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对比分析在不同细胞部位表达猪细小病毒（PPV）主要免疫保护性抗原VP2蛋白的重组干酪乳杆菌系统作为口服疫苗的免疫效果。将构建的细胞表面表达和分泌表达猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌分别经口免疫BALB／c小鼠，免疫分3次进行，时间间隔为2周，每次连续接种3d，每只小鼠每次接种100μL10^10CFU／mL的菌量，对照组小鼠接种相同剂量的PBS。初免后不同时间收集免疫小鼠粪便及肠黏液样本测定小鼠产生抗PPV的特异性sIgA抗体水平，采集小鼠血液样本测定其血清中抗PPV的特异性IgG抗体水平。间接ELISA检测结果表明，两种表达系统均能诱导小鼠产生黏膜及系统免疫应答，分泌型的重组菌系统免疫小鼠诱导机体产生的抗PPV的特异性sIgA和IgG抗体水平高于细胞表面表达型的重组菌系统的免疫效果，表明分泌型的重组乳酸菌作为活菌疫苗具有更好的免疫性。 相似文献
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为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白复制型重组人腺病毒4型(HAdV-4)及评价其免疫原性,本研究利用RT-PCR扩增得到PEDV中国变异株纤突(S)基因的N-末端区域(1 bp~1 140 bp),构建重组质粒p Ad4FAST-Shuttle-S,重组质粒经线性化和同源重组,得到含有PEDV S基因的重组HAdV-4感染性克隆,纯化的感染性克隆DNA经PacⅠ线性化后转染HEK293细胞,拯救得到表达PEDV变异株S蛋白的重组病毒rAd4△E3-S。将该重组病毒免疫小鼠,间接ELISA测定其血清中抗S蛋白抗体水平,利用体外淋巴细胞转化试验和流式细胞技术检测免疫小鼠T淋巴细胞反应。结果显示,重组病毒能够表达PEDV S蛋白,并且能刺激小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答。本实验结果为进一步研究重组病毒在猪体上的免疫反应奠定基础,也为PEDV活载体疫苗的研发提供实验依据。 相似文献
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TGEV和PEDV融合S蛋白在乳酸乳球菌食品级细胞内高效诱导表达与免疫原性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究以乳酸乳球菌食品级细胞内高效诱导表达载体pRNA48为基础,构建了含猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)融合S基因的表达质粒pRNA48-TPs和重组菌L.lactis NZ9000/pRNA48-TPs。SDS-PAGE分析nisin诱导后重组菌表达的细胞内目的蛋白,然后分别对兔子进行注射免疫和口服免疫,并用Western Blot进行免疫原性分析,结果表明,重组菌细胞内表达的TPs融合蛋白具有较好的免疫原性,注射免疫产生的抗体能特异性识别胞内TPs融合蛋白,同时发现口服免疫也能产生特异的抗体血清,初步证明重组蛋白具有黏膜免疫原性。 相似文献
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猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可以通过呼吸道感染在猪群中传播,提示呼吸道粘膜也许可以作为疫苗免疫接种的位点。PEDV通过表面的纤突蛋白S识别受体并侵入宿主细胞,该蛋白质S1区(1~735 aa)是PEDV主要的中和位点以及受体结合域,参与病毒吸附入侵宿主细胞。利用家蚕核型多角体病毒在BmN细胞中表达融合蛋白S1-eGFP并展示于病毒表面,Western blot鉴定融合蛋白分子质量约为150 kD。以重组杆状病毒为免疫原雾化免疫BALB/c小鼠,结果表明免疫16 d后小鼠血清中S1特异性IgG抗体效价可达1∶3 200,血清和肺气管润洗液中都能检测到高水平的S1特异性sIgA,说明引起了较强的黏膜免疫反应;脾淋巴细胞增殖结果进一步表明重组杆状病毒雾化免疫可以有效地诱导小鼠产生细胞免疫。研究结果初步表明,表面展示S1的重组杆状病毒可以作为PEDV黏膜免疫候选疫苗,具有进一步开发研究的价值。 相似文献
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【目的】构建新型猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)乳酸菌活菌疫苗载体。【方法】应用DNA重组技术将嗜酸乳杆菌S-层蛋白(SLP)基因及PEDV S2基因B细胞表位(EpitopeS2)融合基因(SLP-EpitopeS2)克隆到乳酸杆菌表达载体pTRK892中,构建重组载体pTRK-SLP-EpitopeS2,通过电转化方法将重组质粒导入副干酪乳杆菌中,获得重组副干酪乳杆菌。分别用SDS-PAGE、Western blotting和免疫荧光试验(IFA)鉴定目的蛋白在副干酪乳杆菌中的表达。【结果】PCR结果显示,成功扩增出大小为1 400 bp的目的条带,与插入融合基因大小一致,双酶切结果出现大小分别为1 400和4 700 bp的2条带,基因测序结果显示无碱基缺失和突变等,从而确定重组质粒pTRK-SLP-EpitopeS2构建正确。SDS-PAGE、Western blotting结果显示,在48 ku处出现与理论值大小一致的目的蛋白条带,表明融合基因SLP-EpitopeS2在副干酪乳杆菌中得到有效表达。IFA结果显示,与对照组副干酪乳杆菌相比,重组副干酪乳杆菌均能被激发出特异性绿色荧光信号,与高浓度氯化锂(LiCl)洗脱下来的菌体膜蛋白样品补充鉴定试验结果相吻合。表明融合蛋白SLP-EpitopeS2可能在副干酪乳杆菌的菌体表面表达。【结论】成功构建了PEDV EpitopeS2及嗜酸乳杆菌SLP嵌入型融合表达载体pTRK-SLP-EpitopeS2,为乳杆菌活菌载体疫苗相关研究奠定了基础。 相似文献
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猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)纤突蛋白S1能够介导宿主抵御PEDV感染的中和抗体的产生,是PEDV基因工程疫苗研究的重要靶抗原。将PEDV的S1基因克隆至杆状病毒基因组中,构建包含PEDV S1基因的重组杆状病毒,使S1蛋白表面展示表达。以该重组病毒作为活载体疫苗皮下接种BALB/c小鼠,验证S1蛋白在重组杆状病毒中的表达及其免疫原性。Western blotting分析被重组杆状病毒感染的Sf9细胞中,PEDV S1蛋白能有效表达且呈现大小分别约120 k D和150 k D的2条带,其中前者至少比预期大30 k D左右,推测重组S1蛋白在Sf9细胞中被高度糖基化修饰。重组杆状病毒的胶体金免疫电子显微镜观测结果显示S1蛋白展示于杆状病毒表面;间接ELISA试验结果证明重组杆状病毒可以诱导产生PEDV特异性抗体,抗体效价达到1∶5 000。血清中和试验及淋巴细胞增殖试验结果证明,该重组杆状病毒能够激发有效的体液免疫及细胞免疫反应,S1蛋白在重组杆状病毒表面展示表达并具有免疫原性。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2017,(12)
为获得产肠毒素大肠杆菌(ETEC)抗原STa突变体(mSTa)、LTb和STb融合蛋白在乳酸菌表达系统中组成型分泌表达,本研究将mSTa、LTb、STb三价抗原融合基因,克隆于p23启动子-USP45分泌信号肽之后,插入到乳酸乳球菌表达载体pTX8048中,构建了重组表达载体pTX-sls,将其电转化到宿主菌乳酸乳球菌L.lactisNZ9000中进行表达,应用westernblot、ELISA方法鉴定蛋白表达情况。将重组乳酸乳球菌pTX-sls/NZ9000口服免疫BALB/c小鼠,分别测定了免疫后不同时间血清中特异性IgG、粪便中特异性的sIgA水平以及血清的中和活性;采用MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况,流式细胞术检测Th细胞免疫类型。结果显示,目的蛋白mSTa-LTB-STb以分泌形式组成型表达,可被阳性血清所识别。在免疫小鼠血清和粪便中均可检测到特异性IgG、sIgA,血清抗体具有一定的中和毒素作用。结果表明,该重组乳酸乳球菌具有作为口服疫苗的潜在应用价值,本研究为研制ETEC乳酸菌活载体口服疫苗奠定了基础。 相似文献
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将SPF级Balb/c小鼠随机分为免疫组和对照组,免疫组小鼠以pLA-F41/L.casei重组干酪乳杆菌滴鼻免疫,对照组用pLA/L.casei干酪乳杆菌滴鼻免疫,应用间接ELISA测定血清中特异性IgG抗体水平和鼻咽部冲洗液、肠道冲洗液、阴道冲洗液及粪便中ETEC F41特异性SIgA抗体水平.分离并计数NALT、NC及PP、IEL淋巴细胞数目,利用免疫细胞化学法检测CD4+、CD8+T细胞亚群水平,观察重组干酪乳杆菌滴鼻免疫小鼠诱导的鼻相关淋巴组织(NALT)和肠相关淋巴组织(GALT)黏膜部位的免疫应答.结果表明重组干酪乳杆菌滴鼻免疫小鼠可有效诱导NALT和GALT黏膜部位免疫应答. 相似文献
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表达猪流行性腹泻病毒S基因片段重组腺病毒的构建与免疫特性 总被引：1，自引：0，他引：1
利用RT-PCR、同源重组等技术构建了含有猪流行性腹泻病毒(PEDV)S基因上3个片段的重组腺病毒质粒pAd-S98～638,pAd-S1～638,pAd-S49838～1384,经PacI酶切后转染HEK-293A细胞,3次噬宽纯化分别获得了重组腺病毒rAd-s498～638,rAd-S1～638,rAd-S498～1384.重组腺病毒于HEK-293A细胞连续传代至20代效价稳定,TCID50分别为每毫升10-6.29、10-5.75、10-6.5.应用猪流行性腹泻病毒阳性血清进行间接免疫荧光抗体试验,在3个腺病毒感染的HEK-293A细胞的胞质见有清晰荧光.将3个重组腺病毒分别免疫小鼠,结果均诱导产生较强的体液免疫应答.结果表明这3个重组腺病毒对S基因的3个片段均可成功表达,并具有较好的免疫原性,为PEDV重组腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础. 相似文献