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南瓜 NBS类抗病基因同源序列的克隆与分析 总被引：2，自引：0，他引：2
依据已克隆植物抗病基因的保守氨基酸结构域合成相应简并引物,通过PCR扩增从南瓜基因组DNA中分离了8条南瓜抗病基因同源序列,通过对其编码的氨基酸序列分析表明这些RGAs均含有P-loop及GLPL等植物抗病基因中的保守结构域.经BLAST分析表明,分离的南瓜RGAs与已报道的甜瓜等植物的RGAs有较高的同源性.南瓜RGA的分离将为进一步从南瓜中分离功能性抗病基因打下基础,也为研究南瓜种质资源的起源与进化提供借鉴. 相似文献
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《中国瓜菜》2014,(Z1)
R基因产物是植物抵抗病原物侵害的重要组成部分,在目前已经发现的植物抗病基因中,NBSLRR类占了绝大多数,在植物抗病基因中占有重要地位。NBS结构域是NBS-LRR基因编码蛋白中最保守的部分,含有8个保守基序,包括P-loop(又称Kinase-1a)、Kinase-2a、Kinase-3a和GLPL疏水结构域等。对西瓜NBS的克隆和分析将有助于筛选西瓜抗病基因及各种抗病基因的分子标记,而且通过对西瓜NBS的结构、表达和调控的研究,将有助于深入阐释西瓜的抗病机制。以根结线虫抗病西瓜材料‘红籽瓜’和感病西瓜材料‘ZDPI0006’为试材,根据西瓜NBS保守区设计简并引物及特异引物50对,根据葫芦科抗病基因序列在西瓜基因组数据库搜索同源序列,并以此设计特异引物1对,分别提取西瓜叶片g DNA和RNA并反转录成c DNA,采用PCR扩增西瓜抗病基因同源序列,琼脂糖电泳检测回收目标条带,克隆测序后结果提交到Gene Bank进行序列比对,提交至Pfam在线分析蛋白质功能,利用Clustalx与其他物种的抗病基因进行同源性分析,利用dnasp等软件进行序列多态性分析。结果表明,49对引物中共有43对引物在抗、感材料中成功扩增到目的片段,其中有4对引物在抗感材料中扩增出差异片段,简并引物W856在抗、感材料间扩增到一条约750bp的差异片段,测序结果提交至NCBI比对显示其与预测的黄瓜抗TMV的N端类似蛋白存在88%的同源性,根据葫芦科抗病基因在西瓜基因组数据库搜索同源序列设计的特异引物W6580在抗、感材料间扩增出大小一致的约800bp的片段,测序结果提交至NCBI比对,结果显示其与预测的黄瓜抗线虫类似蛋白存在90%的同源性,dnasp软件分析显示抗、感材料之间存在4个单核苷酸多态性位点。 相似文献
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果树R基因同源序列克隆的初步研究 总被引：1，自引：0，他引：1
用2对根据已知植物抗病基因(R基因)编码的蛋白质的NBS保守区而设计的特异简并引物,对荔枝、龙眼、芦柑、柚子及银杏的基因组DNA进行体外扩增.其中一对引物(P1/P2)在荔枝、龙眼、芦柑和柚子中获得的扩增产物均表现为一条大小约500bp的明亮谱带,而银杏扩增产物的亮带则在约750bp处,且弥散在400 ～ 1000bp之间.另一对引物在荔枝、龙眼、芦柑和柚子中没有特异扩增带,而在银杏中获得了一条400 ～ 600bp的较亮的宽带.将荔枝、龙眼、芦柑和柚子的500bp特异扩增带以及银杏的400 ～ 600bp条带回收克隆,并分别筛选几类阳性克隆进行测序.共获得15个片段的序列.经比较发现,来自荔枝、龙眼、芦柑和柚子的12个片段均属于NBS-LRR类抗病基因同源序列(RGA),与已知R基因相应区段的氨基酸序列的一致性为15.5% ～ 47.1%;而3个来自银杏的片段均不是RGA,其中1个与反转录酶有较高的同源性,另2个在GeneBank中没有找到同源序列.该结果显示,应用同源扩增技术克隆果树RGA是可行的,但银杏作为古老的裸子植物,其抗病基因的结构与现代物种可能有很大差异. 相似文献
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番木瓜丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因同源序列的克隆与特征分析 总被引：2，自引：0，他引：2
根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因产物催化结构域Ⅰ和Ⅸ的氨基酸保守序列设计简并引物,PCR扩增番木瓜叶片基因组DNA和cDNA。在NCBI中用BlastX比对发现,5个来自基因组DNA的克隆和4个来自叶片cDNA的克隆可能编码的氨基酸残基序列属于STK蛋白激酶类抗病基因同源序列片段和受体样蛋白激酶基因的同源片段,命名为gPK1-gPK5和cPK1-cPK4,在GenBank注册得到序列号分别为AY693385-AY693389,AY738762-AY738765。除克隆gPK5含有内含子之外,其它都发现了连续阅读框ORF。通过分析除Gpk5之外的8个克隆可能编码氨基酸序列中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类蛋白激酶的9个催化保守结构域Ⅰ-Ⅸ,并利用ClustalW软件对8个克隆和已报道的抗病蛋白水稻Xa21和西红柿Pto氨基酸残基序列进行分子系统进化树分析发现,8个克隆不仅是受体样蛋白激酶基因的同源片段而且是抗病候选基因片段。 相似文献
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依据已知NBS-LRR类抗病基因的P-loop和GLPL两个保守结构域设计简并引物,对抗菠菜霜霉病商业杂交种RZ51-147、自交系12S3和12S4的基因组DNA进行PCR扩增、克隆和序列测定,共获得23条具有完整开放阅读框且含有NBS结构的抗病基因同源序列(resistancegeneanalogs,RGAs),编号为SP1~SP17、SP19~SP24,其在NCBI中的登录号为KX914865~KX914887。核苷酸比较分析结果表明,这23条RGAs大多与甜菜中推测的一些抗病蛋白基因或其他相关蛋白基因具有较高的同源性,其中SP1、SP2、SP5、SP6、SP10、SP11、SP12、SP13等8条序列均与甜菜RF45类抗病蛋白有着86%以上的同源性;SP3、SP4、SP8、SP9、SP24等5条序列与甜菜RPP13类抗病蛋白的同源性在85%以上,与向日葵抗霜霉病基因PI8相应区域的氨基酸序列相似性为32.20%~33.52%,且在进化树上聚为一类,推测其可能与抗霜霉病相关。同源进化分析结果表明,除SP7外,其余序列均为non-TIR-NBS-LRR类抗病基因,并与推导的氨基酸序列多重比较结果一致。 相似文献
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利用差异显示技术克隆辣椒抗疫病相关DNA序列的研究 总被引：6，自引：0，他引：6
用辣椒疫霉菌对八叶期的辣椒品种茄门和93-100-17-1-0进行诱导处理,提取接种前后的总RNA,利用mRNA差异显示技术,结合植物抗病基因保守结构域,DDRT-PCR的一端引物为oligo(dT)15A、oligo(dT)15G、oligo(dT)15C,另一端为来源于不同抗病基因同源序列的简并引物B1、C1、D1,其扩增产物在6%聚丙烯酰胺凝胶上得到两个差异表达的带。回收差异片段并克隆到T-载体上测序,经BLAST检索,发现为两个新的序列,GenBank登录号为AY497910、AY497911。 相似文献
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黄瓜抗病基因类似序列( RGA) 的同源性分析和Southern鉴定 总被引：5，自引：0，他引：5
使用ClustalW和DNAMAN 3.0分析了本实验室克隆的15个黄瓜抗病基因类似序列(RGA)之间以及与烟草的N 基因、亚麻的L6基因和拟南芥的RPS2基因之间的同源性, 并对这些RGA进行了PCR和Southern验证与分析。结果表明: 15个黄瓜RGA中, 核苷酸序列同源性最高的是CsRGA2、CsRGA4和CsRGA5, 其次是CsRGA6、CsRGA7、CsRGA8和CsRGA9, CsRGA1和CsRGA3也存在较高的同源性; 其余的RGA同源性较低。在氨基酸序列上也表现了相同的特征。与N、L6和RPS2等抗病基因的产物之间同源性最高46% , 最低22%。根据核苷酸序列设计了15对特异引物, 用PCR方法验证了所有黄瓜RGA的存在, 其中CsRGA3在黄瓜品种间表现出多态性。利用特异引物PCR方法合成了15个黄瓜RGA的地高辛探针, 与EcoRⅤ酶解的黄瓜‘215’、‘129’和‘L18’的基因组DNA进行Southern杂交, 证实了各个RGA在基因组上的存在, 同时发现, CsRGA9、CsRGA11～CsRGA15都是多拷贝,CsRGA3是单拷贝, 其余为双拷贝。 相似文献
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Isolation of resistance gene analogs from grapevine resistant and susceptible to downy mildew and anthracnose 总被引：1，自引：0，他引：1
Downy mildew and anthracnose are major diseases of the grapevine (Vitis spp.) cultivars grown in Thailand. Due to the deleterious effects of fungicides frequently used for disease management in grapevine, disease resistance genes have been sought after with the ultimate goal of developing new cultivars with improved disease resistance levels. In this study, nucleotide-binding site (NBS)-leucine rich repeat (LRR) class of resistance gene analogs (RGAs) were cloned by PCR amplification using degenerate primers specific to P-loop and GLPL, conserved regions of NBS. Ninety-one clones containing putative RGA sequences were obtained from a downy mildew and anthracnose resistant hybrid ‘NY88.0507.01’ and a susceptible cultivar ‘Black Queen’. These cloned sequences were subdivided into 14 groups based on their nucleotide sequence similarity of 90% or greater. BLASTx of fourteen selected clones showed the highest amino acid sequence similarity with known NBS-LRR proteins or putative resistance (R) protein candidates. Multiple alignments of these representative RGAs with 5 known R proteins revealed conserved P-loop, kinase-2, RNBS and GLPL motifs which are typical components of the NBS-LRR proteins. Four RGAs had at least 40% identity with known R proteins. Phylogenetic analysis demonstrated that the representative RGAs from both resistant and susceptible grapevines dispersed along the phylogram on the two major branches of either TIR (Drosophila Toll and mammalian Interleukin-1 Receptor) or non-TIR type of the NBS-LRR proteins. 相似文献
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几个抗疫病性不同的辣椒材料抗病基因同源序列的分离与比较 总被引：13，自引：0，他引：13
根据已克隆抗病基因的保守序列设计简并引物, 对9 个不同抗、感疫病的辣椒种质材料基因组DNA 进行抗病基因同源性序列的特异PCR 扩增, 经序列测定和同源性分析发现14 个抗病基因同源性序列(RGAs) 与辣椒抗疫病作用相关, 其中B 引物扩增的8 个RGAs 与烟草抗花叶病基因N 、拟南芥抗丁香假单菌基因RPS2 和亚麻抗锈病基因L6 的同源性较高, 属于广谱(细菌、病毒、真菌) 抗病基因同源序列; C 引物扩增的6 个RGAs 与番茄抗叶霉病基因Cf2 和Cf9 有较高的同源性, 与抗疫病作用密切相关。研究还发现, 高感疫病的辣椒基因组中也存在抗疫病相关RGAs , 这与已报道的辣椒抗疫病微效QTLs 位点则来于感病亲本基因组的研究结论一致。 相似文献
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RGA是赤霉素信号途径中抑制赤霉素介导反应的核心成分DELLA蛋白的一种，在植物生长发育中扮演重要角色。本研究中预测了栽培草莓FaRGA1的理化特征及二级结构，分析了FaRGA1蛋白保守结构域。系统进化树分析表明FaRGA1蛋白与森林草莓FveRGA1蛋白同源性较高，两者互为直系同源基因。构建了草莓RGA1基因的RNAi载体，以栽培草莓品种‘晶玉’为试材，通过农杆菌介导的遗传转化获得FaRGA1基因被沉默的转基因株系3个。与非转基因对照植株相比，3个FaRGA1沉默株系均表现出连续2年不开花且持续抽生匍匐茎的特性，且短缩茎明显伸长并发生木质化。本研究中发现FaRGA1基因在栽培草莓中对匍匐茎形成具有抑制作用并促进开花，这为今后基于FaRGA1的草莓分子育种奠定了基础。 相似文献
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马铃薯抗晚疫病主效基因R10的RGA-CAPS标记的开发 总被引：1，自引：0，他引：1
马铃薯晚疫病抗性基因R10,属于马铃薯抗晚疫病主效位点MLB单倍型之一,该位点已知的各单倍型基因均具有保守结构域,属于同一个R3a基因家族。将R3a基因和源于MLB位点的R3a基因的同源序列进行比对,根据它们高度保守的区域设计引物,以马铃薯晚疫病鉴别寄主MaR10(含抗晚疫病基因R10)、四倍体马铃薯栽培种Katahdin(不含已知抗病基因)及其杂交一代为试材,得到R3a的抗病基因同源序列,再结合限制性内切酶筛选,开发出与马铃薯抗晚疫病主效基因R10连锁的两个RGA-CAPS标记： RGA-600和RGA-1000,这两个标记距离R10基因0.25cM。 相似文献
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百合品种抗病基因同源序列分析及抗枯萎病的鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
采用鳞片接种法对36个百合品种及5个野生种进行枯萎病（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）接种鉴定,筛选抗性优异资源。结果表明：百合品种及野生种中蕴藏丰富的抗枯萎病种质资源。利用RGA-PCR方法对百合遗传多样性进行分析,10对RGA引物在41个品种及野生种中共扩增条带159条,其中多态带156条,占总带数的98.1%。以相似系数0.71聚类,41个百合品种及野生种划分为7类。抗性表型与RGA相似性聚类结果表明,利用品种的抗性表型聚类,趋于抗病性相近的聚为一类;利用RGA相似性聚类,趋于遗传背景相近的聚为一类。百合品种RGA的DNA指纹多态性与枯萎病抗性遗传表型多样性无明显的对应关系。对亲本材料进行抗性鉴定和抗病基因同源序列多态性分析,能更准确地反映亲本的遗传背景,为百合枯萎病抗性基因鉴定及品种培育提供一定的理论依据。 相似文献
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病毒诱导的基因沉默（VIGS）研究进展 总被引：1，自引：0，他引：1
病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）是一种RNA 介导的植物抗病毒机制,近年来已被用作研究植物基因功能的反向遗传学手段。与转基因、基因敲除、反义抑制等基因功能研究方法相比,VIGS 技术研究周期短,不需要遗传转化,具有低成本、高通量等优势。因此,VIGS已被广泛应用于植物抗病抗逆、生长发育以及代谢调控等生理途径相关基因的功能鉴定。综述了VIGS 的机制、技术发展、沉默效率的影响因素及其在植物基因功能鉴定中的应用,并对VIGS 在植物性状改良及植物保护方面的应用前景进行了展望。 相似文献
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Background
The progress and completion of various plant genome sequencing projects has paved the way for diverse functional genomic studies that involve cloning, modification and subsequent expression of target genes. This requires flexible and efficient procedures for generating binary vectors containing: gene fusions, variants from site-directed mutagenesis, addition of protein tags together with domain swaps and deletions. Furthermore, efficient cloning procedures, ideally high throughput, are essential for pyramiding of multiple gene constructs. 相似文献18.
霜霉病菌侵染的黄瓜叶片cDNA文库的构建及抗病相关基因筛选 总被引：2，自引：0，他引：2
以接种黄瓜霜霉病菌的抗病黄瓜品种‘649’的叶片为材料,使用改良SDS法提取总RNA,构建黄瓜叶片全长cDNA文库,得到的原始文库滴度为5.5 × 106 pfu • mL-1,扩增后的文库滴度达6.5 × 109 pfu • mL-1,重组率约为99%,插入片段在0.5 ~ 2.0 kb之间,大多在1.0 kb左右。随机选取3 360个克隆进行测序,共拼接出2 507个unigenes,其中包括211个重叠群（Contigs）和2 296个单拷贝EST（Singlets）。生物信息学分析显示：这些unigenes中存在427条与植物防御/抗病相关的基因,其中包括两类抗病基因和细胞程序性死亡相关基因,这些基因的发现为下一步研究黄瓜抗病机理,克隆抗霜霉病相关基因提供了重要的参考。 相似文献