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[目的]建立瓜蔓枯病菌(Didy mella bryoniae)的实时荧光PCR方法,为瓜蔓枯病菌快速分子检测奠定基础.[方法]通过Genebank网上已公布序列,选取瓜蔓枯病菌beta-tubulin(tub2)基因作为目的基因,设计了特异性引物和Taq Man探针,并对该引物和探针的反应条件进行优化.[结果]采用研究所设计的引物和探针对瓜上的其他菌株及近似菌株进行检测,该引物和探针可高度灵敏地检测到瓜蔓枯病菌.采用实时荧光PCR方法,25μL体系中只要有8.9 pg的核酸量就可以被检测到,检测灵敏度达到356 fg/μL,比普通PCR灵敏度高10倍.[结论]采用研究所设计的引物和探针对田间采集的病株和未知样品的检测,验证了引物和Taq Man探针的特异性. 相似文献
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【目的】从口岸进境番茄种子中检测番茄溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis,CMM）,一直以来都受检测周期的限制,快速、特异地从种子中检测该病原细菌需要新的方法。研究在锁式探针扩增方式上,选择连接酶依赖的PCR扩增方式,并结合实时荧光PCR技术,旨在建立番茄溃疡病菌基于锁式探针技术的实时荧光PCR快速检测方法,为口岸番茄种子快速检疫提供技术支持。【方法】根据番茄溃疡病菌的一段特异基因Pat-1序列,设计锁式探针的T1和T2臂,使之与CMM的特异性片段碱基序列互补,再按照锁式探针的设计原则设计锁式探针和扩增引物以及荧光探针。试验时,先将锁式探针与CMM以及参照菌株的DNA模板在DNA连接酶作用下分别进行环化连接,再用核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ消化未环化的线性锁式探针,最后以环化的锁式探针为模板,在扩增引物的作用下进行实时荧光PCR试验。建立CMM基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法,分别比较该方法的特异性和灵敏度与常规PCR方法的差异,并用该方法对收集的来自日本、韩国和中国台湾的番茄种子以及国内采集的共45份样品进行检测。【结果】基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出CMM,在供试的10种菌株中,只有靶标细菌能被特异性地检测到阳性,空白对照和其他参试菌株均没有荧光信号的增加,检测为阴性。比较该检测方法与常规PCR方法,其特异性和常规PCR方法一致。该检测方法检测灵敏度高,DNA最低浓度检测为50 fg•μL-1,而常规PCR方法检测DNA最低浓度为5 pg•μL-1,灵敏度高于常规PCR两个数量级。对收集的样品进行检测,结果显示,45份样品中共有5份样品CMM检测结果为阳性,分别是日本的番茄种子样品2份（编号Jap1214、Jap1102）,永泰采集的样品2份（编号为Yongt1001、Yongt1002）和闽清采集的样品1份（编号为Minq1001）。【结论】建立的基于锁式探针技术的荧光PCR方法具有高度的特异性和灵敏度,应用该检测方法对收集的进境番茄种子进行检测,可以直接从番茄种子中检测到CMM,该方法适合口岸番茄种子CMM的快速检测,有较好的口岸检疫实际应用价值。 相似文献
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基于gpd基因的大蒜黑腐病菌实时荧光定量PCR鉴定技术 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】大蒜黑腐病菌（Embellisia allii (Campanile) Simmons）的检疫鉴定主要采用形态鉴定方法。不仅耗时长,而且大蒜黑腐病菌与本属其他种以及其他属的分生孢子非常相似,极难分辨,需要建立快速、有效的分子诊断方法。研究旨在建立实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)体系以准确、灵敏地鉴定大蒜黑腐病菌。【方法】从NCBI的GenBank数据库中,选取大蒜黑腐病菌和其他大蒜病害以及近似种的3-磷酸甘油脱氢酶（gpd）基因核酸序列数据15种,应用引物设计软件Primer express,根据探针设计原则从理论上选出1条探针和3对引物。根据试验结果对上述引物进行筛选,筛选出能够鉴定出大蒜黑腐病菌的特异性引物对和TaqMan探针。同时对反应体系中复性-延伸温度的反应参数进行优化,设计56、58、60℃ 3个温度梯度;将大蒜黑腐病菌基因组DNA在紫外核酸分析仪上进行定量后进行10倍的梯度稀释,对探针灵敏性进行测试,从而建立大蒜黑腐病菌TaqMan水解探针法qPCR检测体系。【结果】从基于GenBank上的15种gpd基因核酸序列设计的引物和探针中,筛选出能够鉴定大蒜黑腐病菌的特异性引物对Emb21/Emb32和TaqMan探针Emb。在供试的6种菌株中,只有靶标菌大蒜黑腐病菌利用该引物对和探针能够被特异性的检测到阳性,空白对照和其他参试菌均没有荧光信号的增加,检测为阴性。复性-延伸温度反应参数优化中,△Rn荧光信号增加值在58℃时达最大,56、60℃荧光信号增加值降低,经过多次重复试验,确定最佳的复性-延伸温度为58℃。灵敏度测试中,大蒜黑腐病菌DNA浓度稀释到140 pg时,所得的图形较好;当体系中模板浓度稀释到14 pg时,所得的图形较差。最终DNA检测灵敏度为140 pg。应用该引物和探针建立的qPCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出大蒜黑腐病菌。【结论】建立了大蒜黑腐病菌TaqMan探针法qPCR检测体系,该检测技术能够从供试的6种病原菌中特异性检测出大蒜黑腐病菌,检测灵敏度可达140 pg。建立的基于gpd基因的大蒜黑腐病菌qPCR方法具有高度的特异性和灵敏度,适合口岸大蒜黑腐病菌的快速检测。 相似文献
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菜豆细菌性萎蔫病菌16S rDNA基因克隆及TaqMan探针实时荧光PCR检测 总被引：9，自引：0，他引：9
将菜豆细菌性萎蔫病菌(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)16S rDNA基因进行克隆测序,并依据此序列设计菜豆细菌性萎蔫病菌的实时荧光PCR引物和特异性探针,对所收集的样品进行了检测. 结果表明,该检测方法具有快速、特异、灵敏、重复性好等优点,只有菜豆细菌性萎蔫病菌产生荧光,其他细菌没有荧光产生. 检测的灵敏度为105 CFU/mL的细菌悬浮液,相对灵敏度为106 CFU/mL. 相似文献
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TaqMan探针实时荧光定量PCR检测番茄黄化曲叶病毒 总被引：2，自引：0，他引：2
根据番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)外壳蛋白(CP)基因序列上的保守序列,设计特异性的引物和Taqman探针,建立荧光定量PCR方法。结果表明,试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.9941;能检测到1 000个病毒拷贝,灵敏度比普通PCR高100倍;与番茄花叶病毒和黄瓜花叶病毒无交叉反应,特异性强、重复性佳,为TYLCV检测提供了一种特异、灵敏、快速的定量检测方法。 相似文献
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目的 针对我国检疫性植物病原真菌苹果壳色单隔孢溃疡病菌Botryosphaeria stevensii,建立实时荧光PCR检测方法。方法 根据苹果壳色单隔孢溃疡病菌及其近似种的β微管蛋白基因(β-tubulin基因)保守序列设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,分别以病菌DNA和β-tubulin基因靶标序列重组质粒DNA为阳性标准品检验探针的特异性和灵敏度。结果 探针BsP267对苹果壳色单隔孢溃疡病菌菌株表现出特异性阳性扩增,且与近缘种及其他常见的果腐病菌无交叉反应,扩增效率为105.858%,探针检测DNA的灵敏度达到1 fg/μL。结论 本研究建立的苹果壳色单隔孢溃疡病菌实时荧光PCR检测法具有高特异性和灵敏度,可用于该病害的防控检测和检疫工作。 相似文献
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双重PCR技术检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌方法的建立 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】利用双重PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌（Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus）和黑胫病菌（Pectobacterium atroseptica）。【方法】根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列,对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列,设计并合成了1对特异性引物CMS1/CMS2,将设计的引物与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r结合,经过条件优化后,建立了双重PCR体系。【结果】利用引物CMS1/CMS2扩增出了1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达100 fg•μL-1,在细菌数上达105 CFU•mL-1。利用双重PCR体系对马铃薯环腐病菌和黑胫病菌进行扩增,可获得913和690 bp的2条特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达600 fg•μL-1,在细菌数上达5×105 CFU•mL-1。【结论】成功建立了双重PCR检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌技术体系,该技术能够同时快速可靠地检测出马铃薯环腐病菌和黑胫病菌。 相似文献
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报道对云南省陆良县引起马铃薯植株萎蔫和块茎维管束环状腐烂的病原菌从致病性、形态学、培养形状、运动性、生理生化测定等方面进行的鉴定,确定该菌为马铃薯环腐菌（Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus）。 相似文献
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番茄细菌性溃疡病研究进展 总被引：16，自引：0，他引：16
根据国内外近年来番茄溃疡病的研究概况,对番茄溃疡病的历史、主要症状、病原菌的分类地位及生物学特性、病原菌的分离、检测和鉴定技术、病害的田间发生、流行条件及防治方法进行了综述,分析了我国加入世界贸易组织后实施《卫生与植物卫生措施协定》以及农产品安全条例等,认为做好番茄溃疡病风险性分析、监测国际种子贸易传入该病害的可能性非常重要,同时提出了今后加强番茄溃疡病研究的主要方向。 相似文献
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新疆加工番茄溃疡病的发生及其病原菌研究 总被引：1，自引：1，他引：0
[目的]番茄溃疡病是番茄上最严重、最具毁灭性的病害之一,2010年6～8月在新疆石河子、奎屯等地的加工番茄田问相继发现典型症状的病株和病果.旨在明确引起该病害的主要病原菌种类,为进一步的防治研究打好基础.[方法]对采集的病株、病果进行病原菌的分离纯化,应用注射法、剪叶法及喷雾接种测定菌株的致病性;通过供试菌株的形态学特征、培养特性、生理生化反应的测定、16S rDNA序列分析及番茄溃疡病菌特异性引物的PCR检测确定病原的归属.[结果]所有供试菌株对供试番茄都具有致病性,表现为茎秆爆裂,植株萎蔫死亡.菌株形态特征、培养特性及生理生化反应都与密执安棒形杆菌密执安亚种(Clavibactermichiganense subsp.michiganense)的特征相一致;供试菌株16S rDNA核苷酸序列与德国已报道的密执安棒形杆菌密执安亚种菌株的核苷酸序列同源性为99.86;;特异性引物检测也得到预期目标片段.[结论]因此,将此病害确定为番茄溃疡病,其病原为密执安棒形杆菌密执安亚种(C.michiganensis subsp.Michiganensis). 相似文献
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玉米内州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis)是进境玉米重要检疫性病原物之一。通过分析比较玉米内州萎蔫病菌的纤维素酶基因celB,筛选出独特和保守的基因序列用于设计引物和探针,利用重组酶介导等温扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)建立玉米内州萎蔫病菌的荧光RAA检测方法。以celB基因序列作为靶标序列设计出引物2F、6R和探针P,建立了玉米内州萎蔫病菌荧光RAA检测方法,该方法在39 ℃恒温条件下,20 min内可完成检测反应,特异性好,且灵敏度高达130 fg·μL-1,利用该方法检测4份玉米模拟样本阳性,8份玉米真实样品阴性,检测结果与参照国家标准GB/T 36840—2018一致。结果表明,建立的荧光RAA检测方法快速、特异、灵敏,能够满足现场检测要求。 相似文献
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Yan Zhang Wenxiang Yang Yaning Li Daqun Liu Ting Zhang 《Frontiers of Agriculture in China》2009,3(2):140-145
A multiplex PCR assay system was developed for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), which combined two tests in one reaction mixture. Cmm-specific primers PSA-4/PSA-R and Solanum lycopersicum-specific primers NS-7-F/NS- 8-R (internal PCR control primer) were combined in one PCR reaction mixture with Cmm and plant
DNA as template. The primer sets could amplify the target product successfully. Different combinations and concentrations
of primers and annealing temperatures were tested, respectively. The detection level of the optimized multiplex PCR assay
was up to 5×102 cfu·mL−1. To verify the applicability of this system, it was employed to detect Cmm in tomato seeds and plantlet samples. Seeds mixed
with Cmm and diseased plantlets were detected successfully. The multiplex PCR system will avoid false-negative results and
provide a reliable method for the detection of Cmm. 相似文献
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根据甘蔗宿根矮化病(RatoonStuntingDisease,RSD)病原细菌(Leifsoniaxylisubsp.xyli,Lxx)16S-23SrDNA基因间隔区核苷酸序列设计的一对特异性引物,建立了甘蔗宿根矮化病PCR检测方法;同时对PCR扩增的目的片段核苷酸序列进行测定与分析。结果表明广东湛江蔗区RSD病菌16S-23SrDNA基因间隔区核苷酸序列与巴西、澳大利亚及美国路易斯安娜州RSD株系基因组相应区段核苷酸同一率接近100%,病菌高度的同源。而与近缘的木质部赖氏杆菌狗牙根变种(Leifsoniaxylisubsp.Cynodontis,Lxc)和形态上相近的马铃薯环腐病菌(Clavibactermichiganensissubsp.Michiganensis)基因组相应区段核苷酸同一率较低,存在明显的分化。 相似文献