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1.
《渔业科学进展》2014,(5)
通过同源克隆的方法获得太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)类FUT2基因的c DNA序列,分析其在牡蛎中的组织表达差异。研究结果表明,太平洋牡蛎类FUT2基因c DNA全长为1941 bp,包含180 bp的5'非翻译区、1086 bp的编码361个氨基酸的开放阅读框及675 bp的3'非翻译区。分子进化聚类分析结果显示,太平洋牡蛎类FUT2基因与家鼠(Mus musculus)等哺乳动物的FUT2基因聚为1个分支。此外,类FUT2基因m RNA在太平洋牡蛎成贝的肝胰脏、闭壳肌、外套膜、唇瓣、鳃等5个组织中均有分布,其中在唇瓣中的表达量最低,在其余4个组织中的表达量差异不显著。本研究表明,牡蛎中类A型组织血型抗原HBGA很可能存在与人A型HBGA相似的合成途径,可为进一步探索牡蛎特异性富集诺如病毒No V的分子机制奠定研究基础。 相似文献
2.
牡蛎消化组织内存在的类A型血型组织抗原是其特异性富集诺如病毒的主要原因,FUT2(Fucosyltransferase 2,α-1,2-岩藻糖基转移酶)是A型血型组织抗原合成的关键酶.本研究在前期克隆了太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)类FUT2基因cDNA全长的基础上,根据大肠杆菌密码子偏爱性优化并合成了类FUT2基因,插入原核表达载体pRSET A构建pRSET-mof,将其转化大肠杆菌BL21,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导.经SDS-PAGE分析显示,在37℃、IPTG终浓度为0.8 mmol/L的条件下,诱导4h后出现大小约为46 kDa的特异性目的条带.利用His亲和层析柱纯化及超滤管浓缩目的蛋白,得到单一条带,说明纯化效果良好.Western blot分析显示,目的蛋白与抗6×His标签单克隆抗体、抗人FUT2单克隆抗体均能发生特异性反应,表明优化后的太平洋牡蛎类FUT2基因在大肠杆菌系统中成功表达.本研究结果为今后研究太平洋牡蛎类FUT2基因的功能,进一步探索牡蛎特异性富集诺如病毒的分子机理奠定了基础. 相似文献
3.
《渔业科学进展》2016,(1)
牡蛎消化组织内存在的类A型血型组织抗原是其特异性富集诺如病毒的主要原因,FUT2(Fucosyltransferase 2,α-1,2-岩藻糖基转移酶)是A型血型组织抗原合成的关键酶。本研究在前期克隆了太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)类FUT2基因cDNA全长的基础上,根据大肠杆菌密码子偏爱性优化并合成了类FUT2基因,插入原核表达载体pRSET A构建pRSET-mof,将其转化大肠杆菌BL21,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导。经SDS-PAGE分析显示,在37℃、IPTG终浓度为0.8 mmol/L的条件下,诱导4 h后出现大小约为46 k Da的特异性目的条带。利用His亲和层析柱纯化及超滤管浓缩目的蛋白,得到单一条带,说明纯化效果良好。Western blot分析显示,目的蛋白与抗6×His标签单克隆抗体、抗人FUT2单克隆抗体均能发生特异性反应,表明优化后的太平洋牡蛎类FUT2基因在大肠杆菌系统中成功表达。本研究结果为今后研究太平洋牡蛎类FUT2基因的功能,进一步探索牡蛎特异性富集诺如病毒的分子机理奠定了基础。 相似文献
4.
为了解c型溶菌酶基因与长丰鲫(Chang Feng Carassius auratus)的抗菌效应关系,本研究利用同源克隆方法获得长丰鲫c型溶菌酶基因cDNA全长序列。结果显示:c型溶菌酶基因全长698 bp,包括5'端非翻译区60 bp,3'端非翻译区200 bp,开放阅读框438 bp,编码145个氨基酸。长丰鲫c型溶菌酶基因在肾脏组织中表达量最大,在脾脏、肠道、心脏和脑中大量表达,在肝脏和鳃中表达量相对较低,在皮肤和肌肉中几乎不表达。长丰鲫在感染迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌后,在肝脏、肾脏、脾脏和鳃等组织中基因表达量均发生显著变化,出现不同程度的上调。感染迟钝爱德华氏菌后,在脾脏中的上调幅度最大,其次为鳃、肝脏和肾脏;感染嗜水气单胞菌后,在脾脏中上调程度最大,其次是鳃;感染金黄色葡萄球菌后,在脾脏中上调幅度最大。在肝脏和肾脏中,经金黄色葡萄球菌刺激后c型溶菌酶基因的上调幅度最高;在脾脏和鳃中,经嗜水气单胞菌感染后c型溶菌酶基因上调幅度最高。三种刺激后,c型溶菌酶基因升高幅度的不同,说明不同刺激使鱼体组织产生的应激反应能力不同。 相似文献
5.
Lewis抗原被认为是诺如病毒特异性结合受体,作为诺如病毒传播载体,牡蛎中也存在着类Lewis抗原,但牡蛎合成这种碳水化合物的途径尚未阐明。为解析牡蛎中诺如病毒受体类Lewis抗原的合成路径,利用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术克隆得到太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的CgFUT5基因全序列并进行生物信息学分析,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析其在5种组织中的表达情况。构建原核表达质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)实现异源表达,并通过免疫印迹法(Western blot)鉴定免疫原性。克隆得到了具有1 173 bp开放阅读区的CgFUT5基因cDNA序列,系统发育树显示CgFUT5基因与多个物种具有合成Lewis抗原功能的岩藻糖基转移酶基因遗传学关系较近。重组CgFUT5蛋白可在大肠杆菌中过量表达,且表达的重组CgFUT5蛋白与抗人FUT5抗体及抗6×His标签抗体均能特异性结合。研究发现CgFUT5基因在牡蛎鳃组织中大量表达,CgFUT5蛋白与人FUT5蛋白具... 相似文献
6.
黄鳝PLA2基因的克隆及表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
利用同源克隆技术和RACE技术克隆黄鳝(Monopterus albus)磷脂酶A2(PLA2)基因的cDNA全长;并采用荧光定量RT-PCR法检测PLA2基因在黄鳝各组织中的表达量情况。结果显示:黄鳝PLA2基因全长cDNA大小为2 606 bp(Gen Bank登录号:KX852397),其中开放阅读框2 205 bp,编码736个氨基酸,预测分子大小为83.623 kD,理论等电点5.84;5'和3'非编码区长度分别为208 bp和193 bp。该蛋白序列没有信号肽和跨膜结构。氨基酸序列比对和系统树分析显示,黄鳝PLA2基因的结构十分保守,黄鳝与大黄鱼和金头鲷的PLA2基因亲缘关系最近,与鼠类和蟾蜍的亲缘关系较远。RT-PCR分析表明,PLA2基因在组织中的表达具有组织特异性,在消化器官前肠组织中的表达最高,在性腺及肌肉组织中表达很少。 相似文献
7.
本研究利用RACE和RT-PCR技术克隆了海蜇(Rhopilema esculentum)磷脂酶A2基因(Re-PLA2-1)的cDNA及基因组序列,并分析了其mRNA在海蜇不同发育阶段的表达.Re-PLA2-1基因的cDNA全长为824 bp,包括了48 bp的5'非编码区、504 bp的开放阅读框及272 bp的3'非翻译区.SMART分析显示,Re-PLA2-1为分泌蛋白,包括了一个由19个氨基酸组成的信号肽和一个由118个氨基酸组成的磷脂酶A2结构域.多序列比对和系统进化分析显示,Re-PLA2-1基因与来自星状海葵(Nematostella vectensis)、僧袍芋螺(Conus magus)、长牡蛎(Crassostrea gigas)等磷脂酶A2的相似性较高,共同聚类为pfam09056 GIX PLA2分支,均包含pfam09056家族成员酶活性所必需的Ca2+结合位点、活性催化位点和PLA2结构域所必需形成二硫键的半胱氨酸.Re-PLA2-1基因组全长为2671 bp,由4个外显子和3个内含子组成.RT-PCR结果显示,Re-PLA2-1基因在海蜇4个发育阶段均有表达,其中,横裂体阶段的表达量最高,碟状体阶段最低.这些研究结果为进一步了解海蜇磷脂酶A2毒素的生物功能奠定了基础. 相似文献
8.
为了研究淋巴因子基因(T-cell acute lymphocytic leukemia,tal)在香港牡蛎中的免疫功能,实验采用c DNA末端快速扩增技术(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)克隆了香港牡蛎tal的c DNA全长序列,命名为Chtal,该基因全长812 bp,其中5?非编码区17 bp,3?非编码区135 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)660 bp,编码219个氨基酸,相对分子质量25.11 ku,理论等电点5.80。多序列比对和系统进化树结果显示,Chtal与长牡蛎、美洲牡蛎和海蜗牛tal同源性较高,证明了该基因是软体动物tal家族的一个成员。荧光定量PCR结果显示,Chtal在香港牡蛎血淋巴细胞中表达量最高,其次是心脏、鳃和消化腺。在溶藻弧菌和溶血性葡萄球菌刺激后,Chtal表达量显著上调,分别在24和12 h达到最高水平,随着时间的增加该基因的表达量逐渐下降。亚细胞定位结果显示,Chtal在细胞核中表达。活体注射重组TAL蛋白能够显著提高淋巴细胞的数量,通过Edu增殖实验进一步证实了tal具有促进香港牡蛎血淋巴细胞再生的功能。本研究初步揭示了香港牡蛎tal参与了淋巴细胞再生,为深入研究该基因在牡蛎抗病中的功能提供了依据。 相似文献
9.
采用RACE方法,克隆了背角无齿蚌抗菌肽theromacin基因的cDNA全序列。结果显示,该cDNA序列全长为870 bp,5'端非翻译区104 bp,3'端非翻译区460 bp,开放阅读框长为306 bp,共编码101个氨基酸,相对分子量为11 166.9 u。同源性分析显示,该基因编码的蛋白与三角帆蚌theromacin基因氨基酸序列的相似度最高,为73%;与贻贝中发现的抗菌肽defensins、mytilins、myticins和mytimycins等4种类型相似度较低,属于Macin家族(登录号:KJ598604)。实时荧光定量PCR分析结果显示,该基因在血液、肝脏、外套膜、鳃、斧足和肠等组织中均有表达,在外套膜中的表达量最高,在其他组织中的表达量较低;经嗜水气单胞菌诱导后,各个组织的表达量出现明显上调的趋势且与对照组显著差异,推测theromacin基因可能在背角无齿蚌的免疫反应中起重要作用。 相似文献
10.
瘤背石磺肌肉生长抑制素基因的克隆及组织表达分析 总被引：1，自引：1，他引：0
为探究石磺由海洋向陆地进化过程中肌肉生长和发育的分子机制,实验以石磺科贝类转录组数据为基础,采用RACE方法从瘤背石磺肌肉中首次克隆到MSTN cDNA的全长并做了相应的组织表达分析。结果显示,瘤背石磺MSTN基因cDNA全长2667 bp,包括1650 bp的开放阅读框,374 bp的5′端非翻译区,643 bp的3'端非翻译区,共编码549个氨基酸。预测该基因编码的蛋白质原子总量为8776,分子式为C2774H4331N783O862S26,分子质量约为63.27 ku,理论等电点为6.02,信号肽预测结果显示,N端具有21个氨基酸长度的信号肽。瘤背石磺MSTN具有MSTN的共同特征,包括蛋白酶水解位点RSRR和C端多肽生物活性区以及9个保守的半胱氨酸残基。通过进化树分析,瘤背石磺MSTN与加州海兔MSTN的亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,MSTN基因在各个组织中均有表达;含肌纤维组织中的表达量低于内脏器官的表达量,在肝胰腺中的表达量最高,腹足表达量最低。MSTN基因一级结构具有很高的保守性,说明该基因在进化上的限制性和功能的重要性;同时该基因在石磺非肌肉组织中表达,表明该基因不仅有抑制肌肉生长的作用,还参与其他生命活动的调节。 相似文献
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为了解长牡蛎MITF基因的表达及其与壳色的关联,验证了长牡蛎中的4个MITF基因,对长牡蛎MITF氨基酸序列进行了序列分析和多序列比对,分析了长牡蛎幼体发育各时期的转录组,采用荧光定量PCR的方法研究长牡蛎各组织及黑壳、白壳牡蛎特定部位mRNA表达情况。4个MITF基因中有3个基因可能为假基因,有表达的长牡蛎MITF基因共编码448个氨基酸,为亲水性不稳定蛋白,含有N端结构域(MITFTFEBC3N superfamily)和高度保守的功能性结构域HLH结构域。转录组分析发现MITF在长牡蛎个体发育的各个时期均有表达,在稚贝期达到最高。组织表达结果显示MITF在外套膜中的表达水平显著高于其他组织。MITF在黑壳牡蛎闭壳肌中的表达量显著低于白壳牡蛎,而在黑壳牡蛎外套膜中的表达量高于白壳牡蛎,但不显著。在黑壳、白壳牡蛎外套膜边缘的表达量都显著高于内侧。研究表明,长牡蛎MITF基因可能在牡蛎壳形成早期就参与了黑色素的生成调控和个体的生长发育,可调控牡蛎酪氨酸酶Tyr2基因,参与外套膜和贝壳中黑色素的形成。本研究为进一步研究牡蛎壳色形成机制奠定了基础。 相似文献
12.
The Pacific oyster (Crassostrea gigas) is one of the most important aquaculture species worldwide. Its meat quality is vital for consumer satisfaction, and nutrient content, especially glycogen, is closely associated with oyster fatness and meat colour. Fluctuations in nutrient content of short‐term starvation have not been previously reported, and seasonal variation in glycogen content in different tissues has rarely been reported. In the present study, we investigated these important aspects of oyster production and found that short‐term starvation (50 hr) did not significantly alter glycogen, protein or lipid content. The seasonal variation assay showed that glycogen and lipid accumulation was high in autumn and winter and that seawater temperature and protein content were inversely related to glycogen content. Glycogen content of the whole flesh was higher from January to April and was positively related to the condition index before the onset of gametogenesis. Glycogen content was higher in the gonad, labial palp and mantle compared to the gill or adductor muscle. Relative expression of genes encoding proteins involved in glycogen metabolism (glycogen synthase, glycogen phosphorylase, glycogen debranching enzyme and glycogen branching enzyme) was closely associated with the glycogen content in the corresponding tissues. Glycogen content in the gonad was regulated by glycogen metabolic and glycolysis pathway genes (6‐phosphofructo kinase, phosphoglycerate kinase, pyruvate kinase, hexokinase and glucose transporters), and stored glycogen was the main energy source for gametogenesis. These findings contribute to oyster aquaculture management and glycogen improvement and expand our understanding of glycogen metabolism in oysters. 相似文献
13.
笔者初步研究了企鹅珍珠贝（Pteria penguin）组织蛋白酶D（cathepsin D,CTSD）的基因克隆和功能,通过同源克隆方法和cDNA末端快速扩增技术（RACE）获得了企鹅珍珠贝组织蛋白酶D基因（命名为pgCTSD）。该基因cDNA全长1 767 bp,其中5＇UTR为38 bp,3＇UTR为553 bp,ORF为1 176 bp,编码392个氨基酸,包括信号肽（Met1-Ala18）、前体域（Leu19-Lys47）和成熟域（Tyr48-Ser392）三部分,分子量为42.3 kDa,等电点为8.04。pgCTSD氨基酸序列与大珠母贝（Pinctada maxima）pmCTSD的相似性最高（79%）,与其他物种的相似性为59%～75%。荧光定量分析表明,空白对照组中pgCTSD mRNA在闭壳肌、性腺、肝胰脏、外套膜和鳃组织中都有表达,且在闭壳肌中表达量最少,肝胰脏中最高。与试验对照组相比,脂多糖（LPS）刺激6 h后性腺和肝胰脏显著下降,闭壳肌的表达量虽不大但增加显著,外套膜和鳃组织变化不显著;哈维弧菌（Vibrio harveyi）刺激6 h后肝胰腺和外套膜显著下降,闭壳肌和鳃显著上升,性腺无显著变化。肝胰腺中pgCTSD对LPS和弧菌刺激的应答反应表明pgCTSD可能参与了免疫反应。 相似文献
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采用同源克隆和末端快速扩增（RACE）方法,得到1330bp的军曹鱼（Rachycentroncanadum）MHC-Ⅰα全长cDNA片段。该序列包括76bp的5’末端非编码区（UTR）,189bp的3’UTR及1065bp的开放阅读框（ORF）,编码354个氨基酸,预测其蛋白质分子量约40．10kDa,等电点5．70。构建MHC-Ⅰα氨基酸序列的系统进化树并进行氨基酸相似性比对,结果表明,军曹鱼和已知鱼类及人类（Homosapiens）MHC-Ⅰα氨基酸的同源性在27．9％～67．1％之间。所推测的蛋白序列具有一些重要特征,包括前导肽、α1、α2、α3区、CP／TM／CYT区和保守的半胱氨酸等。Real—timePCR检测结果显示,MHC-Ⅰα基因在各个正常军曹鱼组织中均表达,但表达量各有不同,其中较强的表达于头肾;中等程度表达于鳃、脾和肠;在心、脑和肌肉中表达较弱。 相似文献
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合浦珠母贝热休克蛋白hsp70基因的克隆与表达分析 总被引：10，自引：2，他引：8
采用同源克隆和RT-PCR技术对合浦珠母贝(Pinctada fucata)热休克蛋白hsp70基因进行了克隆和表达分析。获得cDNA全长序列2 365 bp,其中3’非编码区域(UTR)为318 bp,5’UTR为88 bp,开放阅读框(ORF)为1 959 bp,编码652个氨基酸,分子量约为71.39 kD,理论等电点为5.22,并含有3个HSP70家族的签名序列IDLGTTYS、DLGGGTFD和EEVD。同源性分析表明,合浦珠母贝HSP70的氨基酸序列与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)等双壳贝类的相似性高达86%以上,基于氨基酸序列的聚类分析表明,合浦珠母贝与牡蛎属种类亲缘关系最近。高温、高盐刺激后,半定量RT-PCR检测发现hsp70基因的表达明显增加,高温刺激的表达量高于高盐刺激,高温刺激组不同组织的表达量由大到小依次为鳃、消化腺、外套膜、肌肉、性腺,高盐刺激组不同组织的表达量由大到小依次为鳃、外套膜、肌肉、消化腺、性腺,表明HSP70参与了机体对刺激的应答过程。该基因的克隆为进一步深入研究合浦珠母贝的抗逆机理及其遗传改良奠定了重要基础。 相似文献
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近江牡蛎HSC70基因对溶藻弧菌感染的反应 总被引：1，自引：0，他引：1
人工注射溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染近江牡蛎(Crassostrea hongkongensis),通过实时荧光定量RT-PCR方法检测了近江牡蛎6种不同组织器官(外套膜、鳃、消化腺、闭壳肌、心脏和血细胞)中HSC70基因表达量的变化;同时采用平板活菌计数法测定了近江牡蛎不同组织器官中溶藻弧菌菌量的变化。结果显示,人工注射感染溶藻弧菌后,近江牡蛎6种组织器官中HSC70基因表达量均显著性升高(P<0.05),且随时间变化均呈现出先升高后恢复至对照水平的趋势;其中鳃组织中HSC70基因分别在第6小时和第72小时出现2次显著性高表达,且在第72小时的表达量高于第6小时(P<0.05)。在多数组织器官中,HSC70基因出现显著高表达后便急剧下降至对照水平,而在消化腺中高表达持续的时间长达18 h(第6 24小时)。在注射感染溶藻弧菌后第6小时,血细胞中HSC70基因的表达量达到峰值,接近于对照水平的15倍;而在其他组织器官中,该基因表达峰值仅为对照水平的2.5倍左右。人工注射感染溶藻弧菌后3 h,3种组织(消化腺、闭壳肌和血淋巴)中均能检测到溶藻弧菌的积累,其中闭壳肌中含菌量最高,6 h时闭壳肌中含菌量急剧下降,随后又增加并维持在一定水平直至72 h;消化腺中菌量随着时间推移而增加,到达峰值后又逐步下降;血淋巴中,溶藻弧菌含量整体上随时间不断增加,到48 h稳定在较高水平。各组织中HSC70表达量与溶藻弧菌含量之间存在一定的关联性,尤其在溶藻弧菌攻击的靶器官(消化腺)中最为明显。由此可见,病原菌感染可以诱导近江牡蛎HSC70基因高表达,并且HSC70可能参与了机体抗病原菌感染的相关作用,这为进一步研究近江牡蛎HSC70基因在抗病免疫中的作用机制奠定了基础。 相似文献
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Timothy J. Green Brian J. Jones Robert D. Adlard Andrew C. Barnes 《Aquaculture (Amsterdam, Netherlands)》2008,280(1-4):35-38
Differences in the survival of QX-resistant fifth generation (QXR5) and wild-caught (Wild-Caught) Sydney rock oysters were assessed over the QX-disease risk period in the Pimpama River, SE Queensland. Cumulative mortality of Wild-Caught oysters (31.7%) was significantly greater than QXR5 oysters (0.0%) over the 118 days of the experiment. PCR and histological results showed that Wild-Caught oyster did not die from QX disease. Histology revealed oysters were infected with disseminating hemocytic neoplasia, a Steinhausia-like infection, a Rickettsia-like organism infecting epithelial cells of the gill, digenean flukes encysted in the gonadal tissue and a gill response to an unknown toxin. The cause of mortality is attributed to disseminating hemocytic neoplasia. 相似文献
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采用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）技术,克隆了罗非鱼（Oreochromis niloticus）谷胱甘肽过氧化物酶1（glutathione pemxidasel,GPx1）基因完整的编码序列（complete coding sequence,CDS）。GPx1基因全长984bp,5’uTR56bp,CDS576bp,3’UTR352bp,PolyA20bp;第791—885位碱基（位于3’UTR）形成1个硒半胱氨酸插入序列（selenocysteine insertion sequence,SECIS）,协助174～176位密码子TGA（UGA）编码1个硒半胱氨酸（Sec）。GPx1包含191个氨基酸,分子量21．8kDa,等电点8．04,无信号肽和潜在的N．糖基化位点。蛋白结构分析表明该基因编码蛋白为非跨膜蛋白。序列比对显示,GPx1单体具有Sec、Trp、Gln和Asn构成的催化四联体。罗非鱼GPx1与其他脊椎动物GPx1相比较,核苷酸序列相似性为43．2％-58．2％,氨基酸序列相似性为58．1％～80．6％。进化分析显示,处在分类学上不同纲的脊椎动物GPx1分别占据了不同分支。利用Swiss-Model预测了罗非鱼GPx1的3D结构,序列分析显示,GPx1可以形成1个同源四聚体。 相似文献