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采用生物信息学方法分析粟酒裂殖酵母SpTrz2蛋白的生物学特性,利用PCR方法扩增粟酒裂殖酵母yAS56菌株SpTrz2的全长和N-末端一半的编码基因,通过NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点将SpTrz2的全长和N-末端一半编码基因定向插入pET-28a(+)原核表达载体中,并转化大肠埃希菌BL21(DE3);经过IPTG诱导... 相似文献
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【目的】克隆绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因,并在粟酒裂殖酵母细胞中进行表达分析。【方法】利用PCR技术,从绿色木霉中克隆纤维素酶β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,再通过XhoⅠ和NotⅠ2个酶切位点与粟酒裂殖酵母表达载体pREP5N连接,构建酵母真核表达载体,利用电转化方法转化粟酒裂殖酵母SP-Q01细胞,并在SP-Q01中进行表达分析,最后采用DNS法测定表达产物的酶学活性。【结果】PCR扩增得到2 380bp的bglⅠ基因序列,包括完整的CDS序列和信号肽序列,编码序列与已报道的里氏木霉纤维素酶基因序列相似性为100%;对酵母转化子进行诱导培养后,SDS-PAGE电泳检测得到大小为76ku的目的蛋白条带,在SP-Q01细胞中重组酶活性最高达155U/mL,最佳培养时间为72h,产生酶活的最适温度为60℃。【结论】成功克隆出了绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,该基因能在粟酒裂殖酵母细胞中成功表达,为绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的深入研究和应用奠定了基础。 相似文献
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利用RT-PCR克隆Ⅱ型大豆查尔酮异构酶基因(CHI1A),然后将目的片段与克隆载体pMD18-T质粒相连接,检测后将目的基因重组于粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2的MCS序列之中,使用电击法将重组质粒转化进入粟酒裂殖酵母中,用PCR和双酶切的方法来检测试验结果,表明获得了CHI1A完整开放阅读框(670bp),与已报道序列(NO:AY595413)的同源性达到99%。PCR和酶切鉴定表明,CHI1A已导入到酵母表达载体中。查尔酮异构酶基因的克隆、粟酒裂殖酵母表达载体的构建,为该基因的应用提供了依据。有望利用基因工程技术将该基因重组于酵母基因组中并表达目的蛋白,以此来催化合成黄酮和异黄酮类化合物。 相似文献
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[目的]研究粟酒裂殖酵母tRNA前体3’末端加工酶Trzlp在体内的功能，为以后进一步探索Trzlp的功能奠定基础。[方法]构建Trz1’的表达载体pREP82x．trzl-5flag，通过醋酸锂转化法将pREP82x-trzl-5flag转入yYH1菌株和7k1‘的缺失菌株ySS0319中，并进行随机孢子分析。[结果]Trz1pC-端添加5FLAG仍能促进tRNA前体3’末端的加工成熟，但Trz1-5flag不能救活Trz1’的缺失菌株。[结论]粟酒裂殖酵母Trzlp具有tRNA前体3’末端加工功能。 相似文献
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《南京农业大学学报》2017,(4)
[目的]开花基因FT是开花通路下游关键基因。本文旨在研究不结球白菜BcFT的亚细胞定位及互作蛋白的筛选,深入了解不结球白菜BcFT的功能及其调控机制。[方法]构建亚细胞定位载体p EZS-NL-BcFT,利用亚细胞定位技术研究BcFT的空间表达。通过酵母双杂交技术筛选与BcFT互作的蛋白,构建酵母双杂交诱饵载体p GBKT7-BcFT,转化酵母Y2H Gold菌株,验证自激活性和自毒性。对不结球白菜酵母双杂交c DNA文库进行筛选,得到与BcFT互作的片段,并根据基因片段进行比对,以不结球白菜c DNA为模板进行基因全长克隆,构建p GADT7载体,进行共转化验证,最后对筛选得到的2个蛋白进行生物信息学分析。[结果]BcFT蛋白在整个细胞中均有分布。诱饵载体p GBKT7-BcFT表达产物对酵母细胞无自激活性和自毒性,通过酵母双杂交及共转验证得到2个与BcFT互作的蛋白:Bc PPD5和Bc VHA-E1。生物信息学分析预测这2个蛋白均为亲水性蛋白,不含信号肽,Bc PPD5蛋白的氨基酸序列存在1个跨膜区,二级结构中不规则卷曲所占比例最大,第163和296氨基酸残基之间存在1个Psb P结构域;Bc VHA-E1蛋白无跨膜区,二级结构中α螺旋所占比例最大,无特定结构域。[结论]确定了BcFT蛋白在整个细胞中均有表达。利用酵母双杂交技术筛选得到2个与BcFT互作蛋白,进一步分析发现其可能通过光周期路径影响开花。 相似文献
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[目的]构建含羊布鲁氏菌16M Omp25基因的酵母双杂交诱饵质粒,检测诱饵质粒表达产物对cdc25H酵母细胞有无毒性作用以及对报告基因有无激活作用。[方法]聚合酶链反应(PCR)扩增布鲁氏菌Omp25基因的编码序列,定向克隆到酵母表达载体pSos上,构建诱饵重组质粒pSos-Omp25,经测序正确后,将其将转化到酵母菌cdc25H感受态细胞,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。[结果]序列测定证明重组诱饵质粒pSos-Omp25构建成功;重组质粒表达产物对cdc25H酵母细胞无毒性,对报告基因无激活作用。[结论]利用SOS恢复系统(SRS)成功构建了羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白酵母双杂交诱饵质粒,为筛选与羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白相互作用的蛋白创造了条件。 相似文献
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《江苏农业科学》2016,(2)
由于丙酮醛降解酶(methylglyoxal degradation enzyme,MD)是生物体内代谢丙酮醛的一种关键酶,实现MD的高效表达对调控丙酮醛的代谢途径具有重要意义。所以根据Schizosaccharomyces pombe_Gene DB中MD的基因序列(SPAC22E12.03C)设计引物,以粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)c DNA文库为模板通过PCR扩增技术得到目标基因,目的片段全长576 bp。将SPAC22E12.03C连接到p ET-28a(+)上,得到重组质粒p ET-28a(+)-SPAC22E12.03C,并在Escherichia coli BL2l(DE3)中实现表达。同时,对其目的蛋白的表达条件进行了优化,获得最佳表达条件:诱导温度37℃,诱导起始菌体D600 nm为0.5~0.6,诱导剂IPTG浓度为0.8 mmol/L。这为研究粟酒裂殖酵母体内丙酮醛的降解途径打下了坚实基础。 相似文献
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[目的]观察拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母体系中的表达,获得重组蛋白。[方法]将At2G34450基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用SalⅠ将重组质粒线性化,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性整合子进行甲醇诱导表达。[结果]拟南芥At2G34450在酵母培养基中实现了表达,表达产物经SDS-AGE鉴定为重组蛋白。[结论]在毕赤酵母真核系统中实现了拟南芥At2G34450蛋白的表达,为进一步研究拟南芥HMGB家族蛋白打下了基础。 相似文献
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[目的]观察拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母体系中的表达,获得重组蛋白。[方法]将At2G34450基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用SaⅠl将重组质粒线性化,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性整合子进行甲醇诱导表达。[结果]拟南芥At2G34450在酵母培养基中实现了表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定为重组蛋白。[结论]在毕赤酵母真核系统中实现了拟南芥At2G34450蛋白的表达,为进一步研究拟南芥HMGB家族蛋白打下了基础。 相似文献
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[目的]探讨人皮肤表皮细胞(HaCaT)聚-ADP核糖聚合酶-1基因(PARP-1)过表达后的生物学性状变化。[方法]设试验组、空载体对照组、正常HaCaT对照组,运用真核表达载体使PARP-1基因在HaCaT中过表达,在光学显微镜下观察转染重组子的试验组细胞、转染空质粒的对照组细胞及正常对照组细胞的形态学特征。绘制细胞生长曲线,并运用流式细胞技术分析细胞周期。以苯并芘(BaP)恶性转化的细胞作为阳性对照,采用软琼脂克隆形成试验对细胞的恶性程度进行鉴定。[结果]光镜下试验组细胞与空载体组细胞及正常对照组细胞相比,除体积稍有缩小外,其他形态学特征没有明显变化。3组细胞的生长曲线均呈相似的S型,但转染重组子细胞的生长速度加快。试验组、空载体组及正常细胞组的细胞周期分布为G1期(44.3%、78.1%、76.4%)、G2期(3.6%、13.3%、12.2%)和S期(52.1%、8.6%、11.4%)。正常对照细胞和空载体组分布相近,试验组S期明显增多;试验组细胞未见在双层软琼脂糖中生长出细胞集落,而阳性对照组细胞集落明显。[结论]PARP-1基因过表达后可以改变HaCaT细胞的生长速度,但并不影响细胞的恶性程度。 相似文献
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鱼腥草叶乙醇提取液的抑菌作用研究 总被引：1，自引：1，他引：0
[目的]研究鱼腥草叶中黄酮类物质的最佳提取工艺和鱼腥草叶乙醇提取液的抑菌作用。[方法]以鱼腥草为材料,浓度70%的乙醇为溶剂,设计L9(34)正交试验提取方法,优选出鱼腥草叶中黄酮类物质的最佳提取工艺条件;以多粘芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、裂殖酵母和酿酒酵母、黑曲霉为供试菌种,进行抑菌试验,研究鱼腥草叶乙醇提取液的抑菌作用。[结果]优选出的提取方法为乙醇提取法,其较佳的提取条件为温度80℃,料液比1∶20(g/ml),提取2次,每次提取2 h;在此条件下,鱼腥草黄酮类物质的提取率达4.363%。鱼腥草叶乙醇提取液具有广谱抑菌特性,且对细菌的抑菌效果优于对真菌的抑菌效果;鱼腥草叶提取液对多粘芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、裂殖酵母、酿酒酵母和黑曲霉的最小抑制浓度分别为0.06、0.06、0.08、0.08、0.1、0.1和0.1 g/ml。[结论]研究出了鱼腥草叶中黄酮类物质的最佳提取工艺,并确定了其乙醇提取液的抑菌作用,为鱼腥草叶的进一步开发和利用提供了理论依据。 相似文献
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紫杉醇对G2/M期A549细胞4EBP1分子磷酸化的影响 总被引：1，自引：1，他引：0
[目的]研究不同浓度紫杉醇对A549细胞周期、凋亡和4EBP1分子磷酸化的影响。[方法]采用不同浓度紫杉醇处理A549细胞,建立凋亡和G2／M期阻滞模型;分别用流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期;用免疫印迹方法分析4EBP1的表达与磷酸化。[结果]G2／M期细胞百分率随紫杉醇浓度的增加而增加,但细胞凋亡率随紫杉醇浓度的增加而下降。随G2／M阻滞的增加,4EBP1分子3组丝／苏氨酸位点磷酸化均增强。[结论j紫杉醇在G2／M期上调A549细胞内4EBP1分子多位点的磷酸化。 相似文献
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《（《农业科学与技术》）编辑部》2014,(9)
[Objective] This study aimed to investigate the combination effects of ligustrazine and cis-dichlorodiamine platinum(DDP) on anti-proliferation, cell cycle and apoptosis of SGC-7901 cell lines in vitro. [Method] SGC-7901 cells were treated with ligustrazine and DDP alone or combined for 48 h for morphology assay.Anti-proliferative effects with the same treatment for 24, 48 and 72 h were assayed by MTT method, respectively. Cell cycle distribution and apoptosis assay of treated cells were performed in flow cytometry. Zhengjun Jin's protocol was used to assay the effect of drug combination. [Result] Ligustrazine significantly increased the proliferation inhibition rate of DDP on SGC-7901 cells in combination with DDP, comparing with the effects of ligustrazine or DDP alone, and exhibited synergistic antitumor effect. The combination drug treatment induced cell cycle arrest occurred in S and G2 phase of the cell cycle and increased the apoptosis rate significantly.[Conclusion] Our results indicate that ligustrazine, as a low-toxic and natural herbal component, can significantly increase the anti-proliferative effect and apoptosis rate of antitumor drug DDP on human gastric carcinoma SGC-7901 cells. 相似文献
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[目的]探讨金槐米槲皮素对人鼻咽癌CNE2细胞的干预作用。[方法]通过微波辅助提取法从桂北金槐米中提取槲皮素并纯化,用浓度20、40、60和80μmol/L的槲皮素作用于人鼻咽癌细胞CNE2;分别在24、48和72 h后,采用MTT法初步检测人鼻咽癌细胞被抑制的情况,用流式细胞术分析其细胞周期和凋亡率、光学显微镜观察细胞形态学变化。[结果]从槐米中提取的槲皮素对鼻咽癌细胞有明显的抑制作用,且呈浓度、时间明显的依赖性,药物干预作用的最适浓度为60μmol/L,药物干预后形态学观察的最适宜时间为48 h。细胞周期分析显示,槲皮素能阻滞鼻咽癌细胞于G1期。[结论]从桂北金槐米中提取的槲皮素对人鼻咽癌细胞有较强的干预作用。 相似文献
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[目的]克隆水稻线粒体基因atp6,构建转基因表达载体,获得35S∷Rf1b5'∷atp6转基因水稻植株。[方法]设计目的基因的特异引物,采用TRIzol法提取水稻叶片总RNA,借助Toyobo反转录试剂盒反转录为cDNA,通过PCR扩增得到atp6全序列;将atp6连接到含线粒体信号肽(Rf1b5')的pCAMBIA1302双元表达载体上,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行水稻的遗传转化。[结果]利用目的基因atp6成功构建了35S∷Rf1b5'∷atp6植物表达载体,并获得了转atp6基因的阳性植株。[结论]为探讨水稻中超表达atp6对水稻生长的影响奠定基础。 相似文献
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Cell cycle control of DNA replication by a homologue from human cells of the p34cdc2 protein kinase 总被引：52，自引：0，他引：52
The regulation of DNA replication during the eukaryotic cell cycle was studied in a system where cell free replication of simian virus 40 (SV40) DNA was used as a model for chromosome replication. A factor, RF-S, was partially purified from human S phase cells based on its ability to activate DNA replication in extracts from G1 cells. RF-S contained a human homologue of the Schizosaccharomyces pombe p34cdc2 kinase, and this kinase was necessary for RF-S activity. The limiting step in activation of the p34 kinase at the G1 to S transition may be its association with a cyclin since addition of cyclin A to a G1 extract was sufficient to start DNA replication. These observations suggest that the role of p34cdc2 in controlling the start of DNA synthesis has been conserved in evolution. 相似文献
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紫鸭跖草细胞中铜的分配和化学形态特征研究 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]为从Cu在组织细胞中的分配特征和结合形态的角度揭示紫鸭跖草超积累Cu的机理。[方法]利用差速离心技术研究Cu在紫鸭跖草中的亚细胞分配特征,并运用化学试剂顺序提取法和酶解法研究Cu在紫鸭跖草根和叶中的赋存形态。[结果]根部Cu的分布位点主要是细胞壁,占根部全Cu的1/3以上;而叶部以叶绿体中的Cu占叶片全Cu的比例较大,约为1/4。在高浓度Cu处理或处理时间延长的情况下,根细胞中Cu向细胞壁的分配增多,向质体中的分配减少;而叶细胞中Cu向叶绿体中的分配增多,向细胞壁的分配减少。叶片中Cu主要与氨基酸、小分子色素、蛋白质、多糖等结合;而根部Cu主要与纤维素、膜结合蛋白等细胞壁物质结合。[结论]Cu在细胞内的分配和存在形态可能是紫鸭跖草超积累Cu的重要机理之一。 相似文献