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1.
本研究以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板,以MPB70成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约500bp的DNA片段.通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中,成功地构建出克隆载体pGEM-T-70.以BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切pGEM-T-70和pET28a( ),并将纯化的MPB70基因亚克隆至pET28a( )中,构建出原核表达载体pET28a-70.将pET28a-70转化至感受态E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约25Ku外源蛋白带.Western blot分析发现,该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究MPB70的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础. 相似文献
2.
本研究旨在克隆并表达牛乳头状瘤病毒13型(BPV13)L1基因。以BPV13基因组为模板,通过PCR技术扩增得到大小1 494 bp的目的片段,同时用BamHⅠ和Hind Ⅲ分别对目的片段和pET28a(+)载体进行双酶切,将双酶切后的L1基因片段克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-L1重组质粒,双酶切和测序鉴定正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)受体菌中,筛选出最佳IPTG浓度和最佳诱导时间后进行诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,L1基因正确插入到原核表达载体pET28a(+)中;IPTG诱导后含重组质粒pET28a-L1的表达菌成功表达了带His标签的融合蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白分子质量为60 ku,与预期大小一致,超声破菌后,SDS-PAGE电泳显示融合蛋白存在于沉淀中;Western blotting验证为带His标签的融合蛋白。本试验为进一步研究BPV13 L1基因的功能及为BPV13有效DNA疫苗的研制奠定基础。 相似文献
3.
为获得一定纯度及浓度的布鲁氏菌分泌蛋白BspJ并制备多克隆抗体,本研究通过常规PCR方法扩增BspJ基因,连接至pMD19-T克隆载体并筛选阳性克隆;使用限制性内切酶切下目的片段后连接至pET28a(+)载体,双酶切、菌液PCR验证阳性克隆菌并送测序;表达载体pET28a-BspJ转入大肠杆菌DE3后经IPTG诱导表达,收集表达菌进行SDS-PAGE分析;使用His标签蛋白纯化柱纯化目的蛋白rBspJ;将rBspJ蛋白混入弗氏佐剂分4次免疫实验兔,收集兔血清,Western blot鉴定多克隆抗体,饱和硫酸铵法纯化多克隆抗体.结果显示:PCR方法扩增出大小534 bp的目的片段,测序结果正确,表明成功构建出pMD19-T-BspJ克隆载体及pET28a-BspJ表达载体;表达菌表达出大小约24 kDa的rBspJ,纯化后的rBspJ条带明显,基本无杂带,表明成功纯化出rBspJ;真核表达的rBspJ与制备的多克隆抗体反应,表明成功制备多克隆抗体.本研究结果为BspJ蛋白的亚细胞定位分析、功能研究及布鲁氏菌致病机制的研究积累实验数据和奠定基础. 相似文献
4.
5.
狂犬病病毒BD-06株基质蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备 总被引：2，自引：0，他引：2
本研究旨在获得抗狂犬病病毒M蛋白的多克隆抗体,为进一步研究M蛋白功能提供材料。本试验以狂犬病病毒BD06毒株为模板克隆M基因序列,将其克隆至原核表达载体pET28a;经酶切和测序鉴定,M蛋白基因序列已正确插入表达载体pET28a;以表达载体pET28a-M转化E.coli Rosetta株,并以0.5 mmol/L IPTG诱导,结果表达出27 ku左右的M蛋白;将诱导表达的蛋白质回收纯化,以纯化的M蛋白多次免疫兔子制备多克隆抗体;Western blotting分析和间接免疫荧光分析结果表明,制得的抗体与病毒能够反应,运用制得的多克隆抗体定位了基质蛋白在感染狂犬病病毒的BHK-21细胞中的位置。结果表明成功制得了抗狂犬病病毒M蛋白的多克隆抗体,为研究狂犬病病毒M蛋白功能奠定了基础。 相似文献
6.
根据GenBank中ClfA基因序列设计特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增,获得了约2 300 bp的DNA片段.将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,构建了克隆质粒pMD18-ClfA.用BamHⅠ和EcoR Ⅰ双酶切pMD18-ClfA和pET28a(+),将纯化的基因ClfA亚克隆至pET28a(+),构建重组质粒pET28a-ClfA,并将其转化至大肠杆菌感受态BL21(DE3)中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,在87 000处出现了与目的蛋白一致的外源蛋白带,Western-blotting分析表明,该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性. 相似文献
7.
根据GenBank中发表的结核杆菌H37RV的ESAT6基因序列设计1对引物,以热灭活的结核杆菌H37Rv菌悬液为模板,用PCR方法扩增得到EsAT6基因DNA片段.将扩增片段克隆于pGM-T载体中,成功构建克隆载体pGM-T-ESAT6.分别将pET28a-GFP质粒和pGM-T-ESAT6质粒用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切,并将纯化的ESAT6基因亚克隆至pET28a-GFP中,构建原核表达载体pET28a-GFP-ESAT6.将pET28a-GFP-ESAT6转化E.coli BL 21(DE3),经IPTG诱导、SDS-PAGE和Western-blot分析,可见相对分子质量约37 200的外源蛋白带,表明GFP-ESAT6融合基因在大肠杆菌中得到了表达.用Ni-NT、A Agarose试剂盒进行蛋白纯化,获得纯化的GFP-ESAT6融合蛋白. 相似文献
8.
以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板．根据已发表的Ag85B成熟蛋白基因的核苷酸序列设计合成特异性引物进行PCR扩增．获得约860bp的DNA片段。通过T-A克隆技术．将PCR产物克隆至pGEM-T载体中．成功地构建出克隆载体pGEM-T-85B。以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM-T-85B和pET28a（＋）．并将纯化的Ag85B基因亚克隆至pET28a（＋）中，构建出原核表达载体pET28a-85B。将pET28a-85B转化至感受态E.coli BL21（DE3）中．经IPTG诱导和SDS-PAGE分析．可见约30000的外源蛋白带。Western blot分析发现，该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性．从而为进一步研究Ag85B的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定了基础。 相似文献
9.
利用DNAStar对牛结核分枝杆菌的3个主要抗原mpb70、mpb83、esat-6进行预测分析,将预测的抗原指数高的抗原表位经全基因合成后,克隆到表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒pET28a-mpb-70-83-esat-6,转化入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定,结果检测到相对分子质量约为21 000的重组蛋白。经NI-NTA纯化重组蛋白后进行Western-blot鉴定,结果显示该重组蛋白可被牛结核分枝杆菌的多克隆抗体识别,表明该蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
10.
【目的】应用大肠杆菌表达系统表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV) E0蛋白,纯化后免疫小鼠制备E0蛋白多克隆抗体用于BVDV的检测技术研究。【方法】采用PCR扩增BVDV的E0基因,将其连接至pET-28a (+)构建重组表达载体pET28a-E0。将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导、亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定E0蛋白的表达情况。将纯化的E0蛋白免疫小鼠制备BVDV E0多克隆抗体,并通过Western blotting、细胞免疫荧光试验、ELISA等试验检测该多克隆抗体的特异性和效价,以及在BVDV检测中的应用。【结果】成功构建原核表达载体pET28a-E0,表达并纯化E0蛋白,制备的BVDV E0多克隆抗体可特异性识别纯化的E0蛋白及pET28a-E0在BL21中表达的总蛋白。进一步Western blotting、细胞免疫荧光试验、双抗夹心法ELISA证明制备的E0多克隆抗体可用于BVDV的检测。间接ELISA结果表明,E0多克隆抗体效价高于1∶64 000。【结论】制备的BVDV E0多克隆抗体效价高、抗原结合特异性强,为BVDV E0蛋白的生物学功能研究及BVDV的检测提供了材料支持。 相似文献
11.
构建大片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶(Fg.TPx)原核表达质粒,经大肠埃希菌Rosetta表达融合蛋白(Fg.TPx/His)并对其进行纯化和初步鉴定。PCR扩增Fg.TPx的基因片段,亚克隆至pET32a(+)中构建重组表达载体pPET32a-Fg.TPx。IPTG诱导表达,经镍离子亲和层析分离纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。重组质粒经限制性内切酶双酶切和测序分析表明构建成功,表达产物以可溶性和包涵体形式存在,纯度为90%,Wsetern blot证实该蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合反应,分子质量为TPx和His分子质量之和,表明是融合蛋白。重组蛋白可以被大片吸虫感染水牛阳性血清特异性识别。免疫家兔产生的抗体效价最高可达1∶4 000。成功构建了p ET32a-Fg.TPx原核表达质粒,重组蛋白得到高浓度表达,具有抗原性,为进一步研究其在大片吸虫病诊断中的应用奠定了基础。 相似文献
12.
奶牛早孕因子重组蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备 总被引：1，自引：1，他引：0
本研究旨在表达、纯化奶牛早孕因子重组蛋白及制备多克隆抗体.本试验构建奶牛早孕因子重组蛋白原核表达载体pET32a-EPF,转化至大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达,SDS-PAGE切胶纯化的早孕因子重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并用Western blotting和ELISA对重组蛋白及抗体进行检测.结果显示,成功表达并纯化了奶牛早孕因子重组蛋白,重组蛋白分子质量约37 ku,表达量约占菌体总蛋白的48.6%,纯化后目的蛋白纯度可达93%,重组蛋白可与所制备的多克隆抗体结合,ELISA测定的抗体效价为1:12 800.结果表明,本研究成功表达并纯化了奶牛早孕因子重组蛋白,为研究奶牛早孕诊断奠定基础. 相似文献
13.
试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列（GenBank登录号：XM_003124236.4）设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a（+）连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。 相似文献
14.
UL36USP是马立克病毒UL36基因编码的蛋白UL36上具有去泛素化酶活性的N-端部分片段（UL36USP）,本试验以提取MDCC-MSB1细胞的基因组为模板通过PCR获得目的基因,将UL36USP基因克隆入pMD18T载体,测序正确并酶切鉴定后,将目的基因亚克隆到pET28a原核表达载体,构建重组质粒pET28a-UL36USP。将重组质粒转化BL21（DE3）E.coli中,IPTG诱导表达并使用Ni-NTA Agarose亲和层析进行纯化得到目的蛋白。应用纯化后的UL36USP免疫獭兔制备多克隆抗体。使用昆虫细胞表达系统表达的UL36片段检测多克隆抗体的特异性。结果显示成功制备特异性的UL36USP抗体。 相似文献
15.
本研究旨在获得重组伪狂犬病病毒（PRV）gE蛋白及其多克隆抗体。利用PCR方法从PRV感染猪的肺脏、脑和扁桃体混合组织中扩增PRV gE基因,连接至克隆载体pMD18-T（pMD-gE）后进行测序与进化树分析。以pMD-gE为模板,利用PCR方法扩增其膜外结构域部分基因（gE-outside）,将其连接至原核表达载体pET-30a（+）,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建重组质粒pET-gE-outside。将重组质粒pET-gE-outside转化大肠杆菌RosettaTM（DE3）pLysS感受态细胞,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE和Western blotting进行表达产物的分析与鉴定。经亲和层析技术纯化重组PRV gE蛋白并免疫小鼠,通过间接ELISA和Western blotting分别进行三免3周血清中鼠抗PRV gE多克隆抗体效价的测定和鉴定。PCR和测序结果表明,本研究成功克隆了PRV gE基因,与国内2011年以后流行毒株属于相同分支。SDS-PAGE和Western blotting结果证实,PRV gE-outside基因在原核表达系统获得正确表达,分子质量约为55 ku,且可与猪抗PRV多克隆抗体发生免疫反应。经亲和层析纯化的gE-outside蛋白浓度为1.23 mg/mL。将其免疫小鼠,三免3周的小鼠血清中鼠抗PRV gE-outside多克隆抗体效价为1：204 800,并可与gE-outside蛋白发生免疫反应。综上,本研究制备了重组PRV gE蛋白和鼠抗PRV gE蛋白多克隆抗体,可为PRV感染机制研究及建立快速、高效免疫学检测技术提供技术指导和材料。 相似文献
16.
利用PCR方法扩增乳源致病性金黄色葡萄球菌nEBPS全基因，将其定向克隆至原核表达载体pET30a（＋）中，鉴定正确后，转化BL21表达菌，经IPTG诱导获得了以可溶性表达的重组蛋白。通过NiNTAPurificationSystem纯化重组蛋白，纯化蛋白质量浓度为2．16g／L。纯化蛋白经免疫印迹检测显示重组蛋白能够被牛源金黄色葡萄球菌阳性血清识别，具有良好的反应性。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体，间接EI，1SA测定抗体效价为1：25600，凝集试验测定抗体效价为1：128。 相似文献
17.
本文通过对猪乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）基因组中移码序列分析，设计合成三条引物，通过PCR扩增出假定的NS1′移码片段，并将移码片段三倍重复克隆入pET-28a表达载体中。重组质粒转化E．coliBL-21后，经IPTG诱导在37℃下实现目的片段的可溶性表达。纯化表达产物，并免疫小鼠制备了多抗血清，以多抗血清为一抗，对JEv感染的Vero细胞进行免疫荧光分析，结果发现抗移码片段表达蛋白的血清可识别JEV蛋白。以JEV感染Vero细胞，提取感染细胞总蛋白，分别以NSl单抗和VAI-制备的多抗血清为一抗，进行Westernblot分析。结果显示，NS1单抗为一抗，可染出48kDa的NS1条带和56kDa的NS1′条带：而以多抗血清为一抗，仅染出56kDa的条带。上述结果显示，多抗血清识别的NS1′蛋白为NS1′移码后片段表达的蛋白。 相似文献
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本文通过对猪乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)基因组中移码序列分析,设计合成三条引物,通过PCR扩增出假定的NS1’移码片段,并将移码片段三倍重复克隆入pET-28a表达载体中。重组质粒转化E.coli BL-21后,经IPTG诱导在37℃下实现目的片段的可溶性表达。纯化表达产物,并免疫小鼠制备了多抗血清,以多抗血清为一抗,对JEV感染的Vero细胞进行免疫荧光分析,结果发现抗移码片段表达蛋白的血清可识别JEV蛋白。以JEV感染Vero细胞,提取感染细胞总蛋白,分别以NS1单抗和以上制备的多抗血清为一抗,进行Western blot分析。结果显示,NS1单抗为一抗,可染出48 kDa的NS1条带和56 kDa的NS1’条带;而以多抗血清为一抗,仅染出56 kDa的条带。上述结果显示,多抗血清识别的NS1’蛋白为NS1’移码后片段表达的蛋白。 相似文献
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为了实现微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)E2F样结构域包含转录因子编码基因cpeld的原核和真核表达,设计2对特异性引物,以C.parvum卵囊cDNA为模板,PCR扩增得到cpeld基因,将其分别插入pET32a和p3XFLAG-CMV14载体。同时设计引物,扩增微小隐孢子虫类钙调蛋白(C.parvum calmoduin-like proteins)的编码基因CpCML,插入pcmv-HA载体。将鉴定正确的重组质粒分别转入BL21(DE3)和293T细胞进行表达,Western blot观察重组蛋白的反应原性。结果显示,成功构建了重组原核表达质粒pET32a-cpeld和真核表达质粒p3XFLAG-CMV14-cpeld以及pcmv-HA-CML;SDS-PAGE显示,重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达出了分子质量约为55 ku的重组蛋白;Western blot分析显示,原核表达的重组蛋白能与鼠抗His单克隆抗体,真核表达重组CpELD和CpCML蛋白能分别与抗FLAG和HA单克隆抗体反应。结果表明,成功实现了cpeld基因的原核和真核表达以及CpCML基因的真核表达,表达产物具有良好的反应原性,为后续开展隐孢子虫CpELD和CpCML的功能和作用机制研究、新型的防控技术研发奠定了基础。 相似文献