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1.
《中南林业科技大学学报(自然科学版)》2015,(10)
在单因素试验基础上,采用正交试验优化影响观光木SSR-PCR扩增的5种主要影响因素,获得最佳反应体系(10μL)为:Mg2+1.0 mmol,d NTP 0.20 mmol,引物0.25μmol,Taq DNA聚合酶0.75 U,模板DNA 60ng。利用优化SSR-PCR扩增体系,从12对引物中筛选出5对多态性高、重复性好的引物。这为进一步开展观光木种群遗传多样性研究奠定了前期实验基础。 相似文献
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以西伯利亚杏为试验材料,进行基因组DNA的提取、扩增及电泳试验。通过L16(45)正交试验,确定西伯利亚杏SRAP-PCR优化反应体系(反应体系总体积20μL):Mg2+2.0 mmol·L-1、dNTPs0.25 mmol·L-1、引物浓度1.2μmol·L-1、Taq聚合酶1.0 U、DNA模板20 ng。采用SRAP引物组合ME5/EM10,对优化的SRAP-PCR反应体系进行初步验证,24个西伯利亚杏无性系SRAP分子标记试验共扩增出谱带431条,引物扩增出23条谱带,其中338条为多态性谱带,多态百分率为78.42%。 相似文献
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利用正交试验对Taq酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度和模板DNA浓度5个因素进行优化,从而建立了一套适宜构树的ISSR-PCR反应体系.在20 μL的反应体系中,各反应物的最适宜含量为:0.07 U·μL-1 TaqDNA聚合酶、0.35 μmol·L-1ISSR引物、0.3 mmol·L-dNTPs,2.0 mmol·L-Mg2+、1.2 ng· μL-1模板DNA.PCR扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性30 s,46℃退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环. 相似文献
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[目的]本研究旨在建立红椿SSR-PCR最佳反应体系,并筛选适于红椿SSR分析的高多态性引物。[方法]通过L16(45)正交试验设计,确立红椿SSR-PCR最佳反应体系;利用优化后的体系对来自楝科植物的135对SSR引物,在6个不同的红椿居群中进行扩增,筛出能有效扩增的引物并进一步筛选出适于红椿的高多态性引物。[结果](1)10μL基于荧光d UTP的SSR-PCR体系中包含:10×buffer 1.0μL,Taq酶(5 U·μL-1)0.1μL,Mg Cl2(25mmol·L-1)0.8μL,d NTP(200 mmol·L-1)0.025μL,荧光d UTP(1 nmol·μL-1)0.01μL,引物(10 mmol·L-1)0.8μL,DNA模板45 ng剩余用dd H2O补足;(2)筛选出29对能有效扩增的引物,复选后获得了12对适于红椿SSR分析的高多态性引物。[结论]建立了SSR-PCR最佳反应体系并筛选出高多态性引物,为红椿的分子标记等遗传学研究提供了基础。 相似文献
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利用正交设计优化茶树ISSR反应体系 总被引：2，自引：0，他引：2
为优化茶树ISSR分子标记反应体系,对影响茶树ISSR反应较大的Mg2+浓度、dNTP浓度、模板DNA浓度、TaqDNA聚合酶浓度、引物浓度5个因素在4水平上进行优化试验,建立了适合于茶树ISSR-PCR(Inter Simple Sequence Repeats-Polymerase Chain Reaction)的最佳体系:20μL反应体系中,TaqDNA聚合酶0.75U/μL,10×buffer(含Mg2+)2.0mmol·L-1,模板DNA20ng,dNTP0.1mmol·L-1,引物0.3μmol·L-1。反应程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,50～60℃退火40s,72℃延伸90s,34次循环,72℃延伸7min,4℃保存。 相似文献
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万寿菊RAPD分子标记优化体系的建立 总被引：7，自引：0，他引：7
以雄性不育和可育万寿菊及其子代为材料,在PE-2400型PCR仪上进行扩增,通过3次正交试验设计,优化得到了最佳的RAPD反应体系,确定了各个因素的最佳水平。在20 μL反应体系中,最佳的浓度配比为:10×Buffer中含10．00 mmol·L-1Tris-HCl、50．00 mmol·L-KCl、0．001％gelatin、dNTP0．25 mmol· L-1、TaqDNA聚合酶1．5 U、MgCl2 1．25 mmol·L-1、DNA20-60 ng、引物0．60 pmol·μL-1,预变性时间5 min, 退火温度37℃较好,1 min的延伸时间也满足了2 kb以下的DNA片段合成,循环35次能得到较好的 RAPD图谱。 相似文献
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以山茶基因组DNA为材料,测试山茶ISSR扩增的最适退火温度,并采用单因素试验,测试了模板DNA量,Mg2+浓度,dNTP浓度,BSA浓度,引物用量,Taq酶用量等6个因素对山茶ISSR扩增的影响。结果显示:山茶ISSR扩增的最适退火温度为56.3℃;适宜的扩增体系为:10μL PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris.HCl pH 9.0,50mmol.L-1KCl,0.1%Triton X-100),2 mmol.L-1MgCl2,0.6 mmol.L-14×dNTP,2 mg.ml-1BSA,16 ng模板DNA,10 pmol引物,0.5 U Taq酶。 相似文献
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枫香ISSR-PCR扩增条件的优化 总被引：2，自引：1，他引：1
对浙江省天台山枫香自然种群的DNA进行提取和ISSR-PCR扩增条件的优化。分析了Mg2+浓度、4×dNTP浓度、BSA浓度、模板DNA用量、引物用量、Taq DNA聚合酶用量等对反应结果的影响。建立了适用于枫香ISSR分析最适宜的反应体系:10μl PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris-HCl,pH值9.0,50 mmol.L-1KCl,0.1%TritonX-100),2.0 mmol.L-1Mg2+,0.15 mmol.L-14×dNTP,2 mg.mL-1BSA,10 ng模板DNA,6 pmol引物,0.9 U TaqDNA聚合酶,引物UBC808的最适退火温度为52.4℃。用此反应体系对天台山枫香自然种群进行了遗传多样性分析,结果显示其多态位点百分率为84.26%,Nei指数为0.2665,Shannon信息指数为0.4044,其遗传多样性处于较高水平。 相似文献
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紫椴ISSR-PCR反应体系的建立与优化 总被引：29，自引：0，他引：29
分别采用单因子试验和正交设计2种方法对影响紫椴ISSR-PCR反应体系的4个因素(Taq酶,Mg2 ,dNTP,引物)在3个水平上进行优化试验.正交设计选用L9(34)方案,采用直观分析法获得影响因素最佳反应水平.单因子试验分别研究各因素对ISSR-PCR反应的影响情况,找出最佳反应水平.2种方法所得影响因素最佳水平存在差异,通过综合比较与分析,最终建立了紫椴ISSR-PCR的最佳反应体系:在20μL的反应体系中,Taq酶1.0U,Mg2 2.0 mmol·L-1,dNTP 0.20 mmol·L-1,引物0.4μmol·L-1,1×PCR buffer,30 ng模板DNA.在此基础上筛选出14个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度. 相似文献
13.
短柄ISSR-PCR反应体系的优化 总被引：1，自引：0，他引：1
以短柄(Quercus glanduliferavar.brevipetiolata)的DNA为材料,对影响PCR扩增效果的一些因素诸如模板DNA用量、Taq酶的用量、镁离子浓度、dNTP的浓度、引物用量和牛血清白蛋白浓度等指标进行筛选和优化。结果显示适合短柄ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件为:10μL PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris-HCl,pH9.0,50 mmol.L-1KCl,0.1%Triton X-100),0.75UTaq DNA聚合酶,2 mmol.L-1MgCl2,0.2 mmol.L-14×dNTP,12 pmol引物,10 ng模板DNA,2 mg.mL-1牛血清白蛋白。短柄ISSR扩增较适宜的退火温度为54.4℃。 相似文献
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鹅掌楸ISSR-PCR反应体系的建立及优化 总被引：2，自引：0，他引：2
为建立鹅掌楸简单序列重复区间扩增ISSR的PCR优化反应体系,以鹅掌楸叶片基因组DNA为材料,系统地测试了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量及退火温度对ISSR-PCR反应体系的影响。结果表明:优化的PCR反应体系为:20μL总体系中,含30 ng模板DNA,0.3μmol.L-1随机引物,0.2 mmol.L-1dNTPs,1.4 mmol.L-1Mg2+,0.8 UTaqDNA聚合酶;最佳退火温度为60℃;PCR反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,60℃退火45 s,72℃延伸2 min;45个循环;72℃再延伸7 min。 相似文献
15.
分析了ISSR-PCR体系中Mg2+、dNTP和BSA浓度,以及模板DNA、引物和TaqDNA聚合酶用量等6个因素对反应结果的影响,建立了适合于台湾水青冈ISSR-PCR扩增的反应体系:10μL PCR反应液中,含10 ng DNA,1.5 mmol.L-1Mg2+,0.125 mmol.L-14×dNTP,1×TaqDNA聚合酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris-HCl,pH值9.0,50 mmol.L-1KCl,0.1%Triton X-100),0.6 UTaqDNA聚合酶,2 mg.mL-1BSA和3pmol引物。应用优化的ISSR-PCR体系从100个ISSR引物中筛选出12个稳定性好,重复性高的引物,对22株台湾水青冈个体的DNA进行扩增,结果表明优化的ISSR-PCR体系完全适合于台湾水青冈的ISSR分析。 相似文献
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以红花石蒜叶片基因组DNA为模板,分析了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2 的浓度及Taq DNA聚合酶的用量对ISSR-PCR扩增结果的影响.建立了石蒜ISSR分析最优化的反应体系及应用程序:即25 μL反应体系中,有20 ng模板DNA、0.5 μmol·L-1随机引物、150 μmol·L-1 dNTPs、2.0 mmol·L-1 Mg2 、1.0 U Taq DNA聚合酶.反应程序为:94 ℃预变性5 min;然后45个循环:每个循环94 ℃变性45 s,55 ℃退火60 s,72 ℃延伸2 min;循环结束后72 ℃延伸7 min. 相似文献
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龙眼SRAP-PCR反应体系的优化 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立龙眼的SRAP-PCR体系,对影响SRAP-PCR的退火温度、引物浓度、dNTP、模板DNA、Mg2+等因素进行优化。确定优化的龙眼SRAP-PCR反应体系为:10×buffer(Mg free)2.5μl,dNTP mixture(10 mmol.L-1)2.0μl,primer(10μmol.L-1)(0.7+0.7)μl,Mg2+(25 mmol.L-1)1.0μl,模板DNA 40 ng,Taq DNA聚合酶1.5 U,以双蒸水补足至25μl。退火温度51℃。利用该优化的体系对来自中国、泰国、印度尼西亚的16份龙眼种质进行SRAP扩增,电泳显示获得了清晰、稳定的扩增结果。 相似文献
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在提取高质量八角基因组DNA的基础上,通过对其RAPD反应体系的Taq DNA聚合酶、dNTPs浓度、Ｍg2+浓度、引物浓度等因子的优化,建立了稳定、重复性高的八角RAPD-PCR反应体系.研究结果表明,在25 μL PCR反应体系中,含1.0 UTaq DNA聚合酶,0.15 mmol·L-1 dNTPs,2.0mmol·L-1 Mg2+,2.0 μmol·L-1引物,20～ 80 ng模板.最佳反应程序为,94℃预变性5 min,扩增后94℃变性30 s,31 ～37℃退火30 s,72℃延伸30 s,35个循环;72℃完全延伸7 min,4℃保存.在建立RAPD-PCR反应体系的基础上,从240条RAPD引物中筛选出15条扩增条带清晰、稳定性好的引物,并通过各引物的退火温度梯度实验,确定了各引物的最适退火温度. 相似文献
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以漾濞核桃中的大姚三台核桃为实验材料,通过对影响RAPD扩增结果的主要因子Tag酶、Mg+2、引物、模板DNA、dNTPs等不同的浓度和组合的试验研究,确定了漾濞核桃的最适反应体系和扩增程序,即在25μL反应体系中,0.75 u.L-1Taq DNA聚合酶,3.0 mmol.L-1Mg+2,0.3 mmol.L-1引物,含1.6 mg.L-1模板,2.5 ul 10×Buffer,dNTPs各0.2 mmol.L-1。扩增程序为:94℃预变性300 s,94℃变性40 s,36℃退火60 s,72℃链延伸120 s,45次循环后,72℃延伸600 s。 相似文献
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采用交互正交设计L64(421)对濒危植物云南红豆杉简并锚定微卫星-PCR反应体系分别进行了5因素(Taq酶;Mg2 ;dNTP;DNA及引物)4水平的优化筛选,SAS软件统计分析表明:3个单因素(Taq酶;Mg2 ;dNTP)和2个交互作用(Taq×Mg2 ,Mg2 ×dNTP)对此反应体系有显著影响作用.云南红豆杉简并锚定微卫星-PCR反应的优化体系是:在20μL反应体系中含有1×PCR buffer,Taq酶4 U,Mg2 (2.0 mmol·L-1),dNTP(0.4 mmol·L-1),DNA 75 ng,引物(1.0 μmol·L-1),退火温度(54℃).交互正交设计既能快捷有效地筛选出最佳PCR反应体系,又能揭示试验因素及其交互作用对扩增的影响程度,分析结果更客观、准确,具有一定的应用价值. 相似文献