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RNA干扰技术（RNA interferece，RNAi）是由内源性或外源性短链RNA诱导同源mRNA降解，导致基因沉默的现象。从理论上来讲，几乎所有涉及到基因异常高表达的人类、动物、植物疾病都有可能设计出相应的siRNA来沉默疾病相关基因，从而达到治疗目的。由于RNAi在动植物抵抗外源病毒、生长发育调控方面起着重要作用，而且在功能基因组研究、基因治疗方面有着广泛的应用前景， 相似文献
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RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)诱发的特异性沉默目的基因表达的过程,一种大规模制备双链RNA的方法可以便利RNAi技术的应用。以斑节对虾kazal型蛋白激酶抑制剂(KPI)基因为例,详细介绍了一种以体内载体表达大量制备dsRNA(>300nt)的方法。使用商业载体pGEMT和pDRIVE,以2步克隆法构建含有发夹环(hairpin loop)dsRNA表达载体,转化RNA酶Ⅲ缺陷的大肠杆菌HT115(DE3)进行体内转录制备dsRNA。构建的发夹RNA表达载体含有494bp的正向靶序列和403bp的反向互补靶序列,其中正向靶序列多出的91bp即可成为loop环,而无需再次克隆加入。培养30mL的细菌,即可得到1mg纯化的dsRNA,而其成本仅为使用商业化体外转录试剂盒的四分之一。为评估RNAi效果,按照每1克虾体肌肉注射2μg dsRNA的剂量,在dsRNA注射后0,6,12和24h采集血淋巴,RT-PCR检测KPI mRNA的基因转录水平。与对照组GFP-dsRNA和NaCl注射组相比,KPI-dsRNA注射组可以在24h内沉默血淋巴中的KPI基因。结果表明该方法是可大规模制备长的dsRN... 相似文献
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采用q PCR与病毒滴度测定观察RNA干扰(RNA interference,RNAi)对大鲵蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus,CGSRV)主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)、甲基转移酶(methyltransferases,MTases)、DNA多聚酶(DNA polymerase)基因表达与病毒增殖的影响。结果表明,小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)能推迟鲤鱼上皮瘤细胞(epithelioma papillosum cyprini,EPC)出现病变,且病变程度也较对照组轻。在各功能基因表达量上,NC-FAM对照组与阴性对照组差异不显著(P0.05);而干扰组的干扰率极显著高于阴性对照组,其中siR-DP-1组siRNA对MCP基因的干扰率为79%,极显著高于其余组(P0.01);siR-MT-1、siR-MT-2组siRNA对MTases基因的干扰率为77%,极显著高于其余组(P0.01);siR-DP-1组siRNA对DNA polymerase基因的干扰率为79%,极显著高于其余组(P0.01)。干扰实验组病毒滴度与NC-FAM对照组和阴性对照组相比也有不同程度的降低。阴性对照组lg TCID50为8.362,NC-FAM对照组lg TCID50为7.848,siR-MCP、siR-MT、siR-DP实验组最低lg TCID50分别为5.764、5.317、5.362。证实RNAi能够抑制CGSRV主要功能基因的表达并影响病毒的复制。 相似文献
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将构建携带H1启动子的肌肉生长抑制基因的真核表达载体,通过显微注射技术导入鲤受精卵核区附近,获得了一批具有RNAi表型的转基因鲤,PCR和分子杂交检测证实外源基因整合到受体鱼的基因组中,阳性率为32.78%;一龄鱼的生长实验表明,转基因鲤比普通鲤平均生长快0.99倍,其体高和体厚分别平均增长0.22和0.26倍,其中有31.82%的群体平均体厚是普通鲤的1.6倍。结果显示,该质粒表达的发夹环型dsRNA可以有效降解其转录产物,对阻抑肌细胞中同源基因的表达、鲤肌肉的再生能力增强起到了重要作用。这种抑制作用表现为鲤背部肌肉增厚、体质量增加,说明该基因经转录产生的双链RNA在鲤体内具有RNAi效应。RNAi技术为获得具有特殊功能的转基因鲤提供了新的手段。 相似文献
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利用 PCR 技术和生物信息学方法获得了海湾扇贝(Argopecten irradians irradians) Dmrt1 基因(AiDmrt1)的 cDNA 序列。采用实时定量 PCR 技术确定 AiDmrt1 在不同组织、性腺发育阶段及胚胎和幼虫发育阶段的表达模式, 并结合 RNA 干扰(RNA interference, RNAi)技术敲降 AiDmrt1 表达后检测了精巢中性腺发育相关基因的表达特征。 结果显示, AiDmrt1 开放阅读框长度为 918 bp, 编码 305 个氨基酸, 其编码蛋白具有保守的 DM 结构域。AiDmrt1 的 mRNA 在精巢中特异性表达, 并在精巢发育至生长期表达水平最高。AiDmrt1 在囊胚期前表达量无显著差异, 但在原肠期表达水平显著升高(P＜0.01)。敲降 AiDmrt1 表达后, 精巢发育相关基因 Sox7、Sox11 和 Fem-1 显著上调表达(P＜0.05 或 P＜0.01), 而 Dmrt4 的表达显著下调(P＜0.05); 卵巢发育相关基因 FoxL2、Wnt4、β-catenin、GATA-1 和 GATA-3 均显著上调表达(P＜0.05 或 P＜0.01)。研究结果表明, AiDmrt1 是海湾扇贝精巢特异性表达基因, 参与调控海湾扇贝性腺发育与分化。 相似文献
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利用Invitrogen公司的在线生物学软件分析斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因,设计针对CP基因不同位置的小发卡RNA( short hairpin RNA,shRNA)干扰序列[其结构特征为正链( 19 nt) -环(4 nt) -负链(19 nt)].化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体pENTRTM/U6中,构建shRNA干扰载体pshRNA -124、pshRNA-896和pshRNA-NNV.然后,用脂质体转染法分别将3种shRNA干扰载体和pEGFP-CP基因共转染导入黑头呆鱼(FHM)肌肉细胞,荧光显微镜观察细胞荧光强度,分析荧光抑制效率,Real-time RT-PCR检测CP基因mRNA的表达水平变化.结果表明,在pEGFP-CP与shRNA干扰载体共转染组,pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV的荧光抑制效率分别为47％、68％、51％.3种shRNA干扰载体都有干扰效果,均能干扰绿色荧光蛋白的表达,其中pshRNA-896干扰效率最好.Real-time RT-PCR检测表明,干扰质粒pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV对pEGFP-CP基因的沉默效率分别约为60％、96％和55％,与对照组相比差异显著(P＜0.05).研究表明,靶向斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因的shRNA干扰载体构建成功,为进一步运用RNA干扰技术进行CP基因的功能研究奠定了基础. 相似文献
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探讨低温胁迫下,干扰生长抑制特异性基因2(Gas2)对罗非鱼肾脏细胞系增殖和凋亡的影响。采用脂质体转染法介导Gas2短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)及阴性对照短发夹RNA处理罗非鱼肾脏细胞,24 h后,以5℃/d降温速率对转染后的罗非鱼肾脏细胞进行低温胁迫,分别在25、20、15、10℃进行细胞采集。随后,利用实时荧光定量PCR检测Gas2基因及P53基因mRNA表达变化,利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并开展WST-1细胞增殖实验检测细胞的增殖情况。结果表明,低温胁迫下,阴性对照组及Gas2干扰组中Gas2和P53基因mRNA的表达在15℃和10℃时均显著升高;Gas2干扰组中Gas2和P53基因mRNA的表达水平在所有温度下均显著低于阴性对照组;随着温度降低,阴性对照组及Gas2干扰组的细胞凋亡率均明显升高,但Gas2干扰组的细胞凋亡率明显低于阴性对照组;低温胁迫下,对照组及Gas2干扰组的细胞增殖率与25℃时相比均显著下降;当温度降至15℃时,Gas2干扰组的细胞增殖率显著高于对照组。罗非鱼肾脏细胞在受低温胁迫时,抑制Gas2基因能够降低P53基因mRNA的表达水平以及细胞的凋亡率,并增加细胞的增殖。 相似文献
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草鱼呼肠孤病毒的研究进展 总被引：1，自引：0，他引：1
草鱼呼肠孤病毒(GCRV)是呼肠孤病毒科、水生呼肠孤病毒属的病毒中毒力最强的病毒,严重危害着我国淡水渔业的养殖。基因组由11条分节段dsRNA组成,编码11种结构多肽。GCRV能够合成内源性RNA聚合酶,在体外转录。总结了近20年来我国在GCRV形态结构、理化特性、培养特性、分子生物学以及预防治疗等方面的研究成果,提出了GCRV的重要酶类作为RNA干涉靶基因的思路。由于中和效价最高的蛋白基因M6在毒株中具有相对保守性,初步确认了基因工程亚单位疫苗开发的可行性。 相似文献
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VP15是南美白对虾WSSV病毒的一个核衣壳基因。本研究采用体外干扰实验筛选对VP15具有针对性的siRNA。实验构建了真核表达载体pEGFP–VP15,并将设计的siRNA以及pEGFP–VP15共转染BHK细胞。采用Western blot方法检测GFP–VP15融合蛋白的表达,半定量RT-PCR方法检验siRNA抑制VP15基因转录的效果。
实验结果表明,pEGFP–VP15在PK细胞正常表达,设计的三对siRNA对GFP–VP15的mRNA转录均有不同程度的干扰效果,其中siRNA1的干扰效果最为显著。实验结果为下一步对虾体内干扰WSSV病毒复制研究以及筛选更多的特异siRNA建立基础。 相似文献