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间接免疫荧光检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒及抗原定位方法的初步建立 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】建立间接免疫荧光（IFA）检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒（DSHDV）的方法,为DSHDV感染的实验室诊断、DSHDV在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位和动态研究提供有效的检测手段。【方法】用差速离心纯化DSHDV,将纯化DSHDV免疫家兔制备兔抗DSHDV高免血清,并以DEAE-SephadexA-50柱层析纯化出兔抗DSHDV IgG,建立IFA检测石蜡切片中DSHDV的方法;利用建立的IFA对28日龄鸭人工感染DSHDV死亡鸭不同组织器官以及临床样品进行检测。应用PAGE电泳分析DSHDV基因组特性。【结果】IFA最佳条件为：切片在0.01 mol•L-1 柠檬酸（pH 6.0）缓冲液微波修复20 min后,以10%马血清37℃下封闭30 min,然后加入1﹕50的一抗4℃孵育过夜,最后加入1﹕100 FITC标记的含0.01%伊文斯蓝的二抗37℃孵育30 min。IFA检测DSHDV感染死亡鸭肝脏石蜡切片为阳性,而检测鸭瘟、禽流感病毒(H5N1)、鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌感染死亡鸭肝脏石蜡切片为阴性。IFA检测28日龄人工感染DSHDV死亡鸭的不同组织器官,心、肝、脾、胰、肺、肾、法氏囊、食管、气管、胸肌、胸腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠为阳性;哈德氏腺、脑、皮肤、腺胃为阴性。阳性组织中病毒抗原主要分布在细胞浆。经甲醛固定保持1～6年的临床死亡鸭的病毒分离阳性肝脏,IFA检测结果也呈阳性。DSHDV具有呼肠孤病毒特征,有10条分节段核酸,呈“334”分布。【结论】建立的检测石蜡组织切片中DSHDV抗原的IFA具有直观、特异性强的优点,应用于DSHDV在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位具有良好效果,可用于DSHDV感染的实验室诊断、病原在鸭组织细胞中分布研究。DSHDV抗原存在感染细胞浆,肠道、肾脏、法氏囊和胸腺是DSHDV侵害的主要靶器官。 相似文献
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【目的】建立一种可同时检测并鉴别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒的PCR方法。【方法】根据已发布的鸭圆环病毒和鹅圆环病毒基因组分子特征设计3条引物，应用3条引物建立了一种在一个反应管中可检测并鉴别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒的三引物PCR方法。【结果】该方法可特异性扩增鸭圆环病毒和鹅圆环病毒，并根据扩增片段大小鉴别病毒种类，检测最低限分别为110、80 pg·μL-1。应用该方法对临床疑似病例样品进行检测，其结果与用2种病毒对应的单病毒PCR检测方法一致。【结论】建立的三引物PCR方法特异性强，敏感性高，丰富了水禽圆环病毒病的临床病例的诊断及流行病学监测的技术手段。 相似文献
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鸭肠炎病毒核衣壳蛋白质互作蛋白质基因荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为进一步阐明鸭肠炎病毒(DEV)的致病机理,本试验建立检测鸭肠炎病毒核衣壳蛋白质(NP)的互作蛋白质(PKCI)基因荧光定量PCR方法。针对PKCI基因设计特异性引物,经PCR扩增目的基因构建重组质粒p MD18-T-PKCI,将其作为阳性标准品构建荧光定量PCR标准曲线,并对建立的荧光定量PCR方法进行重复性、特异性和敏感性试验。结果显示:标准曲线的线性关系为Y=-3.31x+42.00,相关系数为-1.00,扩增效率为100%,熔解曲线仅出现单特异峰,对H5亚型、H7亚型和H9亚型禽流感病毒及新城疫病毒、鸭肝炎病毒均未检测到荧光信号。表明本试验建立的方法具有良好的稳定性、特异性和灵敏性。 相似文献
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【研究目的】建立一种便于检测鸭病毒性肝炎抗体的方法。【研究方法】将纯化的鸭病毒性肝炎I型病毒(DHV-I)致敏双醛化红细胞,制备检测DHV抗体的间接血凝诊断抗原。【研究结果】使用该抗原对9种常见的禽传染病阳性血清、15只随机抽样的非免疫鸭血清进行检测,抗体均为阴性;检测被鸭病毒性肝炎I型病毒阻断后的阳性血清,抗体为阴性;用不同批次的诊断抗原检测同一血清样品结果显示一致;敏感性是琼脂扩散试验的32～64倍;对15只随机抽样的免疫鸭进行检测,阳性率达93%。【结论】该方法敏感性较高、特异性强、重复性好,可用于疫苗免疫后抗体水平的检测及鸭病毒性肝炎的流行病学调查。 相似文献
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表达绿色荧光蛋白重组鸭肠炎病毒构建 总被引：2，自引：2，他引：0
【目的】鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV)不同毒株间存在明显差异,DEV疫苗株的UL2基因在195bp后连续缺失528bp,导致第65位氨基酸后连续缺失176aa[1]。将绿色荧光蛋白（GFP）基因插入DEV UL2基因中,获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒,以研究UL2基因对DEV生物特性的影响和探讨DEV作为载体表达外源基因的可行性。【方法】以实验室保存的DEV细胞适应株DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒UL2基因上下游序列并克隆入pMD-18T载体;以UL2基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂,将CMV启动子控制的含有GFP-gpt基因表达盒克隆入DEV UL2基因中,构建含GFP基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt;用脂质体将其与DEV细胞适应株共转染CEF细胞,待80%细胞出现病变后,冻融3次,接种到新鲜CEF细胞单层的6孔培养板中,用含5%血清、1%双抗、1%琼脂的M199培养液覆盖,在荧光显微镜下挑取单个有绿色荧光的蚀斑,再接到新的细胞上,重复蚀斑筛选、纯化表达绿色荧光蛋白的重组病毒;利用PCR、基因测序技术鉴定重组病毒;重组病毒接种CEF（moi=0.01）,每12h取出1瓶接毒细胞,分别收集上清和细胞,测量其病毒含量,绘制一步生长曲线;重组病毒在CEF中连续传代20次,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,并用PCR检测GFP的传代稳定性;重组病毒免疫4周龄SPF鸭后14d,肌肉注射接种DEV强毒（CVCC AV1221）,观察免疫保护情况。【结果】经双酶切鉴定,成功构建了含绿色荧光蛋白报告基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt,将其与DEV共转染CEF细胞后8h,即可见转染细胞中有带有绿色荧光的梭形细胞,经过8轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△UL2-GFP-gpt;PCR鉴定及基因测序结果显示,GFP标记基因成功地插入到DEV基因组中,替换了DEV UL2基因的196-723位核苷酸;一步生长曲线结果显示,重组病毒在细胞和上清中的病毒含量分别在36h和72h达到峰值,为106.2TCID50/0.1mL、105.5TCID50/0.1mL,与亲本毒无明显差异;重组病毒在CEF中连续传代,1-5代可以稳定表达GFP基因,第6代起,开始出现少量没有荧光的细胞病变,15-20代中绝大部分细胞病变无绿色荧光,GFP在细胞连续传代过程中容易出现突变;重组病毒以103.0TCID50/只免疫麻鸭,免疫后14d能完全抵抗DEV强毒株的攻击,与亲本毒免疫原性一致。【结论】成功构建了表达绿色荧光蛋白的DEV,首次证实UL2基因缺失不影响其在细胞中的复制,也不影响其免疫原性,为DEV UL2基因功能、活载体疫苗研究奠定了基础。 相似文献
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为建立鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)强毒和疫苗弱毒的鉴别诊断方法,通过分析比较GenBank数据库中上传的DEV强毒株和疫苗弱毒株UL2基因核苷酸序列,分析DEV疫苗弱毒和DEV强毒在UL2基因上的核苷酸序列,利用引物设计软件Oligo 7.0,设计一组可对DEV强毒株和疫苗弱毒株UL2基因进行编码区全长扩增的特异性引物,经条件优化后建立DEV强毒和疫苗弱毒鉴别诊断的PCR方法。结果表明,DEV疫苗弱毒和DEV强毒在UL2基因上存在528bp的连续核苷酸序列缺失。优化后的PCR方法最佳退火温度为55℃,对DEV强毒和疫苗弱毒扩增片段大小分别为1 019bp和491bp;敏感性强,最低检测限为15.3pg;特异性好,对鸭源常见传染病(如番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)均无特异性扩增。 相似文献
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表达小鹅瘟病毒VP2蛋白重组鸭瘟病毒的构建及其生物学特性 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】鸭瘟和小鹅瘟是番鸭和鹅的两种重要传染病,鸭瘟最主要的防治措施是定期接种鸭瘟病毒减毒活疫苗。根据2012年国际病毒分类委员会（ICTV）的报告,DEV被归为疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科马立克氏病毒属。疱疹病毒如伪狂犬病毒、马立克氏病毒、火鸡疱疹病毒等已广泛用于病毒活载体的研究,而近几年也有关于鸭瘟病毒（DEV）作为疫苗活载体的报道。为了为免疫防控鸭瘟和小鹅瘟提供新手段,本研究拟在鸭瘟病毒疫苗株感染性克隆的基础上,构建表达小鹅瘟病毒（GPV）主要免疫原蛋白VP2的重组病毒rDEV-VP2,并研究其生物学特性,进而探讨重组病毒rDEV-VP2作为防治DEV和GPV的二联重组活载体疫苗的可能性。【方法】将密码子优化的GPV VP2基因通过常规基因克隆的方法插入转移载体pEP-BGH-end,构建含有GPV VP2表达框pCMV-VP2-BGH-pA的重组表达质粒。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,通过“Red E/T”两步重组法将GPV VP2基因表达框插入到DEV US7和US8基因之间构建了突变体克隆pDEV-VP2。利用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得重组病毒rDEV-VP2和删除Bac质粒序列的rDEV-VP2-Cre,并对重组病毒细胞体外生长曲线、蚀斑大小和VP2蛋白表达情况进行测定。将rDEV-VP2接种番鸭,在不同时间采集血清,采用间接ELISA法检测血清中GPV VP2抗体产生情况。【结果】间接免疫荧光检测和Western blotting分析表明,外源蛋白VP2在CEFs细胞成功表达。病毒生长曲线和蚀斑大小测定结果显示,rDEV-VP2在CEFs细胞上的增殖滴度与亲本株相比无显著差异,表明外源基因VP2的插入不影响rDEV重组病毒的增殖。动物试验结果表明,7日龄雏番鸭接种rDEV-VP2可以诱导产生针对GPV VP2的抗体,免疫后3周抗体阳性率为50%（4/8）。【结论】本实验将小鹅瘟病毒的主要免疫原基因VP2插入到DEV疫苗株基因组的US7和US8基因间构建了表达该免疫原性基因的重组鸭瘟病毒细菌人工染色体,继而在鸡胚成纤维细胞（CEFs）上拯救获得了重组病毒rDEV-VP2,病毒细胞生长特性与亲本株基本一致,且能诱导鸭体产生GPV VP2特异性的抗体。该研究为研制DEV-GPV二联重组活载体疫苗奠定了基础。 相似文献
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以鸭肠炎病毒(DEV)SD-01株DNA为模板,根据GenBank上已发表的基因序列设计一对引物,利用PCR技术扩增出US2全基因,将目的条带连入pGM-T载体,得到的阳性重组质粒命名为pGM-US2并进行序列测定。将测序结果与疫苗株、鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗(C-KCE)株和单纯疱疹病毒-1型(HSV-1)、马立克氏病病毒(MDV)、伪狂犬病病毒(PRV)的US2基因同源性进行比较,发现核苷酸和氨基酸的序列同源性分别为100%~25.8%和100%~28%。结果表明,US2基因在DEV中是完全保守的,但与其它疱疹病毒相比同源性较低。 相似文献
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用黄曲霉毒素B1单抗介导免疫组化法检测雏鸭感染黄曲霉毒素的分布规律研究 总被引：4，自引：2，他引：2
【目的】（1）建立单抗介导的、能够对黄曲霉毒素AFB1进行亚细胞定位的免疫组化方法;（2）探明AFB1侵染和分布于雏鸭靶器官（细胞）规律,为阐明AFB1对雏鸭的致病机理提供基础实验数据,为AFB1感染人类提供研究模型。【方法】（1）利用AFB1单抗、免疫组化理论和方法,结合石蜡切片技术,建立检测感染雏鸭组织器官和细胞中AFB1方法;（2）7日龄樱桃谷鸭饲喂黄曲霉毒素（AFB1）含量为150 µg•kg-1的全价饲料,分别于6、12、24、48、72、96、120、144、168和192 h各剖杀2只,取心、肝、脾、肺、肾、脑、十二指肠、法氏囊、胸腺和胰腺等组织器官多聚甲醛固定、石蜡包埋,应用建立的单抗介导免疫组化对AFB1在感染雏鸭体内侵染的组织器官和细胞进行定位检测。【结果】（1）建立的单抗介导的免疫组化能够特异性检测到感染雏鸭组织中的AFB1,而对鸭病毒性肝炎病毒、鸭疫里默氏杆菌、鸭多杀性巴氏杆菌、鸭沙门氏菌和鸭大肠杆菌感染鸭组织呈现阴性反应;（2）雏鸭采食含AFB1饲料后,24 h可在肝脏和肾脏中检测到AFB1,随后在脾脏（48 h）、胰腺（96 h）、十二指肠（120 h）、心肌（144 h）及法氏囊（168 h）检测到AFB1,其中肝脏和肾脏的阳性结果最强;AFB1分布于肝脏肝窦及汇管区周围炎性反应带的肝细胞,肾脏肾小管、集合管上皮细胞以及肾小球毛细血管,脾脏白髓及炎性细胞,胰腺腺上皮细胞,十二指肠脱落的黏膜上皮细胞,心脏血管周围和心脏发生空泡变性的心肌纤维中;AFB1主要集中分布于细胞核内,而细胞膜和细胞浆内也有少量的分布。【结论】（1）单抗介导免疫组化能够特异检测AFB1感染雏鸭组织石蜡切片中的AFB1和亚细胞定位, 还可用于AFB1感染雏鸭的实验室诊断和甲醛固定组织的回顾性诊断;（2）AFB1可广泛侵害感染雏鸭各个组织器官,以肝脏和肾脏最为严重。AFB1主要蓄积于被感染的细胞核。 相似文献
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表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建 总被引：1，自引：1，他引：0
【背景】H9亚型禽流感病毒（AIV）存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒（DEV）属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10 3 TCID50免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量（10 3-10 6TCID50）rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制（HI）抗体,并在免疫后28 d,以10 8EID50的剂量静脉注射H9N2 AIV（A/duck/GD/08）,攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10 3 TCID50免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-ΔgE-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10 3TCID50剂量免疫组HI抗体效价达到1:2 4,而10 4-10 6TCID50剂量免疫组HI抗体效价在1:2 2.4-1:2 3。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10 3、10 4、10 6TCID50免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10 5TCID50免疫组保护率为80%（4/5）,1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。 相似文献
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全面系统地总结了哺乳动物显微受精的发展历史和现状，从注射部位、精子状态、精子发生、卵子状态、卵子激活等方面阐述了影响显微受精的主要因素，并指出了在我国开展显微受精的重要性和必要性。 相似文献
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为了进一步提高设施农业气象服务水平,对盘锦地区冬季日光温室小气候变化规律进行了分析。结果表明：不同天气条件下日光温室各月气温日变化趋势相似,均呈“单峰”曲线型。晴天和多云天气日光温室内相对湿度昼高夜低;阴天和雨雪天日光温室内相对湿度变化比较平稳。不同天气条件下冬季日光温室室内总辐射最大值出现月份不同,有无草帘对温室内总辐射值影响较大。 相似文献
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相思树种的体外繁殖及基因工程研究进展 总被引：3，自引：0，他引：3
该文从茎尖的培养、器官发生和体细胞胚胎发生3个方面详细综述了国内外近30年来相思树体外繁殖的研究进展,并分析总结了相思树基因工程育种的研究近况,从而提出了相思树体外繁殖及基因工程研究所存在的问题及发展趋势.认为只有在阐明相思树体外再生的生化、生理机制的基础上,才能对其体外繁殖进行有效的控制,进而促进更多、更有价值的林木基因工程新品种的培育. 相似文献
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对适宜新辟桃园的除草剂品种进行了比较,筛选并研究了合理的混用技术。在所选的５ 种药剂中,克芜踪的速效性最好,但持效期短。用２０％ 克芜踪３ ０００ｍ ｌ／ｈｍ ２ 喷施,药后１０天,杂草平均株防效和鲜重防效达９１．１％ 和９６．２％ ;药后１５ 天,杂草开始复生,防效下降;药后６０ 天株防效和鲜重防效降至３５．４％ 和６７．７％ 。草甘膦系列的除草净度高、防效持久,但药效发挥较缓慢。用４１％ 农达５ ２５０ｍ ｌ／ｈｍ ２,药后２０ 天株防效和鲜重防效达９０．７％ 和９３．１％ ;药后６０ 天株防效和鲜重防效仍达９４．０％ 和９３．７％ 。克芜踪、草甘膦系列除草剂与禾耐斯（乙草胺）混配,能互补长短,提高药效。混用后,克芜踪防效提高２％ ～８％ ;农达、草甘膦防效提高２％ ～５％ 。人工锄草株防效和鲜重防效仅为７０．６％ 和８４．１％ ,且山地表土层松动后易造成水肥流失。 相似文献
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[目的]利用低毒纳米硒对小白菜进行补硒。[方法]利用水浴法在表面活性剂辅助下制备表征纳米硒;将红色纳米硒用于小白菜补硒试验,并使用邻苯二胺紫外分光光度法测定样本含硒量、回收率和稳定性,分析低毒纳米硒对小白菜进行补硒的可行性。[结果]经过纳米硒补硒的小白菜含硒量平均为5.326μg/g,比未经补硒的小白菜含硒量提高了6倍多。试验回收率在97.84%～100.47%,样本在24 h内稳定,补硒效果明显。[结论]该研究为富硒蔬菜的开发与研究提供了有益的参考。 相似文献