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基因组编辑技术已成为分子育种的重要手段。本研究利用CRISPR/Cas9系统,以直链淀粉含量合成基因Waxy(Wx)为编辑对象,构建敲除载体,利用农杆菌介导法转化优质粳稻品种圣稻22,共获得了20个T0代转化株系,测序结果表明16个株系实现了对Wx基因的定点编辑,突变率为80%,纯合及双等位率为20%。稻米外观品质检测表明13个株系外观呈现糯稻表型,直链淀粉含量测定表明有3个株系的直链淀粉含量降至2.0%以下。可见,利用CRISPR/Cas9系统可以快速改良水稻品种的直链淀粉含量目标性状,在品种的定向改良方面具有巨大的潜力。 相似文献
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【目的】光作为一种环境信号,可影响植物的基因表达、酶活性和形态建成。光敏色素互作因子在光信号传导过程中起着重要作用。本研究旨在构建水稻光敏色素互作因子OsPIL15的CRISPR/Cas9表达载体,创制OsPIL15突变体,挖掘水稻功能基因,丰富和完善水稻光信号调控分子机制。【方法】依据CRISPR/Cas9技术原理,设计OsPIL15突变靶点。将所设计靶序列在水稻基因组中进行比对,排除非特异性靶位点,同时使该靶序列含有常用酶切位点,方便后期突变体鉴定。化学合成靶位点寡核苷酸序列并与载体pBUN411连接构建CRISPR/Cas9表达载体,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴,以除草剂抗性标记筛选获得阳性转基因植株。利用酶切法判断T0代转基因植株是否发生突变,结合测序结果分析突变单株的突变基因型。将靶点序列在水稻全基因组中进行比对分析,选择5个与靶序列同源性较高且错配在4 bp以内的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估,分析所设计靶序列特异性。【结果】所构建表达载体成功实现了对OsPIL15的定向编辑,酶切显示在选取的25株T0代转基因植株中获得15株突变体,其中包括5株纯合突变体、6株双等位突变体和4株杂合突变体,共10种不同突变基因型和11个突变株系。突变类型以单碱基插入或缺失为主,同时也得到2种56和66 bp较大片段缺失株系。对部分纯合突变、双等位突变和杂合突变体的T1代植株进行分析,结果表明,T0代产生的突变基因型绝大部分能稳定遗传给下一代。T0代纯合突变体后代为纯合突变单株,仅在株系14纯合突变体后代中检测到1株未突变单株;T0代双等位突变体后代可得到2种纯合突变型和1种双等位突变型;T0代杂合突变体后代则可得到纯合、杂合及未突变3种类型。对T0代未突变植株的后继世代酶切分析显示,62株T1代转基因植株均未发生突变,表明CRISPR/Cas9在T1代转基因阳性植株中未重新发挥基因编辑作用。对20株突变体的5个潜在脱靶位点进行分析,5个潜在脱靶位点均未检测出脱靶效应,表明所设计靶序列具有较高特异性。对选取的3组不同基因型ospil15 T1代突变体表型进行初步观察,结果表明,突变体生育期和分蘖数未出现明显变化,株高极显著下降,籽粒粒长极显著增加,最大增幅达5.69%。【结论】CRISPR/Cas9系统能对OsPIL15进行定向编辑,获得的10种不同突变基因型的ospil15突变体与野生型相比株高极显著降低、籽粒粒长极显著增大。 相似文献
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水稻是重要的粮食作物之一,在盐碱地开发和改良中发挥着重要作用。为了创制高耐盐水稻种质资源,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在水稻品种盐丰47中对OsRR22设计3个靶位点进行基因编辑。通过PCR和测序鉴定,在T0代获得16个突变单株,其中靶位点1和靶位点2均有纯合突变,靶位点3没有检测到突变。在T1代转基因株系中,获得3株纯合突变且无T-DNA插入的纯合突变体。对T2代进行农艺性状分析发现,与野生型相比,突变体的株高显著降低,产量相关农艺性状均无显著变化。苗期耐盐性鉴定结果表明,在200 mmol/L NaCl处理7天后,突变株的存活率比野生型提高30%以上。综上,利用CRISPR/Cas9技术对水稻品种盐丰47进行了耐盐性改良,为耐盐水稻新品种的培育提供了理论和材料基础。 相似文献
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《福建农业学报》2020,(5)
【目的】利用基因编辑技术编辑水稻香味基因,改良优质粳稻香味性状。【方法】构建CRISPR/Cas9-BADH基因编辑载体,转化优质粳稻品种龙稻18、龙稻24和秀水134,测序鉴定3个优质粳稻品种的香味基因Betaine aldehyde dehydrogenase 2(Badh2)突变体并分析潜在脱靶效应,利用气相色谱-质谱联用技术测定不同遗传背景badh2突变体稻米的2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline, 2AP)含量。【结果】转化获得的30株T_0代中有24株为badh2突变体,其中53.33%为杂合型突变,16.67%为纯合型突变,10%为双等位突变类型。T_1代非转基因植株内共鉴定获得7种纯合badh2突变基因型。在5个预测位置上未检测到脱靶事件的发生,说明设计的sgRNA具有高度特异性。所有Badh2移码突变体稻米的2AP含量都达到或高于稻花香的水平,但不同品种来源的badh2突变体间2AP含量差异极显著。【结论】本研究提供了一个能够高效诱导水稻Badh2突变的CRISPR/Cas9定向编辑靶点,改良了生产上大面积推广的3个优质水稻品种龙稻18、龙稻24和秀水134的香味性状,发现了不同遗传背景的水稻badh2突变体间2AP含量差异显著,为基于定向编辑Badh2基因的方法培育适合生产应用的香稻品种、提高育种效率提供科学依据。 相似文献
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转反义蜡质基因纯合株系间直链淀粉含量与RVA谱关系分析 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】排除以往水稻亚种或品种间RVA谱分析时存在着的遗传背景差异,分析转反义蜡质基因不同直链淀粉含量纯合株系间RVA各特征值的差异,更清楚地揭示直链淀粉含量与RVA谱特征值的关系。【方法】采用根癌农杆菌介导共转化和花药培养相结合的方法,培育含有反义蜡质基因的花培纯系,并对各株系进行直链淀粉含量和RVA谱测定和分析,通过比较RVA谱曲线图形及RVA谱特征值的显著性测定,分析相同遗传背景条件下直链淀粉含量对各RVA谱特征值的作用。【结果】在武运粳7号转基因后代中,获得了只含反义蜡质基因、不含潮霉素抗性标记的花培株系77个,经T1H1和T1H2二代直链淀粉含量测定,有19个株系的直链淀粉含量接近对照（对照16.0%）;有50个株系直链淀粉含量比对照下降1%～5%,其中,直链淀粉含量在11.0%～13.9%有30个株系;另外,有8个株系的籽粒为蜡质状,直链淀粉含量降至3.1%～4.0%。不同直链淀粉含量纯系间RVA谱分析发现存在二种RVA谱曲线图形,直链淀粉含量在3.1%～4.0%株系明显不同其它株系,也不同于常规糯稻;对RVA谱曲线图形相同、直链淀粉含量不同的株系进行分类比较,低直链淀粉含量株系的RVA谱曲线最终表现为曲线逐步上升,但没有超越第1个峰值。对不同直链淀粉含量株系类群的各RVA谱特征值进行显著性测定,3.1%～4.0%株系群有5个特征值与其它二个株系群存在极显著差异;11.0%～13.5%株系群有3个特征值与对照16.0%组存在极显著差异;直链淀粉含量与RVA谱各特征值之间优化数学模型显示：峰值时间和消减值与直链淀粉含量关系较为密切。【结论】导入反义蜡质基因,能导致直链淀粉含量降低;通过花药培养能快速获得纯合株系;直链淀粉含量差异不仅影响到各RVA谱特征值,而且还造成RVA谱曲线不同。 相似文献
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【目的】水稻 OsFAD2 编码脂肪酸脱饱和酶,调节油酸（C18∶1）向亚油酸（C18∶2）转化,该基因突变后可提高水稻的油酸含量。为了创制高油酸水稻突变体并助力稻米油发展,利用 CRISPR/Cas9 技术对OsFAD2 进行定点编辑。【方法】以日本晴（粳稻）愈伤组织为材料,利用含有 CRISPR/Cas9-FAD2-sgRNA 载体的农杆菌介导获得转基因植株,Sanger 测序与荧光定量 PCR 鉴定阳性植株,最后利用气相色谱质谱（GC-MS）检测稻米籽粒脂肪酸含量变化。【结果】靶点序列测序检测表明 , 有 3 株OsFAD2敲除植株在 T0代产生了碱基变异,但是仅有 1 株不存在脱靶现象。随后阳性植株种子被扩繁至 T1 代,使得 OsFAD2 突变序列纯和、稳定,荧光定量 PCR 检测表明 OsFAD2 表达量比野生型植株显著减少。利用 T1 代转基因植株进行种子脂肪酸组分检测表明,敲除 OsFAD2 导致籽粒油酸含量显著上升约 30%。【结论】利用 CRISPR/Cas9 技术对水稻 OsFAD2 编码区序列进行靶向敲除并获得了高油酸水稻突变体,为后续高油酸稻米育种提供种质资源。 相似文献
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用反义RNA技术创造高直链淀粉玉米材料 总被引：3，自引：0，他引：3
【目的】利用反义RNA技术调控玉米淀粉的生物合成过程,创造高直链淀粉玉米材料。【方法】克隆玉米淀粉分支酶(sbe2a)基因片段,以载体pWGLL为基础,构建高效反义表达载体,通过花粉管通道法将其导入玉米自交系铁7922中。【结果】获得了4株转基因株系,GFP表达检测、PCR扩增和Southern杂交结果表明,目的基因已整合到基因组中,且能够遗传。对4株转基因植株进行RT-PCR和淀粉分支酶活性检测,结果表明转反义sbe2a玉米淀粉分子酶基因的转录受到了明显抑制,淀粉分支酶活性明显低于野生型,相差最多的降低79.4%;直链淀粉含量也发生明显的变化,最高的提高了84.3%,且总淀粉含量与对照之间基本没有差异。【结论】采用反义RNA技术通过沉默内源sbe2a,可获得高直链淀粉含量的玉米材料。 相似文献
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【目的】利用TALEN技术定向突变水稻pms3的原始突变区域,创制不同类型osa-smR5864小RNA编码序列突变体,鉴定不同突变体的雄性育性光温反应变化规律,为基于定向编辑水稻PMS3基因的方法培育水稻两系不育系材料提供科学依据。【方法】构建基因编辑载体TALEN-PMS3,转化日本晴和明恢86,通过测序鉴定pms3突变体,利用福州夏季自然长日高温鉴定T2代pms3突变体的雄性育性及自交结实率。【结果】转化获得25个转基因T0代克隆,其中日本晴有4个克隆产生了突变,明恢86有5个克隆产生了突变,突变率分别为40.0%和33.3%。在T1代非转基因材料中,日本晴背景中有3种纯合突变类型,明恢86中有5种纯合突变类型。在福州夏季自然长日高温条件下,T2代pms3突变体能够产生正常可育的花粉,自交结实率正常,并未表现出类似培矮64S的光温敏雄性不育特征。【结论】本研究通过基因编辑获得的多种类型水稻pms3突变体并不能产生光温敏雄性核不育表型,说明了pms3位点调控水稻光温敏核不育性分子机制的复杂性。 相似文献
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《中国农业科学》2020,(8)
【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T_0代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7外显子处发生突变的有7株5种不同的突变方式,均为碱基或片段缺失。获得秀水134基因编辑的株系11株,在第2外显子处共有5株,均为单碱基插入;在第7外显子处有6株,均为片段缺失。48株T_1代秀水134基因编辑株系中,共获得16株无转基因标记的基因编辑株系,其中5株在第2外显子发生突变,11株在第7外显子处发生突变。4个T_2代基因编辑株系的米粉中2-AP平均含量分别为0.309、0.347、0.332和0.295μg·g~(-1),极显著(P0.01)高于非转基因对照(0.046μg·g~(-1))。【结论】利用CRISPR-Cas9技术可对水稻香味基因Badh2进行定向编辑,并且可获得无转基因成分的基因编辑株系,其香味性状得到明显改良。 相似文献
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为培育中等直链淀粉含量的水稻恢复系,以HC086为供体亲本(其Wx基因来自美国水稻品种Francis),以优良的水稻恢复系R898、R476、R838、R6547为受体亲本,利用PCR-Accl分子标记检测技术在回交世代进行辅助选择,将供体材料控制直链淀粉的Wx基因导入到不同恢复系中.对后代株系的基因型及其直链淀粉含量的分析结果表明,直链淀粉含量普遍有了显著提高,受体亲本的直链淀粉含量由10.6%～14.4%提高到了18.0%～21.4%.改良株系与广占63S和Y58S的配组实验表明,F1代杂交种的直链淀粉含量较原组合有显著提高,并达到适中直链淀粉含量水平,且主要农艺性状没有发生显著改变.说明分子标记辅助选择是改良水稻品种直链淀粉含量的快速有效的方法. 相似文献
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通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对粳稻品种‘嘉花1号’的谷蛋白基因GluA3(LOC_Os03 g31360)进行编辑获得转基因T0代植株,并对其衍生的T1代28个单株进行鉴定分析。结果表明:获得了两种类型的GluA3编辑突变植株;突变体的未成熟胚乳中GluA3 RNA表达水平明显下调;突变体谷蛋白含量呈下降趋势。对‘嘉花1号’野生型及突变体水稻农艺性状考查发现,突变体水稻穗数和产量下降明显。试验表明,CRISPR/Cas9技术可有效编辑水稻谷蛋白基因,可为水稻谷蛋白品质育种提供理论指导。 相似文献
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罗文龙 《湖南农业大学学报(自然科学版)》2013,39(6):597-603
Wx和fgr基因分别调控水稻直链淀粉含量和香气形成。在基于凝胶电泳功能标记的基础上，发展基于高分辨率熔解曲线(HRM)的功能标记Wx–a/b和BAD2–E7, 分别用于鉴定88份水稻种质Wx和fgr的基因型。利用LightScanner 96平台进行HRM检测，单次检测在10 min内即可完成最多96个样品的基因型分析。结果表明，88份水稻种质中，25份含纯合Wxa基因型的种质，直链淀粉含量为25.08%；59个含纯合Wxb基因型的种质，直链淀粉含量为15.00%，其余4个杂合型(Wxa/Wxb)的直链淀粉含量为18.13%。携带纯合fgr基因的3份种质(巴太香占、象牙香占和Basmati 370)，其全部米粒均带有香气，而携带杂合fgr的2份种质，只有部分米粒带有香气。 相似文献
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高油酸能够显著提升大豆食用油的稳定性和食用价值，是大豆品质改良的育种目标之一。为提高大豆籽粒油酸含量，本研究采用CRISPR/Cas9多基因编辑技术，同时敲除负调控大豆油酸含量的2个关键基因GmFAD2-1A和GmFAD2-1B。采用农杆菌介导的大豆子叶节转化方法获得20株T0代阳性苗，但发生基因编辑的株系只有11个，其中GmFAD2-1A发生突变的有7株，GmFAD2-1B发生突变的有10株，这2个基因同时发生突变的有6株。经过加代纯合后，检测转基因株系(T3代)大豆籽粒的脂肪酸组分，发现油酸含量显著提升，最高达81.38%,而亚油酸含量则显著降低，获得了高油酸新种质。本研究采取多基因敲除策略，成功突变大豆基因GmFAD2-1A和GmFAD2-1B,并获得高油酸大豆突变体株系，为高油酸大豆育种提供了新的种质资源。 相似文献
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【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T0代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7外显子处发生突变的有7株5种不同的突变方式,均为碱基或片段缺失。获得秀水134基因编辑的株系11株,在第2外显子处共有5株,均为单碱基插入;在第7外显子处有6株,均为片段缺失。48株T1代秀水134基因编辑株系中,共获得16株无转基因标记的基因编辑株系,其中5株在第2外显子发生突变,11株在第7外显子处发生突变。4个T2代基因编辑株系的米粉中2-AP平均含量分别为0.309、0.347、0.332和0.295 μg·g -1,极显著（P<0.01）高于非转基因对照（0.046 μg·g -1）。【结论】利用CRISPR-Cas9技术可对水稻香味基因Badh2进行定向编辑,并且可获得无转基因成分的基因编辑株系,其香味性状得到明显改良。 相似文献
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《浙江农业学报》2017,(5)
以现有水稻CRISPR/Cas9载体系统为起点,优化改造了相应的载体及其构建方法,实现了两步法构建基因敲除载体。利用新的载体和方法,针对水稻日本晴(Oryza sativa L.spp.Japonica cv.Nipponbare)D3基因的3个靶向位点分别构建了相应的CRISPR/Cas9载体,并通过农杆菌介导的遗传转化成功获得一系列转基因植株。T_0代转基因植株靶位点测序结果显示,靶位点DDRC1包括5种突变类型,植株的突变率为35.48%;靶位点DDRC2包括5种突变类型,植株的突变率为25.00%;靶位点DDRC3包括1种突变类型,植株的突变率为20.00%。利用T_1代纯合突变植株,进一步研究了所得纯合突变体的株高、分蘖数表型与CRISPR/Cas9编辑后基因型之间的关系,探讨了CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率、位置效应和突变类型等特点,为进一步利用CRISPR/Cas9系统发展具有不同农艺性状的水稻种质材料提供了参考。 相似文献
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稻米抗性淀粉含量及其环境稳定性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】食用高抗性淀粉含量稻米虽利于提高慢性病人群的健康水平,但培育出的高抗性淀粉含量水稻品种还较少。开展水稻种质资源抗性淀粉含量及其环境稳定性的研究,为高抗性淀粉含量水稻种质资源发掘和生产应用提供参考依据。【方法】参照爱尔兰Megazyme公司提供的方法测定稻米抗性淀粉含量,用PAST软件完成种质含量分布作图。通过一年多点试验评价抗性淀粉含量的环境稳定性,利用DPS软件完成含量方差分析。依据国家标准GB/T15683-2008分析了稻米直链淀粉含量。【结果】对1 206份水稻种质稻米抗性淀粉含量分析,结果表明,绝大部分水稻种质稻米抗性淀粉含量低,含量低于2.5%的占87.6%,高于10%的仅占约0.2%。稻米抗性淀粉和直链淀粉含量存在显著正相关,但在高直链淀粉含量种质中未出现抗性淀粉含量高的品系,却在低直链淀粉含量种质中发现3份抗性淀粉含量高于10%的品系,其中1个优质软米品种Diangu2的抗性淀粉和直链淀粉含量分别为10.12%和12.3%,综合农艺性状优良,米饭食味性好。在3个不同环境种植18个不同抗性淀粉含量的品系,结果显示有13个品系的含量不受种植环境差异的影响,另5个品系的含量受环境影响,稻米的抗性淀粉含量除了受基因型影响外,还受种植环境、以及基因型与环境互作的影响。【结论】水稻种质资源稻米抗性淀粉含量普遍很低,抗性淀粉含量与直链淀粉含量虽存在显著正相关,但低直链淀粉含量种质中也可能存在高抗性淀粉的品种,所以培育稻米抗性淀粉含量高且食口性好的品种是可能的。稻米抗性淀粉含量主要受基因型控制,在不同环境中含量高的品种依然高,含量低的品种仍然低,那么高含量的品种可在其适种稻区种植生产大米,其含量不会被明显影响。 相似文献
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【目的】香味是作物的重要食味品质之一。2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline,2-AP）是主要香味物。BADH2是控制水稻等作物香味性状的关键基因,敲除该基因可以产生香味稻米。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在北京市农林科学院自育的玉米骨干亲本京724上敲除BADH2同源基因,以期获得有香米味道的玉米新种质材料。【方法】利用Ensembl数据库在线BLAST工具,将水稻OsBADH2蛋白序列在拟南芥、水稻和玉米蛋白序列数据库中进行序列比对,获得上述3个物种的BADH基因家族成员,并利用UniProt蛋白数据库中的结构域信息进行验证。进一步使用MEGA软件进行系统进化分析,获得玉米BADH2同源基因作为候选编辑靶标。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理,在候选基因的外显子处设计特异性靶点,并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体。再以玉米自交系京724为受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,通过磷酸甘露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase,PMI）抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在靶基因中产生的突变类型。利用气相色谱质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）检测基因编辑株系T1籽粒中香米主要香味物质2-AP的含量,以确认京724在基因编辑前后2-AP含量的变化。【结果】系统进化分析发现,玉米中存在2个BADH2同源基因,分别命名为ZmBADH2-1和ZmBADH2-2。ZmBADH2-1位于第4染色体,ZmBADH2-2位于第1染色体。2个基因均包含15个外显子和14个内含子,第4外显子间的核苷酸序列高度同源。在2个基因的第4外显子区域设计靶点并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过遗传转化获得28株转基因株系。PCR扩增及测序分析结果显示,其中10株材料的2个ZmBADH2s在靶点区域均发生突变,突变基因型包括双等位突变和多等位突变,突变类型为不同数量的碱基缺失和插入。质谱检测结果显示玉米ZmBADH2双基因突变体籽粒中存在与香稻同样成分的2-AP。随机选取的4个T1代基因编辑株系籽粒中,2-AP平均含量分别为438.29、404.63、348.65和161.82 μg·kg-1,而未经过编辑的京724中未检测到2-AP。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对玉米ZmBADH2-1和ZmBADH2-2同时进行定点敲除,创制出籽粒中具有香米味道的玉米骨干亲本新种质材料。 相似文献