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1.
通过PCR扩增出2.2kb的山羊β-乳球蛋白基因5′端的调控序列,包括第一外显子和第一内含子。测序结果表明,该序列与GenBank中登录序列相比,同源性为99.5%。用其替代表达载体pEGFP-c1上原来的启动子CMV,指导报告基因绿色荧光蛋白(GFP)在山羊乳腺细胞中的瞬时表达,结果发现该调控序列可以有效指导报告基因的表达,从而初步验证了所克隆的山羊乳球蛋白(BLG)基因表达调控序列的有效性。表明克隆的调控序列可用于乳腺生物反应器的研究。 相似文献
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从奶山羊组织提取基因组 DNA,根据已发表的山羊 β-乳球蛋白基因 (BLG)序列设计引物 ,用高保真长模板PCR法克隆得 6个奶山羊 BLG基因片段。这 6个基因片段的大小和部分限制性酶切图谱与已发表的山羊 BLG基因相同。部分序列测定结果显示 :6个奶山羊 BLG基因片段与山羊 BLG基因相应片段的同源性为 99%。进一步序列测定结果表明 :奶山羊 BLG基因 5′调控区与山羊、绵羊和牛的同源性分别为 99%、95%和 90 % ,3′调控区与这些动物的同源性分别为 99%、97%和 92 %。在乳腺特异表达调控元件集中的 -4 0 6bp区域内 ,奶山羊 BLG基因与山羊 BLG基因有 2个碱基的差异。所克隆的奶山羊 BLG基因调控区与山羊 BLG伪基因显著不同 ,其同源性仅为 83 % (上游调控区 )和88% (下游调控区 )。这些结果表明 :不同种动物的 BLG基因是高度保守的 ,高保真 PCR克隆的奶山羊 BLG基因调控区可用于乳腺特异表达载体的构建 相似文献
4.
【目的】为获得高启动效率的乳腺特异启动子,对荷斯坦奶牛、娟姗牛和奶水牛的β-酪蛋白基因启动子进行比较研究。【方法】对Genbank中所收录的荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β-酪蛋白基因启动子序列进行比对分析,按照保守序列分别设计启动子区和3′端ploy A序列引物,同时设计人IFNα-2b基因和EGFP-Neo筛选序列引物并引入预先设计的酶切位点以方便载体构建。采集静脉血液,提取基因组DNA。PCR克隆β-酪蛋白基因启动子区和3′端ploy A区,同时以实验室保存质粒为模板克隆人IFNα-2b基因和EGFP-Neo筛选序列。测序正确后,将各片段按设计顺序依次插入p MD18-T骨架中,构建成p HSTBCNp-IFN,p JSBCNp-IFN和p SNBCNp-IFN乳腺特异表达载体。将各载体转染Bcap-37细胞,经G418筛选出稳定整合的转基因细胞系。用胰岛素(1 mg·L-1),转铁蛋白因子(1 mg·L-1),氢化可的松(1 mg·L-1)和PRL(250IU·L-1)联合对转基因细胞系进行诱导,然后用PCR、Western blotting、QRT-PCR技术和ELISA方法分别在m RNA水平和蛋白质水平检测IFNα-2b的表达。【结果】PCR后获得了荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β-酪蛋白基因启动子区,长度分别为5 219、5 244和5 216 bp,其中包括了第一外显子,第一内含子和部分第二外显子,部分第二外显子的51个碱基编码17个氨基酸的信号肽序列。克隆了1 166 bp的ploy A区序列。最终将构建的3个乳腺特异表达载体转染Bcap-37细胞并经过G418筛选后,获得了3个转基因细胞系。经激素诱导后,PCR、Western blotting、QRT-PCR和ELISA检测发现3个转基因细胞系都表达了IFNα-2b基因,并且发现娟姗牛β-酪蛋白基因启动子在调控IFNα-2b基因的表达上效率较高,在m RNA水平和蛋白质水平上显著高于其他两个启动子(P0.05)。【结论】娟姗牛β-酪蛋白基因启动子在调控外源基因表达上具有较高的效率,是具有应用前景的乳腺特异性启动子。所构建的表达载体为IFNα-2b转基因动物乳腺生物反应器的制备奠定基础。 相似文献
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利用普通及重组PCR技术克隆了奶牛β-酪蛋白基因(CSN2)5′调控成分(2826bp)和3′调控成分(620bp)。前者包括5′上游调控序列、第一外显子及部分第一内含子;后者主要包括最后一个不翻译的外显子和3′侧翼序列。纯化PCR产物通过pMD18-TVector亚克隆后测序并进行软件分析的结果表明,2个克隆片断与奶牛CSN2相应区域同源性分别为99.0%和98.0%,并且包含有全部的CSN2表达核心调控序列和多个转录、翻译因子的结合位点。 相似文献
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【目的】分析山羊PRNP基因启动子活性区域,旨在筛选调节朊蛋白表达水平的关键区域或转录因子,为阐明山羊PRNP基因的表达调控提供理论依据,并为从遗传学角度降低朊蛋白病的发生提供思路。【方法】以山羊PRNP基因序列（GenBank登录号：EU870890）为模板,设计特异性引物,扩增山羊PRNP基因5′侧翼区片段,并将扩增片段克隆至pEASY-T3载体,鉴定为阳性的克隆进行测序;利用生物信息学方法和在线工具进行启动子区域和转录因子结合位点的预测;利用缺失突变技术扩增启动子区不同长度的片段11个,并克隆至pEASY-T3载体后,鉴定为阳性的质粒和pGL3-Basic载体分别用限制性内切酶Mlu I和Bgl II进行酶切,并回收酶切产物;利用T4连接酶进行目的片段与pGL3-Basic连接,鉴定为阳性的荧光素酶报告基因重组质粒进行测序,并提取无内毒素质粒,用脂质体转染法瞬时转染至SH-SY5Y细胞,转染48h后,利用双荧光素酶检测试剂盒进行各缺失突变重组质粒在细胞内的启动活性检测。【结果】成功克隆了山羊PRNP基因5′侧翼区片段,长度为2 332 bp,且该片段含有预测的启动子活性区域、保守的motifs和多个转录因子的结合位点;成功克隆了11个含有不同长度启动子的片段,并与荧光素酶报告基因连接,并构建了目的片段与荧光素酶报告基因的重组质粒;转染时脂质体与DNA的比例为1﹕0.5,萤火虫荧光素酶载体与海肾荧光素酶比例为50﹕1;山羊PRNP基因5′侧翼区存在着核心启动子,启动子活性最强的区域为-519-+82 bp,且在-220-+59 bp这一区域存在着正调控元件,外显子1对启动子活性中起重要的调控作用;4个motifs可能为正调控元件结合位点;在强启动子活性区存在10个Sp1结合位点,2个AP-2 alpha结合位点和1个AP-1结合位点;山羊PRNP基因motif 3和motif 4分别预测为转录因子Foxp3和COE 1的结合位点。【结论】确定了山羊PRNP基因启动子的核心区域（-519-+82bp）,外显子1对启动子活性起重要的调控作用。 相似文献
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奶山羊β—乳球蛋白基因及其调控区的克隆和序列分析 总被引：6，自引：1，他引：6
从奶山羊组织提取基因组DNA，根据已发表的山羊β－乳球蛋白基因（BLC）序列设计引物，用高保真长模板PCR法克隆得6个奶山羊BLG基因片段，这6个基因片段的大小和部分限制性酶切图谱与已发表的山羊BLG基因相同，部分序列测定结果显示：6个奶山羊BLG基因片优山关BLC基因相应片段的同源性为99％，进一步序列测定结果表明：奶山羊BLG基因5调控区与山羊，绵羊和牛的同源性分别为99％，95％和90％，3调控区与这些动物的同源性分别为99％，97％和92％，在乳腺特异表达调控元件集中的－406bp区域内，奶山羊BLG基因与山羊BLG基因有2个碱基的差异，所克隆的奶山羊BLG基因调控区与山羊BLG伪基因显著不同，其同源性仅为83％（上游调控区）和88％（下游调控区），这些结果表明：不同种动物 的BLG基因是高度保守的，高保真PCR克隆的奶山羊BLG基因调控区可用于乳腺特异表达载体的构建。β 相似文献
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【目的】研究酪蛋白中αs2酪蛋白(CSN1S2)基因和K酪蛋白(CSN3)基因在西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达量及其与产奶性状的关系。【方法】根据山羊CSN1S2和CSN3的mRNA序列(CSN1S2:AJ289716,CSN3:EF564258)设计实时定量特异性引物,采用实时荧光定量PCR法,对年均产奶量不同的3组西农萨能奶山羊进行mRNA转录水平上的相对定量分析,并测定乳脂和乳蛋白的含量,同时对扩增出的mRNA片段进行克隆测序。【结果】CSN1S2基因在第1组15只西农萨能奶山羊(年均产奶量为(1 100.00±15.00)kg)乳腺组织中的相对表达量是第2组15只奶山羊(年均产奶量为(600.00±12.00)kg)的2.47倍,二者差异极显著(P0.01);CSN3基因在第1组西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达量是第2组的3.10倍,二者差异极显著(P0.01);测序后进行序列比对发现,目的mRNA片段与山羊CSN1S2和CSN3基因的同源性均为100%;CSN1S2基因在西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达量与乳汁中蛋白质含量相关性不显著,与脂肪含量呈显著负相关;CSN3基因的表达量与乳汁中蛋白质含量呈显著正相关,与脂肪含量相关性不显著。【结论】CSN1S2基因和CSN3基因在西农萨能奶山羊乳腺中的表达量对乳蛋白和产奶量有显著影响(P0.05),可作为西农萨能奶山羊产奶性状选育的候选基因。 相似文献
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为探讨漏芦对泌乳动物乳腺酪蛋白合成的调节机制,利用细胞活力分析仪检测漏芦乙醇提取物(25、50、100、200、400、600、800μg/mL)对奶山羊乳腺上皮细胞活力和增殖能力的影响,并选择不抑制细胞生长增殖的乙醇提取物剂量,研究其对奶山羊乳腺上皮细胞酪蛋白合成相关基因mRNA表达的影响;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测乳腺上皮细胞αs1-酪蛋白(CSN1S1)、αs2-酪蛋白(CSN1S2)、β-酪蛋白(CSN2)、κ-酪蛋白(CSN3)、信号转导与转录激活因子5(STAT5)、蛋白质酪氨酸激酶2(JAK2)、哺乳动物雷帕霉素蛋白(mTOR)、真核细胞翻译启动因子4E结合蛋白1(4EBP1)及核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)基因的mRNA表达水平。结果表明,较高剂量(200～800μg/mL)的漏芦乙醇提取物明显抑制了奶山羊乳腺上皮细胞的活力和增殖能力(P0.05),故后续试验添加25、50、100μg/mL的漏芦乙醇提取物处理乳腺上皮细胞;漏芦乙醇提取物可明显上调细胞酪蛋白基因CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3及酪蛋白合成相关基因STAT5、JAK2、mTOR、S6K1的mRNA表达水平(P0.05),但显著下调了4EBP1基因的mRNA表达水平(P0.05)。由此可见,漏芦乙醇提取物能通过调节奶山羊乳腺上皮细胞酪蛋白合成相关基因的表达,进而促进乳腺细胞酪蛋白的合成。 相似文献
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动物乳腺特异表达载体的构建及其表达特性研究 总被引：6，自引：0，他引：6
为了研制动物乳腺生物反应器,用中国奶山羊β-乳球蛋白基因的5′、3′-侧翼区和β-酪蛋白基因的第1内含子构建动物乳腺特异表达载体p205C3.细胞表达试验结果显示,p205C3载体能够指导lacZ基因在SV40 T基因转化的山羊乳腺上皮细胞中表达,不能指导该基因在COS-1细胞和山羊成纤维细胞中表达.将人激肽释放酶(hKLK1) cDNA克隆入p205C3载体,用获得的重组载体p205C3KLK1注射哺乳期小鼠,然后取其心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、胰腺和乳汁,酶活性测定结果显示,乳汁中的酶活性高达255.65 U·mL-1,其他组织中的酶活性与正常小鼠无差异.结果表明p205C3载体不仅能有效地指导外源基因在山羊乳腺细胞和小鼠乳腺中表达,而且表达具有较好的组织特异性,可以用于动物乳腺生物反应器的研制. 相似文献
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西部地区大开发是东部地区产业梯度转移的需要:在经历了改革开放20余年的高速发展之后,东部地区的劳动力成本日渐提高,其劳动力密集型产业日渐失去比较优势,东部的这些产业急需向中西部地区转移;西部大开发还是启动内需政策的需要:中央投资于西部的基础设施所带来的牵引投资效应将是巨大的;西部大开发更是可持续发展的需要:只有使西部走出“发展中的陷阱”,才能使西部的生态环境进入良性循环,只有进行西部大开发,才能使西部地区的社会经济“软环境”得到根本改善.…… 相似文献
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尤金亮 《安徽农业大学学报》2008,(3):54-58
从犯的原因力是指成立从犯所必需的因行为人的行为与其他人的犯罪行为之间产生的内在的必然联系。从犯是否成立,要经过一般性判断、具体性判断和排除性判断三个环节。一般性判断主要考虑是否具有成立从犯所要求的主观要件和客观要件,具体性判断涉及事前判断与事后判断、主观判断和客观判断、应然判断与实然判断,排除性判断主要考虑刑法分则的特殊规定和刑法总则中的但书。 相似文献
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吉林省通榆县向海水库为通榆县水利事业发展做出了突出贡献。分析向海水库发展的现状,认为要加强对向海水库的管理,因地制宜,通过向海这一品牌发展旅游经济。 相似文献
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N. A. Tsarenko 《Russian Agricultural Sciences》2013,39(2):124-128
The seasonal rhythms of the development of the plants of 15 taxons of the Prunus L. genus in the south of the Russian Far East were analyzed. Based on the biological features of the plants, a dendrogram of phylogenetic interrelations of species within the genus was constructed. 相似文献
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将信息理论与物流模型的研究挂接 ,定义了生态系统的信息熵和信息流量。以各分室输出量占总体的份额作为系统选择该分室的概率。通过对系统聚合度和冗余度的分析 ,推导了二者对各分室的灵敏度。对黑龙江省双城市双城镇永和村的物流模型进行了灵敏度分析。计算结果表明 ,籽粒和土壤分室对系统的稳定性起重要作用 ;而调整畜牧业的结构 ,改变农肥的投入量等 ,可以有效地改善系统的物流情况 ,使系统向良性循环 相似文献
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树冠圆满度对树木生长的影响及作用研究 总被引：4，自引：0，他引：4
树冠是树木的重要组成部分,其数量指标———树冠圆满度不仅客观地反映了树木占有生长空间的状况及竞争能力,而且对树木的生长过程和树木的形状都有着非常重要的影响。研究结果表明:在树木直径、树高较小(或年龄小)时,其树干材积也较小,而树冠圆满度较大,随着直径、树高的增加,其树干材积随之增加,但树冠圆满度逐渐变小。所以,树冠圆满度与直径、树高及树干材积之间存在着紧密的相关关系,其相关指数(R)基本上在0 80以上,而形数与树冠圆满度之间呈正相关。 相似文献
19.
猪场空气细菌数量与猪高热综合征的相关性研究 总被引：5，自引：0，他引：5
自2001年入夏以来,浙江、上海等许多地区的猪群中流行以持续高热、气喘、皮肤发红为主要特征的猪"高热综合征",给养猪业带来了巨大的损失.但到目前为止,其主要病原依然未被确定.为了研究空气中细菌含量与该病的发生和严重程度之间的关系,我们对浙江省几个不同规模、不同发病情况的猪场的空气细菌含量进行了测试.结果发现:该病的发生及严重程度与猪舍内空气的细菌含量存在着明显的正相关性. 相似文献
20.
刺五加种胚生长发育规律的分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为解决刺五加种子休眠难以打破,一般情况下种子出苗率很低的难题,对当年生刺五加种胚的生长发育规律进行了研究.结果表明,种胚生长发育表现出S形生长曲线,即前期缓慢生长期,中期快速生长期,及再次缓慢生长的生理后熟期.各个时期所需要的适宜温度和时间各不相同,在种子处理的各个阶段及时调整好适宜温度时,裂口率可达70%以上,裂口籽发芽率可达90%以上. 相似文献