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《中国动物传染病学报》2016,(3)
采用PCR方法扩增犬瘟热病毒N基因,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建犬瘟热N基因原核表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达重组N蛋白。从包涵体中纯化重组蛋白,制备多克隆抗体,采用Western blot检测其特异性。结果显示PCR扩增得到犬瘟热N基因,重组N蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到表达,制备的多克隆抗体能与N蛋白特异性反应。 相似文献
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为了实现牛支原体p30蛋白在大肠杆菌中的高效表达,试验根据GenBank发表的p30(登录号为AIA33998.1)基因序列,在不改变p30蛋白氨基酸序列的情况下优化基因序列,全基因合成p30基因,并将其克隆到pET28a(+)载体中,构建的重组质粒pET28a(+)-p30转化至BL21(DE3)工程菌中进行诱导表达,筛选重组菌pET28a(+)-p30/BL21(DE3)诱导表达的最适诱导温度、诱导时间及IPTG诱导浓度,利用His-tag镍柱纯化p30重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a(+)-p30/BL21(DE3)诱导条件为37℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L、诱导4 h时,p30蛋白表达量最高;SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后p30蛋白达到了电泳纯,经Western-blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在36 ku处有明显的蛋白印迹条带,与预期大小相符。说明成功实现了在大肠杆菌中高效表达牛支原体p30重组蛋白。 相似文献
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《中国家禽》2020,(8)
试验旨在对鸡膜联蛋白A2(ANXA2)基因进行原核表达与纯化。利用鸡ANXA2基因特异性引物从鸡卵泡细胞cDNA中扩增ANXA2基因,亚克隆至原核表达载体p ET-32a(+)构建重组原核表达载体pET-32a-chANXA2。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,并分析重组蛋白的表达形式;利用含Ni2+琼脂球对重组蛋白进行纯化,并利用Western blot进行鉴定。结果显示:成功构建重组原核表达载体pET-32a-chANXA2,重组蛋白His-chANXA2在0.1 mmol/L IPTG、诱导表达5 h和30℃诱导温度条件下表达量高,其在上清和包涵体中均有表达,但主要以包涵体形式存在。利用含Ni2+琼脂球从诱导菌裂解物上清中得到了纯度较高的重组蛋白,Western blot检测到与预期大小相符的重组蛋白条带。研究结果为后续开展ANXA2调控鸡卵泡发育的分子机制研究奠定基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2019,(8):1506-1512
通过PCR扩增裂谷热病毒(RVFV) Gn蛋白胞外区(eGn)基因,连入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-RVFV-eGn。将重组质粒转化至感受态BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经HisTrap~(TM)FF蛋白纯化柱纯化目的蛋白。将目的蛋白免疫BALB/c小鼠,分离小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,免疫荧光鉴定制备的单克隆抗体特性。结果显示,PCR扩增出1 287 bp的目的基因;构建的重组质粒转化BL21细胞后可有效表达目的蛋白,确定最佳表达条件为30℃,0.8 mmol/L IPTG诱导5 h,目的蛋白以包涵体形式表达;纯化后目的蛋白纯度为94.136%;制备的单克隆抗体可特异性识别哺乳动物细胞表达的Gn蛋白,表明RVFV eGn蛋白具有良好的免疫原性。研究结果为裂谷热新型疫苗和快速诊断试剂的研制奠定基础。 相似文献
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以牛分枝杆菌Vallee Ⅲ株基因组DNA为模板,PCR扩增ESAT6、MPB63和HSP65基因,将其依次定向克隆入原核表达载体pET-32a (+),构建重组质粒pET-E6-M63-H65,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞,1 mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,以Ni2+亲和层析柱纯化表达的融合蛋白并进行Western blotting 分析。结果表明,rESAT6-MPB63-HSP65融合蛋白为可溶性表达,且大小与理论值相符,纯化的融合蛋白能够与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应,为进一步的诊断学研究奠定了基础。 相似文献
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为在大肠杆菌表达系统中高效表达牛α-干扰素(bovine interferon-α,Bo IFN-α),将经密码子优化后的牛α-干扰素成熟蛋白基因合成并克隆到表达载体p Cold II中,转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,获得可溶性的表达蛋白。对重组菌表达条件进行优化,结果显示在IPTG浓度为0.64 mmol/L,诱导温度为15℃,诱导时间为9 h的条件下,可溶性目的蛋白的表达量最高。重组蛋白经镍柱纯化后的纯度为99.2%,表达量为36 mg/L菌液。重组蛋白在MDBK细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为1×106U/mg。 相似文献
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鸡生长激素的原核表达、纯化及活性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
鸡生长激素(cGH)是由脑垂体前叶合成并分泌的一种重要的多肽类激素,对于鸡的生长发育具有至关重要的调控作用。为实现cGH的原核表达,将其序列插入原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a-cGH,并转化大肠杆菌BL21(DE3),挑选阳性菌落液体培养IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测显示,诱导产物在25 ku处含有与预期大小一致的蛋白条带;通过镍柱纯化,得到了较高纯度的cGH重组蛋白;用纯化得到的cGH重组蛋白处理鸡肝癌LMH细胞,检测其IGF-Ⅰ基因mRNA水平上调,证明所得到cGH蛋白具有生物学活性。研究结果为进一步研究cGH的结构、功能和生产应用奠定了基础。 相似文献