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1.
木质素是梨(Pyrus)石细胞的重要成分之一,木质素合成代谢对石细胞形成发育有着重要影响.肉桂酸4-羟化酶(cinnamate 4-hydroxylase,C4H,EC l.14.13.11)是细胞色素单加氧酶超家族中CYP73A亚家族的一员,同时为木质素合成代谢中的一个关键酶.本研究从砀山酥梨(Pyrus bretschneideri cv.Danshan Su)果实中克隆出一条肉桂酸4-羟化酶基因的全长cDNA序列,命名为PbC4H,GenBank登录号为:KF663548.PbC4H全长1 764 bp,具有1 515bp的ORF,编码504个氨基酸.PbC4H与多个物种C4H基因编码的氨基酸序列具有较高的同源性,说明其在进化过程中较为保守.结构域分析表明,PbC4H具有跨膜结构域和典型的细胞色素P450结构域特征.qRT-PCR分析发现在梨果实发育的不同时期,PbC4H基因表达量呈现先增加后下降的趋势,其中在花后55 d达到最高.构建了PbC4H原核表达载体pET-32a-PbC4H,在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21菌株中诱导表达出PbC4H融合蛋白.亚细胞定位表明PbC4H蛋白定位于细胞膜上.本研究结果为利用分子生物学技术调控梨木质素的合成和石细胞的发育提供了基础资料. 相似文献
2.
梨BAHD家族成员的鉴定、序列特征及表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
植物酰基辅酶A依赖型酰基转移酶(ACT)又名BAHD,对木质素、花青素和生物碱等多种次生代谢产物的酰基化进行修饰。为阐明梨BAHD家族的分子特征与进化规律,本研究以砀山酥梨为试验材料,利用BAHD家族保守基序在梨基因组中鉴定出95个成员,对其序列特征、基因结构及保守基序、染色体定位、基因复制、系统进化和表达模式进行分析。结果表明,PbACT蛋白均具有HXXXD或DFGWG结构域,主要定位于细胞质和叶绿体中。通过染色体定位及复制事件分析发现,梨17条染色体上均有PbACT分布,且PbACT的基因复制类型主要以片段复制为主。实时荧光定量PCR分析表明,PbACT3、PbACT6和PbACT41这3个基因可能参与了梨果实木质素生物合成及石细胞发育。亚细胞定位结果表明,PbACT3和PbACT6为叶绿体定位蛋白。本研究结果为从分子水平调控梨木质素代谢和石细胞含量奠定了一定的理论基础。 相似文献
3.
咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是植物木质素合成过程中的一个关键酶,对木质素组成和结构有重要的作用。为探究BlCCoAOMT基因在木质素合成中的作用,本研究从光皮桦中克隆了该基因,并分析其基因结构和表达模式,以及在73个基因型中的单核苷酸多态性(SNP)。结果表明,BlCCoAOMT基因cDNA全长1 114 bp,含有一个744 bp的完整ORF,编码一个由247个氨基酸残基组成的蛋白;该编码蛋白包含高等植物CCoAOMT所有的8个典型保守基序。BlCCoAOMT在木质化茎段中优势表达,且随着木质化程度提高而逐渐增强,表明BlCCoAOMT可能参与光皮桦木质素的生物合成;在拉弯处理的6 h到7 d间,该基因在应拉区发育木质部中的表达显著下调,与应拉木木质素含量的下降相符。共检测到BlCCoAOMT基因有119个SNP位点,平均每14 bp就有1个SNP位点,其中在外显子区域存在26个SNP位点,表明不同基因型中存在丰富SNP变异;在不同群体间BlCCoAOMT基因的分化程度无显著差异,且非同义突变和同义突变的位点的比值均小于1,表明在演化进程中主要受到了纯化选择压力。本研究结果为深入解析光皮桦木质素合成分子机制及后续分子标记辅助育种提供了理论依据。 相似文献
4.
本研究以成年早酥梨(Pyrus bretschneideri cv.Zaosu)叶片为材料,通过RT-PCR克隆早酥梨病程相关基因非表达子1基因(NPR1)并获得其全长序列1771 bp,开放阅读框为1761 bp,编码586个氨基酸(GenBank登录号:FJ769372).利用NCBI/Blastp和ClustalX软件进行相似性分析表明,目的基因编码蛋白质序列与日本梨(p.pyrifolia)、秋子梨(P.ussuriensis)、苹果(Malus xdomestica)、烟草(Nicotiana tabacum)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的NPR1蛋白相似性分别为99%、98%、98%、67%和59%.将其连接pGEX-4T-1原核表达载体并转化大肠杆菌(EScherichia coli)BL21,经IPTG诱导表达获得大小约为91 kD的目的融合蛋白,融合蛋白主要以包涵体形式表达,表达量约占总蛋白17%. 相似文献
5.
咖啡酸甲基转移酶(COMT)是木质素合成途径的关键酶,在植物抗逆反应中发挥重要作用。本研究基于本实验室已建立的橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳EST数据库,对组装后序列(Contig)检索并设计引物,利用PCR技术克隆到一个橡胶树COMT基因,命名为HbCOMT1(GenBank登录号为GI:443908530)。该基因全长1926bp,由4个外显子和3个内含子组成,编码368个氨基酸,预测蛋白的分子量为40.58kD,等电点为5.46,具有植物O-甲基转移酶的典型特征。系统进化分析显示HbCOMT1蛋白与蓖麻(Ricinus communis)和葡萄(Vitis vinifera)的COMT聚为一组,其他11种植物的COMT则另成一组。基因表达分析显示HbCOMT1在胶乳中的表达量最高,其次是叶片和树皮,花、芽中的表达量较低,种子中几乎不表达。同时,HbCOMT1基因在胶乳中的表达量随割次增加明显上升,显著受伤害诱导,受死皮调控,但对乙烯利应答不明显。本研究首次从橡胶树中克隆了一个COMT基因,了解了其基因结构与表达特性,推测该基因可能参与乳管的胁迫应答和排胶调控,为深入揭示该基因功能提供基础资料。 相似文献
6.
本研究利用半定量RT-PCR分析方法探索了陆地棉(Gossypium hirsutum L.)木质素合成途径中甲基化酶基因家族COMT和CCoAOMT在不同组织和不同发育时期纤维中的表达情况。结果表明COMT1,COMT2,COMT3和CCoAOMT1,CCoAOMT2在棉花的7个组织器官(根、茎、叶、子叶、花瓣、雄蕊、胚珠)中都有表达,其中COMT1和CCoAOMT1在各组织中的表达趋势类似,COMT2,COMT3和CCoAOMT2表达趋势各异。在5～25d的棉纤维发育过程中,COMT1和COMT3表达稳定,COMT2表达量逐渐增加。而CCoAOMT基因家族的2个基因的表达量变化相对明显,CCoAOMT1在25d出现表达高峰,CCoAOMT2则在10d和15d呈现高表达量。本研究表明甲基化酶基因家族COMT和CCoAOMT在棉花的根,茎等维管组织中具有相对一致的高表达量,而在其他组织和发育纤维中则呈现出明显的组织特异性和纤维发育时期特异性。 相似文献
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诸葛菜OvCYP86MF基因的克隆及其特性分析 总被引：2，自引：1，他引：1
为进一步阐明细胞色素P450基因CYP86MF在诸葛菜发育中的分子机理,本文根据已知同源基因保守序列设计特异引物,利用RT-PCR和RACE技术从诸葛菜中获得一个细胞色素P450基因(OvCYP86MF)全长cDNA序列,该序列全长为1876bp,含有1605bp的完整开放阅读框,可编码534个氨基酸,分子量和等电点分别为61.4kDa和6.90,具有细胞色素P450蛋白的典型特征,即保守结构域FNAGPRLCIG;原核表达显示该基因的融合蛋白在体外可以诱导表达;DANSTAR和Clustal W软件分析表明该基因的全长cDNA序列及其编码氨基酸序列与十字花科物种拟南芥相似性很高,达到80%以上,亲缘关系最近;与CYP86C亚家族成员在氨基酸水平上的相似性均高于50%,因此推断该基因属于CYP86C这个亚家族。Northern杂交分析表明该基因在花蕾中特异表达。 相似文献
8.
本试验以桃果实为试验材料,利用RT-PCR结合RACE技术克隆获得法尼基焦磷酸合成酶(FPPS)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)基因的全长c DNA序列,分别命名为Pp FPPS和Pp GGPPS,并对它们进行生物学信息及表达分析。结果表明,Pp FPPS全长1 501 bp,开放阅读框1 029 bp,编码342个氨基酸;Pp GGPPS全长1 547 bp,开放阅读框1 113 bp,编码370个氨基酸。进化树分析表明,Pp FPPS与苹果和梨的亲缘性较高;Pp GGPPS与橡胶树的亲缘性较高。蛋白质序列分析表明,Pp FPPS和Pp GGPPS均含有5个保守域和2个天冬氨酸富集区(FARM和SARM),同属反式-异戊烯转移酶家族。实时荧光定量PCR分析表明,随着果实成熟度的提高,Pp FPPS和Pp GGPPS基因在桃果实果皮和果肉中的表达量总体上呈先增加后降低的趋势,并在膨大和硬熟期达到最大值。果实膨大期后,Pp FPPS和Pp GGPPS基因在果皮中的表达显著高于果肉,这可能是桃果实成熟后期果皮类胡萝卜素含量高于果肉的重要原因。本研究结果为进一步深入研究桃果实类胡萝卜素生物合成的分子机理奠定了理论基础。 相似文献
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在前期已克隆得到的早酥梨(Pyrus bretschneideri cv.Zaosu)抗病基因同源类似物Pb-Zs3(GenBank登录号:EU939783)的基础上,通过RT-PCR获得Pb-Zs3的cDNA序列,并利用RACE技术获得该基因的全长cDNA序列,命名为早酥梨抗黑星病相关基因(Vnp1),提交至GenBank(GenBank登录号:FJ763188).生物信息学分析表明,早酥梨Vnp1基因的全长cDNA序列为1200 bp,包含一个完整的921 bp的开放读码框架(ORF),编码306个氨基酸残基,预测其分子质量为34.6 kD.同时,该基因含有与抗病相关的功能结构域核酸结合位点(NB-ARC),同源性比对显示其与苹果黑星病菌(Venturia inaequails)诱导后的苹果EST序列ABEA004598(GenBank登录号:EB150292)同源性达71%.对早酥梨Vnp1基因进行半定量RT-PCR研究的结果表明,该基因在梨黑星病菌(Venturia nashicola)诱导后216 h内的叶片中的表达水平呈明显上升趋势. 相似文献
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黄秋葵(Hibiscus esculentus L.)纤维素和木质素的大量积累极易引起果实老化,而植物MYB转录因子参与纤维素和木质素等生物合成与沉积,在次生细胞壁形成中起着重要的调控作用。为研究MYB转录因子在黄秋葵老化中的作用,从黄秋葵果实转录组测序数据库中筛选得到10条功能注释为MYB基因的片段序列,克隆获得了HeMYB4、HeMYB6、HeMYB26、HeMYB28、HeMYB44、HeMYB46、HeMYB59、HeMYB86、HeMY108和HeMYB113的基因全长,分析其核苷酸及编码氨基酸序列特征,同时进行了亚细胞定位、磷酸化位点、功能域、进化等生物信息学分析。结果显示,10个MYB基因均定位于细胞质膜上,具有丰富的磷酸化位点和功能域,与拟南芥等物种中参与纤维素和木质素合成的MYB蛋白亲缘关系较近。通过实时荧光定量PCR分析黄秋葵MYB基因家族的10个基因在果实发育过程、采后常温贮藏期间的表达,结果发现,HeMYB46、HeMYB86、HeMY108的表达量与纤维素含量呈极显著正相关,推测上述基因在黄秋葵果实衰老过程纤维素合成中起重要作用;HeMYB46、HeMYB59的表达量与木质素含量呈极显著正相关,推测其在木质素合成中起到重要调控作用。本研究结果初步明确了黄秋葵MYB转录因子在黄秋葵老化过程中的作用, 为黄秋葵的生产、分子育种等提供了理论基础。 相似文献
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pTet-on-Advanced双载体表达系统应用于转基因动物研制,需要建立两种动物品系,经过杂交和筛选,才有可能得到转基因个体,操作繁琐,转化效率低。本研究在改良的四环素(Tet-on)基因可调控系统基础上,通过PCR的方法,分别从pTet-on-Advanced质粒和pEGFP-N1质粒中扩增rtTA和EGFP基因,测序正确后,将rtTA和EGFP基因亚克隆入pTRE-Tight载体中,构建四环素pTRE-Tight-rtTA-EGFP单载体表达系统,然后采用脂质体法,将新构建的单载体表达体系pTRE-Tight-rtTA-EGFP转染猪胎儿成纤维细胞,以不同浓度(0.0001、0.001、0.01、0.1和1g/L)强力霉素(Dox)诱导,通过荧光显微镜检测EGFP的表达量。结果显示,转染48h后,未加Dox无绿色荧光表达;1g/LDos诱导可以观察到绿色荧光;Dox浓度分别为0.0001、0.001、0.01和0.1g/L未观察到绿色荧光。表明1g/LDox才能激发调控作用。本研究成功构建pTRE-Tight-rtTA-EGFP新型可控性真核表达载体,该载体在细胞中的表达受Dox的调控,能正常发挥作用。研究结果为转基因的定量表达提供了新的技术平台,也为将构建的单载体用于表达可控的转基因动物研究提供了重要科学依据。 相似文献
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基因表达系列分析技术及其在植物抗病性研究中的应用 总被引：1，自引：0，他引：1
基因表达系列分析(SAGE)技术不仅能够全面地分析特定组织或细胞内表达的基因，还可以比较不同组织在不同时间、空间条件下基因表达的差异，从而发现新基因。SAGE技术在植物抗病性研究中的应用近几年发展很快。综述介绍了SAGE技术的原理、特点、实验方案、技术发展与演变。 相似文献
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为实现人乙醛脱氢酶2（ALDH2）基因在原核生物中高效表达,将含有6×His标签和SUMO融合蛋白标签的人乙醛脱氢酶2基因的表达载体转化至宿主菌BL21（DE3）中。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下,目的基因在大肠杆菌内高效表达。通过对表达条件的优化,37℃使用终浓度0.3mmol/L的IPTG诱导3h,重组大肠杆菌的表达量可占全菌蛋白的16%。SUMO融合蛋白标签的加入以及较低的诱导温度（16℃）有利于提高人乙醛脱氢酶2基因在大肠杆菌内的可溶性表达。 相似文献
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蜘蛛丝具有极高的强度和韧度,工业和医学应用价值很高,但由于蜘蛛的不可驯养性使其应用受到限制。因此,本文尝试利用基因工程的方法获得蛛丝蛋白的表达。我们利用巢式PCR技术从大腹圆蛛Araneus ventricosus基因组中克隆了长度为837bp的拖牵丝蛋白基因（ASP）,并分别将其构建至原核表达载体pGEX-6p-1和真核表达载体pGFP-N2上,分别命名为pASG和pASN。pASG在大肠杆菌中16℃下24h诱导表达后,经蛋白质印迹证明成功地表达了GST-ASP融合蛋白;pASN转染昆虫sf9细胞48h后观察到了绿色荧光蛋白GFP的表达,表明ASP基因在大肠杆菌和真核细胞中分别得到了正确表达。本研究为利用基因工程的方法开发蛛丝蛋白的生产途径提供了有益的尝试。 相似文献
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为提高胸腺素(又名胸腺肽,thymosin)的体外表达效率,本研究采用设计融合标签的方法对胸腺素α1和β4 (Tα1,Tβ4) 进行体外重组表达,通过超高效液相色谱-飞行时间质谱联用 (LC/MS) 法,对融合蛋白的完整分子量进行验证,利用反相超高效液相色谱法对不同表达载体的单位表达量进行测定。结果表明,A18-KEKE、DKL6K两种融合标签能够高效地表达Tα1 和 Tβ4。LC/MS结果表明,所有被测样品的过表达条带中均含有融合标签的目的多肽,且带有融合标签A18-KEKE的胸腺素的单位表达量达73~123 mg·OD-1·L-1。A18-KEKE、DKL6K 2种融合标签可以有效地促进胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)、胰高血糖素样肽-2 (GLP-2)、甲状旁腺激素 (PTH 1-34) 和糖依赖性胰样多肽 (GIP)的表达,证实了这2种融合标签的广谱适用性。本研究成功筛选到了2种融合标签,可用于多种胸腺素家族多肽在大肠杆菌中的重组表达,且融合蛋白单位表达量较高,提高了胸腺肽类产品重组生产的效率,极大地降低生产成本,具有广泛的应用前景。 相似文献
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为在大豆中建立目的基因表达可控的化学诱导表达系统,本研究构建了基于乙醇诱导表达系统(ALCA switch)的GUS和GmFT2a表达载体,利用发状根农杆菌介导的根系转化体系,分别获得转ALCA-mini35S-GUS和ALCA-mini35S-GmFT2a的发状根,通过检测GUS的表达情况和GUS酶活性高低评定该系统在大豆发状根中的诱导效率,并通过检测GmFT2a表达水平加以验证。结果表明,在非诱导条件下,ALCA-mini35S-GUS发状根中未见GUS表达,而在培养基中添加乙醇后组织化学染色效果明显,说明GUS基因表达。乙醇诱导表达的效率与乙醇浓度有关,当乙醇浓度为0.05%、处理60 h时GUS相对表达量达到最高值,处理72 h时GUS酶活性最高;0.05%乙醇处理72 h时,ALCA-mini35S-GmFT2a发状根中GmFT2a相对表达量平均值约为诱导前的150倍,个别样本可达初始值的400倍。综上所述,乙醇诱导表达系统可以在大豆发状根中发挥作用,该系统不仅可用于大豆基因功能研究,而且可为培育外源基因表达可控的转基因大豆品种提供新的技术手段。 相似文献
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动物转基因的关键限制因素是制备效率和基因表达的精确调控.综述了近年发展的提高转基因效率的非定点整合转基因方法,如睾丸转基因法和卵巢转基因法;提高转基因精确性的定点整合转基因的基因打靶法;调控外源基因表达的时空表达和可控表达转基因策略;通过转基因对特定基因的进行表达时空和可逆的RNA干扰灵活精细调控.对这些新的转基因方法的优缺点进行了讨论,并探讨如何利用这些方法进行转基因动物的制备. 相似文献
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JAZ1基因是编码TIFY家族JAZs蛋白的基因之一。为克隆高粱SbJAZ1基因及研究其响应胁迫表达特性,本试验以高粱品种BTx623为研究材料,提取其总RNA,反转录获得cDNA,以cDNA为模板扩增SbJAZ1基因,并对其进行生物信息学、基因表达和原核表达分析。结果显示,SbJAZ1基因全长606 bp,编码201个氨基酸,蛋白质等电点为7.70,分子量大小为21.15 kDa;SbJAZ1与玉米相应同源基因亲缘关系最近,为亲水性蛋白;二级结构中α螺旋占25.37%、延伸链占9.95%、β转角占4.98%,无规则卷曲占59.70%。qRT-PCR分析表明,SbJAZ1在高粱根、茎、芽和叶组织中均有表达,且具有组织表达特异性,在茎中表达量最高;茉莉酸(JA)处理1 h后,SbJAZ1在高粱茎中表达量最高;吲哚乙酸(IAA)和PEG-6000可诱导SbJAZ1的表达。原核表达结果显示,SbJAZ1在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株诱导表达的最佳条件为:温度30℃,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.8 mmol·L-1。本研究结果为SbJAZ1基因的生物学功能研究提供了基础。 相似文献
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鸡γ-干扰素基因(ChIFN-γ)的瞬时表达及其抗病毒活性检测 总被引：1，自引：0，他引：1
采用PCR技术从质粒pET-ChIFN-γ中扩增得到鸡(Gallus gallus)γ-干扰素(chicken interferon gamma,ChIFN-γ)基因,将其亚克隆到真核表达载体pCAGGS中.将鉴定正确的克隆命名为pCAGGS-ChIFN-γ,体外转染鸡胚成纤维(CEF)细胞,24 h后经间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western blot)检测,表达蛋白具有良好的免疫原性.然后利用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组水疱口炎病毒(VSV*GFP)在CEF细胞上检测表达的ChIFN-γ抗病毒活性(AVA),经检测其抗病毒活性为2×10~3AU/mL,并且其活性可被抗鸡IFN-γ的多克隆抗体阻断. 相似文献
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为明确茶树SNAT基因的序列特征和表达特点,在茶树转录组测序的基础上以茶树(Camellia sinensis)品种舒茶早为试验材料,通过SMARTTM RACE技术克隆茶树褪黑素合成途径中关键限速酶5-羟色胺-N-乙酰转移酶CsSNAT基因的cDNA全长序列,并分析其基因结构和表达模式。结果表明,CsSNAT基因序列全长1 014 bp,其中包含742 bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸,预测等电点7.64,蛋白分子量27.36 kDa。氨基酸序列比对显示,CsSNAT蛋白与其他高等植物的SNAT蛋白具有较高同源性,与葡萄 VvSNAT(CBI31163)同源性最高,为66.19%。诱导蛋白最佳条件为温度28℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.5 mg·L-1,诱导时间6 h,在上清液中可获得大量分子量为66 kDa的可溶性融合蛋白。实时定量 PCR 分析表明,CsSNAT在褪黑素处理6 h后表达量最高,为对照的3倍;茶尺蠖取食6 h后,CsSNAT表达显著上调。不同激素处理结果显示,CsSNAT受脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)诱导表达。本研究结果为5-羟色胺-N-乙酰转移酶功能研究奠定了一定的基础。 相似文献