,成功表达出ChIFN-γ。利用Western—blotting分析测定表达的ChIFN-γ蛋白的活性。结果表明,本试验得到的重组酵母ChIFN-γ是具有反应原性的蛋白。 相似文献
8.
鸡白细胞介素-2基因的克隆与酵母表达质粒的构建 总被引：5，自引：0，他引：5
从经ConA活化的4周龄岭南黄鸡脾脏淋巴细胞中分离提取总RNA,经过反转录PCR(RT-PCR)扩增出鸡白细胞介素-2(1L-2)cDNA片断,PCR产物克隆至pGEM-TEasy载体,重组质粒命名为IL-2-T,经菌落PCR与限制酶切鉴定,然后测序,结果表明克隆片断长度为432bp,与预期大小一致,为鸡IL-2基因的编码区全长,将IL-2-T克隆重组质粒进行双酶切(Cla I与Xba I),回收IL-2片断插入同样酶切的毕赤酵母表达质粒pPiCZa-C,构建重组IL-2-C表达质粒,为鸡IL-2在毕赤酵母中的表达奠定基础。 相似文献
9.
海兰鸡白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
通过RT-PCR方法从用植物血凝素(PHA)活化60日龄海兰鸡的脾脏淋巴细胞中扩增出海兰鸡白细胞介素18(IL-18)成熟蛋白基因的cDNA,并将其克隆到pGEM-T Easy Vector载体上, DNA序列测定表明, 克隆得到的海兰鸡ChIL-18 cDNA基因全序列包括终止密码子在内其编码区大小为510 bp,编码169个氨基酸多肽. 将该基因片段克隆到原核表达载体pQE30构建重组质粒pQE30-ChIL-18,转化大肠杆菌M15,并用IPTG 诱导. 重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为19 000的重组蛋白. 相似文献
10.
[目的]构建鸡IFN-γ的表达载体。[方法]采用PCR方法从pcDNA-ChIFN-γ重组质粒中扩增得到鸡IFN-γ基因,将目的基因定向克隆至能够在大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达的pQE trisystem载体内,转化大肠杆菌M15菌株,以IPTG诱导表达8×H is-tag标签蛋白并对其进行纯化。[结果]通过SDS-PAGE检测方法表明,ChIFN-γ基因片段成功表达。[结论]鸡IFN-γ的表达载体成功构建。 相似文献