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1.
选择葡萄八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase)基因VviPDS1为靶标,利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除载体,瞬时转化葡萄叶片原生质体,检测到不同类型的突变。通过农杆菌介导转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织,筛选获得卡那霉素抗性植株71株。经PCR鉴定,其中53株为阳性植株,阳性率为74.64%。测序结果表明,共有20株在靶点发生不同类型的突变,编辑效率为37.74%;其中9株产生了双等位基因突变。对其进行氨基酸序列预测,在第202位氨基酸之后发生了不同程度的变异。利用CRISPR/Cas9系统敲除VviPDS1获得的突变体植株呈现整体矮化,其叶片出现不同程度白化。表明CRISPR/Cas9系统可以通过细胞中的瞬时或稳定表达进行基因编辑,可以实现在葡萄编辑植株中产生纯合敲除。 相似文献
2.
以栽培番茄品种（系）Ailsa Craig(AC)、B5和B9为试材，利用CRISPR/Cas9双元表达载体系统，对番茄品质调控关键基因SlGLK2和SlMYB12进行定点敲除。获得AC背景下SlGLK2和SlMYB12的基因编辑植株各9株，B5背景下SlGLK2的基因编辑植株3株，B9背景下SlMYB12的基因编辑植株4株。通过对靶点测序发现，在靶位点的PAM上游3～4 bp处发生了不同形式的碱基缺失、插入或替换，主要以1～10 bp的缺失和单碱基G和T的插入为主；也产生了两靶点间的大片段缺失，最大片段为334 bp。AC背景下敲除SlMYB12产生粉色果实，敲除SlGLK2基因，果实肩部的绿色明显变浅，B5背景下的3株基因编辑番茄均无“绿肩”。本研究中利用CRISPR/Cas9技术在不同番茄种质中成功创制了敲除SlGLK2或SlMYB12的基因编辑材料，以期为番茄品质育种提供优良种质。 相似文献
3.
以大果型栽培番茄资源“T048”为材料,利用CRISPR/Cas9技术对滞绿基因SlSGR1进行定向编辑。对19株转基因阳性株系进行靶位点序列分析发现,共有10株发生了编辑事件,编辑效率为52.6%。通过测序分析发现,编辑类型涉及碱基的缺失、插入及替换,多数发生在PAM序列上游3～4 bp碱基处,同时也发现了两个编辑位点间共565 bp的序列倒位。表型分析发现,T1代纯合编辑株系叶片衰老减缓,果实表现为铁锈色,且番茄红素、叶绿素及β–胡萝卜素含量显著提高。对类胡萝卜素合成关键基因进行分析发现,纯合编辑株系果实中的SGR1表达量显著降低,而PSY1表达量显著提高。结果表明,通过CRISPR/Cas9技术对滞绿基因SlSGR1进行定向编辑可有效提升番茄果实中番茄红素、β–胡萝卜素等类胡萝卜素含量,进而为番茄营养品质育种提供新种质。 相似文献
4.
通过CRISPR/Cas9技术敲除SRK基因或者SP11基因可以直接将甘蓝类蔬菜自交不亲和材料改造成自交亲和材料。本研究中根据全基因组重测序获得青花菜(Brassica oleracea var.italic) BoSP11基因序列,构建双靶位点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,利用农杆菌介导的遗传转化法对BoSP11进行敲除。结果显示,获得的29株转基因植株中有23株发生基因突变,编辑效率为79.3%。TA克隆测序结果表明有4株为纯合突变,19株为杂合突变。统计纯合突变T0代自交结籽情况发现花期自交亲和指数高达6.82,为目前所报道的能获得的亲和性最高指数。T1代植株在隔离大棚中通过蜜蜂授粉平均单株采收种子24.8 g,完全实现不需要人工干预完成亲本材料的自交繁育。 相似文献
5.
《园艺学报》2021,(5)
为了在梨愈伤组织中建立CRISPR/Cas9基因编辑体系,将proDAM3:GUS转入‘茄梨’愈伤组织,通过构建双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,利用农杆菌介导的遗传转化法侵染proD AM3:GUS转基因梨愈伤组织,通过测序及GUS染色的方法检验敲除效果,分析靶基因突变类型。结果表明,共有4个转基因株系在靶位点处发生了基因突变,编辑效率为66.7%。对所有基因编辑株系的有效克隆进行分析,结果显示sgRNA1在靶位点GUST1的突变频率达到71.4%,高于sgRNA2在靶位点GUST2突变频率的46.4%,说明sgRNA1可以更有效地与靶位点结合。测序结果表明,4个基因编辑株系中GUS基因均被敲除,基因突变的类型包含碱基缺失、插入及两个靶点之间大片段的缺失,不存在碱基替换。GUS染色结果显示,基因敲除后的GUS转基因愈伤完全呈白色,说明利用CRISPR/Cas9多靶点基因编辑系统可以在梨愈伤组织中实现高效的基因敲除。 相似文献
6.
西瓜遗传转化技术周期长,过程复杂,CRISPR/Cas9基因编辑系统又存在着一定的脱靶效应,为了保障所选择的靶位点的可行性,本研究选择西瓜ClSPO11-1基因(ID:Cla003301)为靶标,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建双靶点的基因敲除载体,利用发根农杆菌Ar. Qual菌株侵染西瓜子叶外植体,通过简单的组培过程,使西瓜外植体长出不定根,在不定根中检测到了在靶位点1处发生了不同程度的碱基缺失,经过与野生型氨基酸序列比对分析后发现均造成了翻译提前终止和氨基酸的突变,成功实现了对西瓜不定根的基因编辑,该方法周期短,操作简便,实现了快速鉴定在西瓜中选择的靶位点的靶向效率,为研究西瓜基因功能和遗传改良提供了保障。 相似文献
7.
为了研究CRISPR/Cas9技术在天目地黄基因编辑中的应用，克隆了天目地黄（Rehmannia chingii）的八氢番茄红素脱氢酶基因（Rc PDS1），利用PCR方法扩增其c DNA序列和基因组DNA序列。通过构建单靶点CRISPR/Cas9载体，利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法侵染天目地黄无菌苗叶盘，通过TA克隆测序法分析基因编辑的类型。结果显示，克隆获得了1个天目地黄Rc PDS1的全长c DNA序列，其具有1个长度为1 743 bp的开放阅读框，编码580个氨基酸残基，基因组DNA序列长度8 041 bp，包含14个内含子和15个外显子。通过遗传转化共获得57个转基因再生株系，其中具明显白化表型的株系有20个（35.09%）。TA克隆测序结果显示，Rc PDS1靶位点突变类型主要包括碱基缺失、替换和插入。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在天目地黄中成功实现了对Rc PDS1基因的靶向敲除。 相似文献
8.
利用CRISPR/Cas9系统定点编辑葡萄白粉病感病基因VviEDR2（Enhanced disease resistance 2），在VviEDR2的DUF1336结构域设计靶位点VviEDR2-T1，构建CRISPR/Cas9敲除载体，通过农杆菌介导法转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织。对PCR阳性植株进行靶位点扩增测序，结果表明，共有8个转基因植株在靶位点处发生不同类型的双等位基因突变，编辑效率为32%；突变体植株生长势较弱，叶片较小，茎秆丛生、细弱。进一步对突变体植株进行抗病检测，结果表明，接种葡萄白粉菌（Erysiphe necator Schw.）5 d后，突变体植株叶片上白粉菌孢子仅能萌发出少量较短初级菌丝，表皮细胞产生大量明显的H2O2，而野生型叶片中白粉菌萌发出大量初级菌丝、次级菌丝和吸器，无明显H2O2产生。这些结果表明，可以利用CRISPR/Cas9技术编辑葡萄感病基因VviEDR2，提高葡萄白粉菌抗性。 相似文献
9.
以芥蓝(Brassicaoleraceavar.alboglabra)为材料,以ζ–胡萝卜素脱氢酶(ζ-Carotene desaturase,ZDS)基因为目标基因,建立其CRISPR/Cas9基因组编辑体系。在BoaZDS的编码区近5′端选择靶位点,构建了CRISPR/Cas9表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法获得了19个芥蓝转基因阳性植株,Sanger测序分析发现其中13株成功突变,CRISPR/Cas9载体在芥蓝上的突变效率为68.42%,且所有突变植株均表现出明显的白化表型。 相似文献
10.
为了构建番茄CRISPR/Cas9介导的多基因编辑体系，用SlU6-2p、SlU6-3p、SlU6-7p、SlU3-5p、SlU3-9p和SlU6-5p启动子分别替换pKSE401和pCBC-DT1T2载体中的拟南芥U6启动子，构建了1个双元载体（p MGET）、2个中间载体（pKC-S2M和pKC-S3M）和3个gRNA模块载体（pCBC-S1、pCBC-S2和pCBC-S3）。为了测试该多基因编辑体系，通过PCR扩增、Goldengate克隆和同尾酶技术，将含有6个番茄果实性状相关基因Green flesh(GF)、Ovate(O)、Locule number(LC)、SlMYB12(Y)、Tangerine(T)、Uniformripening(U)靶点序列的sgRNA聚合构建多基因编辑载体pMGET-OYGTULC和pMGET-TULCOYG，检测6个基因同时被编辑的效率分别为44.00%和11.76%。用携带pMGET-OYGTULC载体的根癌农杆菌转化番茄材料获得2株6个基因均被编辑的植株，序列变异为单个碱基的插入、单个或多个碱基的缺失及大片段的缺失等多种形式。本研究中该多... 相似文献
11.
为了获得CsLOB1启动子较大片段删除的突变体,利用CRISPR/Cas9技术对CsLOB1启动子进行多位点编辑。通过在CsLOB1启动子的EBEPthA4区域及其上、下游设计不同的靶标位点,构建了2个植物表达载体pCas9CsLOB1:2sites和pCas9CsLOB1:3sites,分别对CsLOB1启动子同时进行2个位点和3个位点的编辑。测序结果表明pCas9CsLOB1:2sites和pCas9CsLOB1:3sites的基因编辑效率分别为64.7%和80.0%,突变体植株在2个sgRNA之间发生了DNA片段的删除。进一步的分析发现,不同的sgRNA具有不同的突变效率,其差异是由于不同的sgRNA对CsLOB1-识别和结合能力的差异造成的。本结果表明对CsLOB1启动子进行多位点编辑可以获得删除较大DNA片段的突变体。 相似文献
12.
红蓝光质对转色期间番茄果实主要品质的影响 总被引：4，自引：0，他引：4
采用LED精量调制光源,以番茄品种‘Micro-Tom’为试材,设置红光(R)、蓝光(B)和红蓝组合光3︰1(3R1B)3个处理,以白光(W)为对照,研究红蓝光质对转色期间番茄果实主要品质及番茄红素生物合成关键酶基因表达的影响。结果表明,与对照相比,红光和3R1B处理可显著提高番茄果实可溶性糖含量和糖酸比,降低可滴定酸含量;蓝光下维生素C、可溶性蛋白和可滴定酸含量明显升高,可溶性糖含量较低,但与对照差异不明显。随着果实成熟,红光和3R1B处理下番茄红素含量及牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPS)和八氢番茄红素合成酶(PSY)基因的表达量显著高于蓝光和对照,尤以3R1B处理最明显;蓝光则显著降低了番茄红素含量,GGPS和PSY1表达受到抑制。综上,蓝光能够促进维生素C、蛋白质和有机酸含量增加;红光和红蓝组合光则有利于碳水化合物的积累,且通过提高番茄红素生物合成关键酶基因GGPS和PSY1的转录水平和活性,促进番茄红素合成,尤以3R1B处理最佳。说明适宜比例的红蓝组合光有利于番茄果实转色,提高果实品质。 相似文献
13.
Sebastian Gasparis Maciej Kała Mateusz Przyborowski Leszek A. Łyżnik Wacław Orczyk Anna Nadolska-Orczyk 《Plant methods》2018,14(1):111
Background
Genome editing of monocot plants can be accomplished by using the components of the CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated Cas9) technology specifically optimized for these types of plants. Here, we present the development of RNA-guided Cas9 system for simplex and multiplex genome editing in barley.Results
We developed a set of customizable RNA-guided Cas9 binary vectors and sgRNA modules for simplex and multiplex editing in barley. To facilitate the design of RNA-guided Cas9 constructs, the pBract derived binary vectors were adapted to Gateway cloning and only one restriction enzyme was required for construction of the sgRNA. We designed a synthetic, codon optimized Cas9 gene containing the N terminal SV40 nuclear localization signal and the UBQ10 Arabidopsis 1st intron. Two different sgRNAs were constructed for simplex editing and one polycistronic tRNA-gRNA construct (PTG) for multiplex editing using an endogenous tRNA processing system. The RNA-guided Cas9 constructs were validated in transgenic barley plants produced by Agrobacterium-mediated transformation. The highest mutation rate was observed in simplex editing of the cytokinin oxidase/dehydrogenase HvCKX1 gene, where mutations at the hvckx1 locus were detected in 88% of the screened T0 plants. We also proved the efficacy of the PTG construct in the multiplex editing of two CKX genes by obtaining 9 plants (21% of all edited plants) with mutations induced in both HvCKX1 and HvCKX3. Analysis of the T1 lines revealed that mutations in the HvCKX1 gene were transmitted to the next generation of plants. Among 220 screened T1 plants we identified 85 heterozygous and 28 homozygous mutants, most of them bearing frameshift mutations in the HvCKX1 gene. We also observed independent segregation of mutations and the Cas9-sgRNA T-DNA insert in several T1 plants. Moreover, the knockout mutations of the Nud gene generated phenotype mutants with naked grains, and the phenotypic changes were identifiable in T0 plants.Conclusions
We demonstrated the effectiveness of an optimized RNA-guided Cas9 system that can be used for generating homozygous knockout mutants in the progeny of transgenic barely plants. This is also the first report of successful multiplex editing in barley using a tRNA processing system.14.
WANG Si-si LIAO Xiao-min SHAO Zhong-ming YUAN Jian-ling FENG Mu-yin HA Yan-ping LI Ru-jia SHEN Zhi-hua JIE Wei 《园艺学报》2018,34(12):2172-2179
AIM:To establish SETD2 gene knockout nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell strains based on CRIPSR/Cas9 technique and to analyze their proliferation characteristics. METHODS:Sub-quantitative RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of SETD2 in immortalized nasopharyngeal epithelial cell line NP-69, well differentiated NPC cell line CNE1, poorly-differentiated NPC cell line CNE2Z and undifferentiated NPC cell line C666-1, and the SETD2 high expression cell line CNE1 was screened. The proliferation ability of CNE1 cells before and after the SETD2 gene knockout was analyzed by CCK-8 and colony formation assay. The cell cycle distribution was detected by flow cytometry, and the expression of cell cycle-related proteins was detected by Western blot. RESULTS:Compared with NP-69 cells, the expression of SETD2 was decreased gradually in CNE1, CNE2Z and C666-1 cells (P<0.01). Based on the CRISPR/Cas9 technique, 2 monoclonal cell strains with SETD2 gene stable knockout, named CNE1-SETD2-KO-#5 and #9, were successfully screened from total 15 monoclones. The results of CCK-8 and plate colony formation assay confirmed that the proliferation ability of CNE1-SETD2-KO-#5 and #9 cells was significantly enhanced compared with CNE1-WT cells (P<0.05). The results of flow cytometry analysis showed that the G1 phase of CNE1-SETD2-KO-#5 and #9 cells was decreased, while the G2/M and S phases were increased significantly (P<0.05). The results of Western blot confirmed the increases in the protein levels of proliferating cell nuclear antigen (PCNA), cyclin D1, cyclin B1, cyclin A2, cyclin E1, cyclin-dependent kinases 2 (CDK2) and CDK4, and the decrease in the protein level of p21 after SETD2 gene knockout (P<0.05). CONCLUSION:The NPC cell strains with SETD2 gene knockout were successfully constructed based on CRISPR/Cas9 technique. SETD2 expression correlates with cell differentiation status in the NPC cells. SETD2 gene knockout promotes NPC cell proliferation by up-regulating cyclin D1, cyclin B1, cyclin A2, cyclin E1, CDK2 and CDK4, and down-regulating p21 expression. 相似文献
15.
采用孢子萌发法测定了烯肟菌胺与丙森锌按照不同配比(质量比1∶1、1∶3、1∶5、1∶7及1∶9)复配对番茄早疫病菌的联合毒力,并验证了60%烯肟菌胺·丙森锌(质量比1∶9)水分散粒剂(WG)对番茄早疫病的的田间防治效果。结果表明:烯肟菌胺与丙森锌单剂对茄链格孢菌的EC50值分别为1.5140mg·L-1和11.9888mg·L~(-1),烯肟菌胺与丙森锌按1∶1、1∶3、1∶5、1∶7及1∶9混配时均表现出明显的增效效应。田间试验结果表明,在番茄早疫病发病初期间隔7d连续喷施2次60%烯肟菌胺·丙森锌WG对番茄早疫病具有较好防效,推荐剂量为480~960g·hm~(-2)。 相似文献
16.
番茄SP（SELF-PRUNING）基因调控植株的有限型生长习性，其与金鱼草CEN（CENRORADIALIS）基因和拟南芥TFL1（TERMINAL FLOWER 1）基因同源，属于调控植物生长习性和开花的同一类基因。目前已报道了番茄SP基因家族8个成员（SP、SP9D、SP2I、SP3D、SP5G、SP6A、SIGI和SPGB），该基因家族能直接或间接调控番茄植株的生长习性，影响其株形。对番茄SP家族基因结构特征、亲缘关系、表达特性以及株形调控功能等研究进展进行综述，以期为调控番茄生长习性，获得紧凑型株系、实现均一化和现代机械化采收提供有效的技术支撑。 相似文献